《维罗尔杂志》。2003年10月；77(20): 10889–10899.
从单个病毒载体基因组表达的功能性人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）Gag-Pol或HIV-1 Gag-Pol和Env
,1中，2 ,1中，三 ,4 ,1中，2 ,1中，2和1中，2,*
詹姆斯·麦盖蒂根
生物化学与分子药理学系，1医学部，三宾夕法尼亚州费城托马斯·杰斐逊大学杰斐逊医学院人类病毒学和生物防御中心，19107年，2乔治华盛顿大学医学中心，华盛顿特区，200374
克里斯汀·纳珀
生物化学与分子药理学系，1医学部，三宾夕法尼亚州费城托马斯·杰斐逊大学杰斐逊医学院人类病毒学和生物防御中心，19107年，2乔治华盛顿大学医学中心，华盛顿特区，200374
简·奥伦斯坦
生物化学和分子药理学系，1医学部，三宾夕法尼亚州费城托马斯·杰斐逊大学杰斐逊医学院人类病毒学和生物防御中心，19107年，2乔治华盛顿大学医学中心，华盛顿特区，200374
马丁·科瑟
生物化学与分子药理学系，1医学部，三宾夕法尼亚州费城托马斯·杰斐逊大学杰斐逊医学院人类病毒学和生物防御中心，19107年，2乔治华盛顿大学医学中心，华盛顿特区，200374
菲利普·麦肯纳
生物化学与分子药理学系，1医学部，三宾夕法尼亚州费城托马斯·杰斐逊大学杰斐逊医学院人类病毒学和生物防御中心，19107年，2乔治华盛顿大学医学中心，华盛顿特区，200374
马蒂亚斯·施奈尔
生物化学与分子药理学系，1医学部，三宾夕法尼亚州费城托马斯·杰斐逊大学杰斐逊医学院人类病毒学和生物防御中心，19107年，2乔治华盛顿大学医学中心，华盛顿特区，200374
生物化学与分子药理学系，1医学部，三宾夕法尼亚州费城托马斯·杰斐逊大学杰斐逊医学院人类病毒学和生物防御中心，19107年，2乔治华盛顿大学医学中心，华盛顿特区，200374
2003年5月12日收到；2003年7月15日接受。
摘要
重组狂犬病病毒（RV）疫苗株基载体已成功开发成针对其他病毒疾病的疫苗（J.P.McGettigan等人，J.Virol.75:4430-4434，2001；McGettig等人，J.V rol.75:8724-87322001；C.A.Siler等人，病毒学292:24-342002），最近，安全问题得到了解决（McGettigan等人，J.Virol.77:237-2442003）。然而，载体的大小限制可能会限制其用于开发需要表达大型和多种外来抗原的疫苗应用。在这里，我们描述了一种新的基于RV的疫苗载体，表达4.4 kb的人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）Gag-Pol前体Pr160。我们的结果表明，Pr160被表达和加工，如免疫染色和Western blotting所示。电子显微镜研究显示未成熟和成熟的HIV-1病毒样颗粒（VLP），表明表达的HIV-1Gag Pr55前体被HIV-1蛋白酶正确处理。功能分析也证实了来自改良RV基因组的HIV-1逆转录酶（RT）的切割和功能表达。在下一步中，我们构建并恢复了一种表达嵌合HIV-1的新型RV疫苗株基载体89.6便士除HIV-1 Pr160外，来自位于RV核蛋白（N）和磷酸蛋白（P）之间的额外RV转录单元的RV包膜蛋白。2.2-kb嵌合HIV-1/RV包膜蛋白由融合到RV糖蛋白（G）细胞质域（CD）的HIV-1 Env胞外域（ED）和跨膜域（TD）组成，这是将HIV-1 Env有效并入RV颗粒所必需的。值得注意的是，HIV-1 Env和HIV-1 Pr160的表达导致弹状病毒基因组增加了55%以上。如RT活性和基于Env的融合分析所示，两种表达的弹状病毒HIV-1前体蛋白都是功能性的。这些发现表明，基于RV的载体可以有效表达多个和非常大的外源基因。这项研究为进一步改进基于杆状病毒的HIV-1疫苗及其用于表达可能来自多种人类病原体的大型外源蛋白开辟了可能性。
表达人类病原体蛋白质的病毒载体作为对抗其他传染病的疫苗载体显示出巨大的前景。截至今日，人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）是大多数疫苗载体的主要靶点，关于其使用的大量信息可用（有关综述，请参阅参考文献2,30,33,39，以及46). 这些结果表明，每种病毒载体都有其独特的特征，其中一些特征表明病毒载体在人类中用作疫苗载体。一般来说，研究表明，病毒载体不应被人类因自然感染病毒载体或接种所用病毒疫苗而产生的预先存在的免疫反应所阻断。此外，载体应能够诱导针对表达抗原的体液和细胞反应。其他重要的要求是低载体诱导的致病性、大的外源抗原克隆能力以及重组疫苗载体中相应外源基因的高稳定性。
狂犬病病毒（RV）是家族中的一种非片段化负链RNA病毒鼠疫病毒科(54). RV基因组大小约为12 kb，编码五种单顺反子RNA，编码核衣壳蛋白（N）、磷酸蛋白（P）、基质蛋白（M）、单跨膜蛋白G和病毒聚合酶（L）(11). N蛋白包裹病毒RNA，病毒RNA是由P和L蛋白组成的病毒聚合酶复合物复制和转录的模板(52,53). RV M蛋白在宿主细胞衍生病毒膜中连接RNP和RV G蛋白的细胞质域（CD）(35). RV G蛋白介导宿主细胞感染(14).
早先已经证明了利用RV或水泡性口炎病毒（VSV）等杆状病毒作为氯霉素乙酰转移酶（CAT）模型基因表达载体的可能性，这些研究结果表明外源基因可以稳定表达(34). 在下一步中，研究了将RV用作HIV-1疫苗的可能性，一些研究表明，在小动物模型中表达HIV-1 Env或Gag可产生针对HIV-1的有效免疫反应(30,32,47).
如上所述，安全性是使用每种活病毒载体的主要关注点。然而，考虑到以猴免疫缺陷病毒（SIV）为基础的减毒载体具有良好的效果，复制缺陷载体并不能像复制活性载体那样诱导有效的反应(13)可能需要复制能力强的疫苗载体。对于VSV，一份报告表明，VSV G蛋白CD的缺失可以降低小鼠的致病性，而全长G蛋白载体在鼻内接种后可在小鼠中诱发暂时性疾病，如体重减轻10%至20%(40). 然而，肌肉内接种基于VSV的HIV-1疫苗载体并不会在小鼠或恒河猴中引起任何与载体相关的疾病(40-42). 尽管RV载体在外周接种后非常安全，但我们最近描述了几种表达HIV-1 Gag的新型、高度减毒的第二代RV疫苗载体。我们的结果表明，通过将RV糖蛋白（G）中333位（R333）的精氨酸与谷氨酸（E333）交换或删除RV G CD，表达HIV-1 Gag的载体在小鼠中完全安全，并且在颅内感染后无反应。值得注意的是，这些表达HIV-1Gag的高度减毒RV在诱导针对HIV-1Gag的细胞反应方面仍然与野生型RV载体一样有效(31).
基于RV的载体满足了成功HIV-1载体的大多数基本要求，但尺寸限制一直是一个问题，即使RV载体表达了高达2.5 kb的基因(37,47). 一般来说，DNA病毒具有最大的克隆能力，能够从一个载体中表达两个基因，而阳性标记的RNA病毒在外源基因的大小方面似乎受到很大限制（有关综述，请参阅参考文献46). 对于杆状病毒，表达HIV-1 Gag和Env蛋白的VSV能够表达高达4.0kb的外源序列(1). 我们的实验室之前已经证明，这两个基因都可以从基于RV的疫苗载体中单独表达(32,47). 最近的研究发现，接种了实验性HIV-1疫苗的恒河猴并没有像以前认为的那样受到保护，但在SIV攻击后2至3年内由于Gag基因突变而死亡，这表明可能需要多个HIV-1基因，体液反应可能是可取的(6,7). 因此，从单个RV载体表达大量HIV-1蛋白可能是有利的。在这里，我们报告了来自RV疫苗载体的4.4-kb HIV-1 Pr160蛋白的表达。免疫染色、Western blotting和电镜（EM）显示，Pr160以类HIV-1病毒的方式处理，显示成熟和不成熟的类HIV-1病毒颗粒。此外，我们能够从单个病毒基因组中创建表达功能性HIV-1 Pr160和Env的重组RV。这些发现表明，基于RV的疫苗载体可以在外源序列中编码其基因组大小的50%以上。此外，这些基因从两个不同的转录单位表达，这进一步强调了它们作为有效抗病毒疫苗的潜在用途。
材料和方法
质粒构建。
编码重组RV疫苗载体pSPBN-333、pSPBN-3 33-Gag和pBNSP的质粒如前所述(31). 为了创建一种表达HIV-1 Pr160的新RV疫苗载体，使用Vent聚合酶（Biolabs，Inc.）和引物RP40（5′-AAACTCGAGCGACACAGAGACACAATGGGGTAGAGCGGTCA-3′）从pNL4-3（AIDS研究和参考试剂程序[ARRRP]）扩增编码Gag-Pol前体蛋白的基因和RP184（5′-AAAGTCTAGCTTAATCCTCATCCGTCTAC-3′）。PCR产物用Bsi公司威斯康星州-Nhe公司我和之前的Bsi公司无线-Nhe公司I消化质粒pSPBN-333。该质粒命名为pSPBN-Pr160。构建表达HIV-1的重组RV载体BNSP89.6便士包含HIV-1外结构域（ED）和跨膜结构域（TMD）的环境89.6便士Env与RV G细胞质结构域（CD）、HIV-1的ED和TMD融合89.6便士用Vent聚合酶和引物RP27（5′-GGGCTGCAGCTCGAGAGAAAATAGAGAGAGAAGAGAGAGGCAGG-3′）和RP32（5′-GCCCCGTTAACTATAGAGAGCAAAAAAAAA-3′）从pKB9SHIV（89.6P）（ARRRP）中扩增出Env。PCR产物用Bsi公司威斯康星州-血红蛋白I并克隆到pBS2H-NL4-3-G(18). 所得质粒命名为pBS289.6P-RVG。为了将嵌合HIV-1/RV G Env基因导入BNSP载体，用Bsi公司威斯康星州-Xba公司一、 凝胶洗脱2.2kb片段并克隆到之前的Bsi公司威斯康星州-Nhe公司I-消化质粒pBNSP。该质粒命名为pBNSP-89.6P-RVG。创建同时表达HIV-1的RV89.6便士和HIV-1NL4-3型Pr160、pBNSP-89.6P-RVG和pSPBN-Pr160用不是我-百万分之一一、 将含Env的片段克隆到含Pr160的主干。该质粒命名为p89.6-P-RVG-Pr160。
为了用人巨细胞病毒（CMV）启动子、T7 RNA聚合酶启动子和RV抗原组3′端的锤头状核酶构建p89.6P-RVG-Pr160，采用PCR策略创建新的RV载体（cSPBN）。首先，使用Vent聚合酶和引物RP202（5′-AAAGCTAGCCAGCTTTGGG-3′）和RP203（5’-TTTTCTGCAGCGCGTGACATTATTATTATTGAC-3′）从pcDNA3.1（+）中扩增出包含CMV T7启动子的～700-bp DNA片段。用pSPBN和引物RP204（5′-TTTCTAGATTAAGCGTGTGGAGAGTCCGTGAGGAGAAACCCGGCGTACCGGTGACGGTCACGGTCACCGCTTAACACCAGAGAGAGACAGAGAGATG-3′）和RP76（5′-CGGAGCTTTCTCTCTCTGTGTGAGAGAGEGAGAGAGA-3′）扩增出一段约400-bp长的DNA片段，该片段包含HH核酶、RV抗原组的3′端和部分N基因。第一个PCR产物用Nhe公司一、 第二个PCR片段用Xba公司一、 结扎片段，从凝胶中洗脱1.1kb片段。该片段用引物RP203和RP76扩增，凝胶纯化，并用平均二-精神分裂症我和之前的平均二-精神分裂症I消化的pSPBN。该质粒命名为cSPBN。为了将新的启动子和HH核酶引入p89.6-P-RVG-Pr160中，用Nco公司我-百万分之一一、 将4.9 kb的DNA片段克隆到之前的Nco公司我-百万分之一I-消化质粒p89.6-P-RVG-Pr160。所得质粒命名为c89.6-P-RVG-Pr160。
重组病毒的产生。
对于重组RV的回收实验，使用了之前描述的RV回收系统(16,47). 简单地说，BSR-T7细胞(9)将稳定表达T7 RNA聚合酶的5μg全长RV cDNA以及编码RV N、P、L和g蛋白的质粒通过Ca2人事军官4转染试剂盒（Stratagene），按照供应商的指示。转染后三天，将上清液转移到新鲜的BSR细胞上，3天后通过异硫氰酸荧光素（FITC）对RV-N蛋白进行免疫染色检测感染性RV（Centacor，Inc.）。
RV病毒的蔗糖纯化。
BSR电池（107)在T150烧瓶中，以1倍感染率（MOI）感染SPBN-333、SPBN-333-Gag或SPBN-Pr160，持续60小时；上清液在台式离心机（Eppendorf，Inc.）中以14000 rpm的速度预干燥3 min，并在SW28转子（Beckman，Inc.）内以25000 rpm的转速在20%蔗糖上旋转1 h。将病毒颗粒重新悬浮在100μl的裂解缓冲液中（50 mM Tris[pH7.4]、150 mM NaCl、1%NP-40、0.1%十二烷基硫酸钠[SDS]，1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒；西格玛）。
蛋白质印迹（i）病毒。
通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）（10%聚丙烯酰胺）分离裂解病毒的蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF-Plus；Osmonics，Minnetonka，Minn.）。将印迹封闭1 h（5%奶粉置于磷酸盐缓冲盐水中，pH 7.4），用Western blot洗涤液（WBWS；0.1%PBS-Tween 20）洗涤三次，并用人抗HIV-1 p24抗体（1:500）、兔抗HIV-1RT抗体（1:4000）或多克隆兔抗RNP抗体（1:2000）孵育在4°C下过夜(17). 然后用WBWS将印迹清洗三次。加入二级Alexa Fluor 546山羊抗人免疫球蛋白G（IgG）（1:500）或Alexa Fluor 532山羊抗兔IgG（1:1000）（Molecular Probes，Inc.），并将印迹在室温下孵育2小时。用WBWS洗涤印迹三次，用PBS洗涤一次（pH 7.4）。按照供应商（Bio-Read）的指示，使用QuantityOne的分子成像仪FX（Bio-Rad）进行荧光分析。
（ii）细胞裂解物。
用SPBN-333、SPBN-333-Gag、SPBN-Pr160或89.6P-RVG-Pr160以5的MOI感染BSR细胞48 h，并将其重新悬浮在0.5 ml冰上溶解缓冲液中5 min。将悬浮液转移到微型离心管中，并以14000 rpm旋转3 min以清除细胞碎片。用SDS-PAGE（10%聚丙烯酰胺）分离蛋白质并转移至PVDF-Plus膜（Osmonics）。在室温下，用5%奶粉在PBS（pH 7.4）中封闭膜1小时，然后用针对HIV-1 gp120（1:1000）（ARRRP）的多克隆羊抗体或针对p24（1:1000。在用WBWS清洗三次10分钟后，用辣根过氧化物酶（HRP）结合的驴抗羊抗体（1:5000）或HRP结合的山羊抗人抗体（1:10000）（Jackson ImmunoResearch Laboratories）检测印迹1小时。在用WBWS清洗三次10分钟和用PBS清洗一次（pH 7.4）后，按照制造商（NEN）的指示进行化学发光。
HIV-1 p24抗原捕获ELISA。
在MOI为5时感染HeLa或BSR细胞，48小时后收集上清液，并将细胞重新悬浮在赖氨酸缓冲液中（PBS中的Triton X-100和2-氯乙酰胺）。将上清液和细胞悬液转移到微型离心管中，并以14000 rpm旋转2 min以去除细胞碎片。按照制造商（ZeptoMetrix，Inc.）的说明，使用p24抗原酶联免疫吸附试验（ELISA）对细胞上清液及裂解液中的Gag p24蛋白进行定量。
多周期增长和一步增长曲线。
将BSR细胞（BHK-21克隆）置于60-mm直径的培养皿中，16 h后在0.01（多周期生长）或5（一步生长）的MOI下感染SPBN-333、SPBN-333-Gag、SPBN-Pr160或89.6P-RVG-Pr160。在37°C下孵育1小时后，去除接种物，并用PBS洗涤细胞四次，以去除任何未被吸收的病毒。重新加入三毫升完整培养基，并在感染后的指定时间点去除100μl组织培养上清液。在BSR细胞上重复测定病毒等分样品的滴定度。
他们。
用SPBN-Pr160感染人HeLa细胞48小时。细胞在室温下固定在中性缓冲的2.5%戊二醛中，并凝胶成温琼脂。它们在1%OsO中进行了后期修复4在梯度乙醇和环氧丙烷中脱水，并嵌入Spurr环氧树脂中。薄片被切割并用乙酸铀和柠檬酸铅染色，并在60 kV下用LEO EM10电子显微镜检查。
RT分析。
在MOI为5时，用SPBN-333-Gag、SPBN-Pr160或89.6P-RVG-Pr160感染BSR或HeLa细胞。在指定的时间点采集上清液，并按照制造商的指示进行分析（瑞典Innovagen AB；info@innovagen.se).
脾淋巴细胞四聚体分析。
6至8周龄雌性BALB/c小鼠组肌肉接种10只6表达HIV-1 Gag和Pol（SPBN-Pr160）或Gag、Pol和Env（89.6PRVG-Pr160）的重组RV的FFU。免疫六周后，用表达HIV-1的痘苗病毒攻击小鼠堵住（第1287页）。五天后，取出脾脏，制备单细胞悬液，用ACK裂解缓冲液裂解红细胞。总计3×106细胞在荧光激活细胞分选器（FACS）缓冲液（添加2%胎牛血清的PBS）中洗涤两次，并与大鼠抗鼠CD16/CD32（1μg/10）孵育6细胞；Fc区块；Pharmingen）和33μg/ml未结合链霉亲和素（分子探针）在冰上放置1小时。用FACS缓冲液清洗细胞两次，并用2μl四聚体（H-2K）培养细胞d日/AMQMLKETI）从HIV-1 Gag p24蛋白和2-μg/ml FITC-偶联大鼠抗鼠CD8抗体（Caltag）中提取30分钟，在室温下偶尔搅拌。细胞用FACS缓冲液清洗三次，再悬浮在含有2%多聚甲醛的300μl PBS中，并通过FACScan（Beckman Coulter XL分析仪，带有488 nm氩离子激光器。荧光在488 nm处激发，并通过标准荧光素光学器件进行分析。FITC和藻红蛋白荧光分别通过525和575带通滤波器收集。）。
结果
表达HIV-1 Gag-Pol前体Pr160的重组RV的构建。
我们以前的研究表明，外源蛋白如HIV-1 Env；HIV-1 Gag；或丙型肝炎病毒E1、E2和核心蛋白通过基于RV的疫苗载体稳定表达，并能在接种小鼠中诱导强烈的免疫反应(29,32,51). 然而，在这些先前的研究中，表达的抗原的大小是有限的，可能需要表达更大的蛋白质来保护自己免受某些传染病的侵袭。就HIV-1而言，来自恒河猴模型系统的最新研究结果表明，SIV-Gag的表达不足以保护动物免受SIV-Gag-定向细胞毒T淋巴细胞（CTL）逃逸突变导致的猴-人类免疫缺陷病毒（SHIV）攻击(6,7). 除了HIV-1 Gag外，在长期非进展患者中发现了对HIV-1 Pol的强烈CTL反应，建议至少部分用于预防艾滋病。HIV-1 Pol前体蛋白通过Gag-Pol基因阅读框的移码来表达，并且HIV Gag-Pol和Gag产品的合成比例为～1:20(55). 为了获得HIV-1 Pr160的表达，将编码HIV-1 Sr160的序列克隆到RV载体SPBN-333中RV G和L基因之间（图。)通过利用单一Bsi公司WI和Nhe公司I限制站点。所得质粒命名为pSPBN-Pr160。将pSPBN-Pr160与编码RV N、P、G和L蛋白的质粒共转染到稳定表达T7 RNA聚合酶的BSR细胞（BHK克隆）中(9)通过标准方法(32)24孔转染细胞中有2孔检测到感染性SPBN-Pr160。
表达HIV-1 Gag、Gag-Pol或Env和Gag-Pol的不同重组疫苗载体的构建。图的顶部显示了用于HIV-1 Gag克隆的RV疫苗株基载体SPBN-333NL4-3型（SPBN-333-Gag）和HIV-1 GagPolNL4-3型G和L蛋白之间的（SPBN-Pr160）序列。BNSP包含一个额外的转录停止/启动信号，在N和P基因之间有两个独特的限制位点，其中插入了来自SHIV89.6PG的HIV-1包膜蛋白（BNSP-89.6PG）。为了并入病毒粒子，HIV-1包膜细胞质域的序列被RV的细胞质域取代（BNSP-89.6PG；黑盒）。SPBN-Pr160是插入SHIV-89.6PG包膜的靶点，产生表达HIV-1 Env、Gag和Pol蛋白的重组RV（SPBN-89.6PG-Pr160）。所有构建物都包含从精氨酸（R）到谷氨酸（E）的氨基酸交换，位于RV糖蛋白的333位，之前已经证明，在小鼠颅内接种后，这种交换可以减弱RV载体。
重组RV表达HIV-1 Gag-Pol前体。
在分析重组RV是否表达HIV-1 Pr160的第一步中，用SPBN-333-Gag或SPBN-Pr160以0.1的MOI感染BSR细胞48小时，固定并用针对HIV-1 Gag p24或RV N的抗体进行免疫染色。结果表明，两个RV都表达HIV-1Gag（数据未显示）。为了确定重组RV SPBN-Pr160是否也表达HIV-1 Pol，我们用SPBN-333、SPBN-333-Gag或SPBN-Pr 160（MOI为5）感染BSR细胞。60小时后，从感染细胞中提取上清液，去除细胞和细胞碎片，并用20%的蔗糖纯化病毒。用SDS-PAGE分离病毒蛋白，转移到PVDF-Plus膜上，用针对HIV-1 Gag p24、HIV-1 RT或RV RNP的抗体进行Western blotting分析，如使用针对RV N的兔血清检测RV N所示（图。). 此外，SPBN-333-Gag-和SPBN-Pr160感染细胞均产生未成熟的HIV-1 VLP，如用HIV-1 p24特异性抗体检测全长HIV-1 Gag p55所示（图。). 此外，从SPBN-Pr160感染细胞中检测到HIV-1衣壳蛋白p24，表明该细胞培养上清液中存在成熟的HIV-1 VLP。因为HIV-1 p55只被HIV-1蛋白酶裂解(55)Gag-Pol前体蛋白中编码的功能性HIV-1蛋白酶很可能表达（图。，车道3）。正如预期的那样，在SPBN-333感染的对照细胞的组织培养上清液中未检测到HIV-1 p55和/或p24（图。和C）。最后，我们用HIV-1 RT特异性抗体筛选了其中一个膜，该抗体检测到两种蛋白质，其大小分别为HIV-1 RT51kDa和RT，其中包含RNase H结构域在66kDa迁移。这两种形式的HIV-1 RT也可以在HIV-1病毒中发现(27,45)仅在感染SPBN-Pr160的细胞上清液中检测到。
纯化RV病毒和HIV-1 VLP的Western blot分析。BSR细胞感染SPBN-333、SPBN-333-Gag或SPBN-Pr160（MOI为5），60 h后裂解。将培养上清液中的病毒和VLP在20%蔗糖上造粒，用SDS-PAGE分离病毒蛋白，并用HIV-1 p24（α-p24）（A）、RV N（α-N）（B）或HIV-1 RT（α-RT）（C）特异性抗体进行Western blotting。如图A所示，在SPBN-333-Gag和SPBN-Pr160上清液中用HIV-1 Gag特异性抗体证实HIV-1 Gag的表达。在感染SPBN-Pr160的细胞的上清液中检测到p24裂解产物的预期大小的条带，但在SPBN或SPBN-333-Gag感染细胞的上清中没有检测到，这表明SPBN-Pr 160中表达了一种功能性蛋白酶。在所有重组RV（B）中检测到预期大小的RV N蛋白，表明所有细胞都感染了相应的重组RV。检测到两种蛋白质，其大小分别为51 kDa的HIV-1 RT和66 kDa迁移的RNase H结构域RT。
用SPBN-Pr160感染HeLa细胞导致p55和p24作为未成熟和成熟的HIV-1 VLP释放。
对SPBN-Pr160感染细胞的蔗糖纯化上清液中p55和p24的检测表明，大多数Gag蛋白以HIV-1 VLP的形式释放。然而，在蔗糖纯化后，也可能检测到与p24或p55相关的细胞或膜囊泡，即使RV感染对大多数细胞系没有细胞病变效应（CPE），因此这种“人造”颗粒的出现将受到限制。为了更详细地研究HIV-1 VLP的产生，我们在MOI为1的条件下感染HeLa细胞48小时。细胞在室温下固定在中性缓冲的2.5%戊二醛中，并凝胶成温琼脂。这些细胞在1%OsO中进行后固定4，在分级乙醇和环氧丙烷中脱水，并嵌入Spurr环氧树脂中。薄片被切割并用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，并用电子显微镜检查。结果如图所示。表明RV病毒和HIV-1 VLP的生产水平较高。VLP由未成熟（黑色箭头）和成熟（白色箭头）HIV-1 VLP组成（图。和C）。
通过电子显微镜评估表达成熟和不成熟VLP的重组RV。将Hela细胞在MOI为1的条件下感染SPBN-Pr160 48 h。将细胞在室温下固定在中性缓冲的2.5%戊二醛中，并凝胶成温琼脂。细胞后固定在1%OsO中4在梯度乙醇-丙二醇氧化物中脱水，并嵌入Spurr环氧树脂中。薄片被切割并用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色，并在60 kV下用LEO EM10电子显微镜检查。面板a显示大量子弹状RV颗粒和HIV-1 VLP从感染细胞中释放出来。面板B和C显示未成熟（黑色箭头）和成熟（白色箭头）HIV-1 VLP。原始放大倍数，×43000（A）和×131000（B和C）。
在下一步中，我们希望以更定量的方式分析上清液中的Gag生成。我们之前对HIV-1 Gag的研究结果表明，SPBN-Gag感染的HeLa和BSR细胞在感染后48小时分别产生约4和2 ng Gag，表达Pr160的构建物也有望产生类似数量的Gag。然而，已有研究表明，HIV-1蛋白酶的高表达可以干扰HIV-1 VLP的形成(36). 由于RV感染在大多数细胞系（如HeLa）上没有CPE，因此检测到的大多数HIV-1 Gag应归因于HIV-1 VLP，而不是来自裂解细胞的游离p55。感染SPBN-Pr160的HeLa细胞上清液中p24的量在感染48小时后为2 ng，这与我们之前对SPBN-Gag的结果非常相似。因此，活性蛋白酶的表达不会干扰VLP的形成。
重组RV的多周期和一步生长曲线。
关于表达非常大的基因如HIV-1 Pr160的重组RV的一个担忧是，这将影响病毒复制周期，导致重组RV生长缓慢或达到低滴度。为了更详细地研究SPBN-333-Gag和SPBN-Pr160的复制动力学，以0.01的MOI感染BSR细胞，绘制了多周期生长曲线。如图所示。，两种重组RV生长非常相似，在相似的时间点达到近似相同的滴度，表明病毒传播没有差异。我们之前观察到，表达HIV-1 Gag的重组RV与亲本疫苗载体相比，在这种体外环境下没有任何差异。SPBN-Pr160似乎也是如此。我们还进行了一步生长曲线分析病毒复制的单个细胞周期。如图所示。，所有三种病毒在所有四个时间点显示出大致相同的病毒滴度。因此，与表达HIV-1 Env的杆状病毒的结果不同，SPBN-Pr160大约35%的基因组对病毒的生命周期没有任何重大影响(47)或者来自病毒基因组中不同位置的外源基因(31).
重组疫苗载体的多周期重复和一步生长曲线。BSR细胞感染SPBN-333、SPBN-333-Gag或SPBN-Pr160，MOI为0.01 FFU（多周期生长）（A）或5 FFU（一步生长曲线）（B）。收集等分的组织培养上清液，并按指示重复测定病毒滴度。
RV表达的Gag-Pol前体的加工产生功能性HIV-1蛋白，包括HIV-1 RT。
病毒表达载体的一个重要特征是表达功能蛋白的能力，因为可能需要某些特征来模拟亲本蛋白的免疫原性。例如，只有当这些表位暴露在完整的病毒粒子上时，才能诱导产生针对HIV-1 Env的重要类中和抗体(38). 我们上面列出的结果表明，HIV-1 Gag和Pr160编码的蛋白酶是功能性的，如成熟VLP的形成和p55的切割所示。然而，我们只能通过Western blotting显示HIV-1 RT的表达。出于这些原因，我们使用功能性RT分析来确定RT活性。对于这种方法，用SPBN-333-Gag和SPBN-Pr160在5的MOI下感染BSR或HeLa细胞，并在感染后24、48和72小时分析样本的RT活性。如图所示。在SPBN-Pr160感染细胞中检测到RT活性，RT活性在感染后48 h达到峰值，HeLa细胞上清液中的RT活性约为5 ng/ml，感染后72 h降至0.9 ng/ml。SPBN-333-Gag控制感染仅显示背景水平。
表达HIV-1 Gag-Pol的重组RV产生功能性逆转录酶（RT）。用SPBN-333-Gag或SPBN-Pr160在MOI为5时感染BSR或HeLa细胞，并在感染后24、48和72小时分析样本的RT活性。感染SPBN-Pr160后48和72小时，BSR和HeLa细胞均检测到RT活性。SPBN-333-Gag控制感染仅显示RT活性的背景水平。
使用高效RV回收系统从单个RV基因组构建表达HIV-1 Gag-Pol和HIV-1 Env的重组RV。
来自重组RV的功能性HIV-1 Pr160的表达令人鼓舞，这种方法可能通过向免疫系统提供比SPBN-333-Gag更多的重要HIV-1 CTL表位来提高该构建物的功效。然而，单靠这种方法是否有助于防止先前观察到的挑战病毒从细胞反应中逃逸，这一点值得怀疑(6,7). 据推测，免疫系统的双臂可能需要保护以抵抗HIV-1感染，或至少提供长期的疾病保护。因此，我们决定在构建中包含HIV-1 gp160。我们之前构建了一种新的表达HIV-1的RV疫苗载体89.6便士我们用RV G CD（BNSP-333-89.6P-RVG）替换HIV-1 CD的环境（图。). 这种疫苗载体可以与SPBN-Pr160一起使用，但两种病毒复制速度的差异可能会干扰对这两种抗原的免疫应答诱导。如果这两个基因都是从单个载体表达的，那么这个问题就可以避免。使用单个不是我和百万分之一以pBNSP-89.6P-RVG和pSPBN-Pr160中的I限制性位点为靶点，构建了新的RV载体p89.6PG-Pr160。值得注意的是，该结构体编码了两个外源基因，从而使RV基因组增加了55%。使用上述标准RV回收协议，在分别使用四个六孔板进行三次独立实验后，我们未能回收p89.6PG-Pr160。Conzelmann和Schnell之前使用合成基因组RNA类似物表明，恢复频率取决于各自基因组的大小(12)因此，我们担心能否回收如此大规模的重组病毒。此外，含有HIV-1 Env蛋白的杆状病毒始终生长到较低滴度，这引起了人们对该RV恢复的额外担忧(47). 以前已经表明，除了3′肝炎病毒δ核酶外，RV抗原组中的锤头状核酶5′的加入大大提高了从cDNA中产生感染性RV的能力(23). 因此，我们将这些序列包含在RV载体中。使用新的c89.6PG-Pr160代替p89.6PG-Pr160，我们能够在24孔转染细胞中的2孔中恢复89.6PG_Pr160。
HIV-1 Pr160和Env均由89.6P-RVG-Pr160表达。
为了确保重组RV表达HIV-1蛋白，使用针对HIV-1 p24或Env的抗体，通过Western blotting分析SPBN-333-、SPBN-323-Gag-、SPBR-Pr160-或89.6P-RVG-Pr160感染细胞的细胞裂解物。正如预期的那样，所有三种Gag表达病毒均检测到p55，而p24仅存在于SPBN-Pr160或89.6P-RVG-Pr160感染细胞的细胞裂解液中（图。，车道3和4）。用gp120特异性抗体的免疫印迹从89.6P-RVG-P160裂解物中检测到一个约120kDa的特异性条带（图。，车道8）。尽管p24表明89.6P-RVG-Pr160感染细胞裂解液中存在功能性蛋白酶，但89.6PG-Pr160中功能性HIV-1 Env的表达通过人类T细胞系（Sup-T1）中的融合试验进行分析。由于野生型RV通过受体介导的内吞作用感染细胞，因此RV糖蛋白（G）只能在低pH下引起感染细胞的融合(56). 与SPBN-Pr160感染细胞相比，感染89.6PG-Pr160 48小时后，在Sup-T1细胞中检测到大的合胞体形成（见图。).
表达HIV-1 Gag-Pol和Env的重组RV的Western blot分析。用SPBN-333、SPBN-333-Gag、SPBN-Pr160或89.6P-RVG-Pr160（MOI为2）感染BSR细胞，48小时后裂解。蛋白质通过SDS-PAGE分离，并用HIV-1 p24（α-p24）（A）或HIV-1 Env（α-gp120）（B）特异性抗体进行Western blotting。（A） 用HIV-1 Gag特异性抗体证实了SPBN-333-Gag、SPBN-Pr160或89.6P-RVG-Pr160中HIV-1 p55的表达，并且在SPBN-Pr 160和89.6P-RVG-Pr 160中检测到裂解产物衣壳p24，表明功能蛋白酶在两种病毒中都表达，但在对照病毒SPBN-333和SPBN-333.Gag中没有表达。（B） 在89.6P-RVG-Pr160感染的细胞裂解液中检测到预期大小为gp120的条带，但在对照裂解液中未检测到。
表达HIV-1 Env和Gag-Pol的重组RV中功能性HIV-1包膜的表达。用SPBN-Pr160或89.6P-RVG-Pr160以0.25的MOI感染人T细胞Sup-T1细胞48小时，观察其是否形成合胞体。在感染89.6P-RVG-Pr160（B）的细胞中观察到大的合胞体（B，实心箭头），但在感染SPBN-Pr160（A）的细胞上没有观察到，这表明表达HIV-1 Env、Gag和Pol的重组RV表达功能性HIV-1包膜。
如上所述，HIV-1 RT检测允许检测功能性HIV-1 RT和定量表达的蛋白质量。89.6P-RVG-Pr160的一个担忧是，在Pr160上游引入Env会减少位于下游的Pr160表达。已经证明，VSV的转录在每个基因连接处减弱约20至30%(24). 因此，在MOI为5时用89.6P-RVG-Pr160或SPBN-Pr160感染BSR细胞，24、48和72小时后，我们测定了RT的表达量。结果表明，两种病毒在感染后48至72小时表达了相似数量的4至6 ng RT，这表明Pr160 mRNA水平的可能衰减似乎并没有导致活性RT的蛋白生成降低（图。). HIV-1 89.6P Env的功能表达通过在Sup-T1细胞上的融合试验得到证实（图。).
表达HIV-1 Env、Gag和Pol的重组RV产生功能性逆转录酶（RT）。用SPBN-333-Gag、SPBN-Pr160或89.6P-RVG-P160以5的MOI感染BSR细胞，并在感染后24、48和72小时分析样品的RT活性。感染后24、48和72小时，在SPBN-Pr160和89.6P-RVG-Pr60感染细胞中检测到相似水平的RT活性。这表明在Gag-Pol上游插入一个额外的外源基因（SHIV 89.6P-RVG）不会降低BSR感染细胞的RT活性。SPBN-333-Gag控制感染仅显示RT活性的背景水平。
下一步，我们通过两条多周期一步生长曲线分析了89.6P-RVG-Pr160的生长。如前所述，所有含环境的杆状病毒的滴度都比含有其他外源基因的杆状病毒低。图中所示的数据也证实了这一发现。然而，在多周期生长曲线中观察到的传播速度较慢，至少部分可能是由于Env在RV基因组中的位置所致，并且对于从N和P蛋白之间的位置表达Gag的重组RV也有类似的发现(31). 然而，观察到的89.6-RVG-Pr160滴度足以用于疫苗方法（图。). 值得注意的是，我们以前对表达HIV-1 Gag的高度减毒RV的研究结果表明，这些疫苗载体的滴度降低或传播速度减慢都不会影响其免疫原性(31).
89.6P-RVG-Pr160的多周期重复和一步生长曲线。BSR细胞感染SPBN-Pr160或89.6P-RVG-Pr160，MOI为0.01（多周期生长[A]）或5（一步生长曲线[B]）。收集组织培养上清液的等分试样，并按指示一式两份测定病毒滴度。
最后，我们想分析SPBN-pr160病例中大Gag-Pol前体蛋白的表达或89.6P-RVG-pr160疫苗载体中两个大蛋白的表达是否会干扰RV载体在小动物模型中的免疫原性。对于这种方法，BALB/c小鼠肌肉注射106SPBN-Pr160或89.6P-RVG-P160的FFU。免疫六周后，用107痘苗病毒Gag的PFU。激发五天后，每组两只小鼠被处死，取下脾脏并用K染色d日-针对HIV-1 Gag p24表位的p24四聚体。如图所示。约占CD8的12至16%+用表达Gag的痘苗病毒攻击后，细胞呈四聚体阳性，之前用仅表达HIV-1 Gag的RV载体以相同途径免疫的小鼠，检测到相似数量的细胞，表明多个大基因的表达不会导致细胞免疫反应的减弱。
脾细胞K染色d日-AMQMLKETI主要组织相容性复合物-肽四聚体复合物。小鼠接种106SPBN-Pr160或89.6P-RVG-Pr160的FFU和免疫6周后，用表达HIV-1 Gag的重组痘苗病毒攻击小鼠。五天后，分离脾细胞，并用FITC-偶联大鼠抗小鼠CD8抗体和Kd日-AMQMLKETI MHC肽四聚体复合物。
讨论
在这里，我们描述了两种基于RV的载体的产生和特征，这两种载体单独或除嵌合HIV-1外还表达HIV-1 Gag-Pol前体蛋白89.6便士/RV G蛋白。这些重组病毒除了表达HIV-1环境外，还表达功能性HIV-1 Gag、蛋白酶和RT。Gag-Pol蛋白的表达导致未成熟和成熟HIV-1 VLP的形成和释放。HIV-1基因组主要结构蛋白的功能表达使这些重组RV成为具有吸引力的候选疫苗，因为它们密切模拟HIV-1生命周期中的重要事件，例如VLP的释放和细胞融合。
病毒载体是有吸引力的候选疫苗载体，被广泛用作HIV-1的疫苗载体（综述见参考文献30和46). 然而，克隆的局限性和稳定性是大量使用这些载体的障碍（有关综述，请参阅参考文献46). 迄今为止，以DNA为基础的病毒，如痘病毒，能够表达最大的外源基因，一种表达HIV-1 Gag、Pol和Env的改良痘苗病毒Ankara（MVA）已被用于在DNA启动后保护恒河猴免受AIDS样疾病，但当仅使用HIV-1 Gag-Pol抗原时，同样的方法失败(三). 这些结果表明了HIV-1环境特异性免疫反应在该方法中的重要性。仅表达Gag-Pol的MVA未能保护猴子可能是因为表达了大量的载体编码蛋白，其中一些是免疫抑制蛋白(22). 然而，几种方法能够在恒河猴模型中诱导有效的病毒特异性CTL反应，并保护控制高致病性SHIV-189.9便士挑战(4,5,8,42,49,50). 最近的研究表明，由于挑战性病毒的免疫逃逸，这些控制病毒而非预防感染的疫苗方法中的一些失败了(6; 有关审查，请参阅参考7). 通过使用更广泛的HIV-1特异性CTL反应，可以防止或至少延迟这些逃逸。值得注意的是，“圣杯”将诱导广泛反应的中和抗体。
如上所述，具有较大克隆能力的病毒很少见，但两种基于弹状病毒的载体很有希望成为候选病毒(33). 已经描述了一种同时表达HIV-1 Env和Gag的重组VSV，但尚未用于免疫方法(19). 然而，表达HIV-1 Gag或Env的基于VSV的载体在小鼠和恒河猴中都显示出免疫原性(20,21,42; N.F.Rose、P.A.Marx、A.Luckay、D.F.Nixon、W.J.Moretto、S.M.Donahoe和J.K.Rose，《第八届反转录病毒机会性感染》，节选。23, 2001). 表达HIV-1Env的基于RV疫苗株的载体在蛋白质增强后诱导强烈的体液Env特异性免疫反应(47)在用表达HIV-1 Env或Gag的RV免疫的小鼠中检测到强烈的CTL反应(29,32). 最近，有人描述了高度衰减的RV，即使在小鼠颅内接种后也安全(31). 如上所述，针对HIV-1 p55的CTL应答似乎不足以保护猴子的长期感染不发展为AIDS样疾病(6,7). 与HIV-1 gp160相比，HIV-1的内部蛋白更为保守，大量证据表明CTL对其他HIV-1蛋白的反应很重要，这些蛋白由编码Pr160前体蛋白的基因编码，如蛋白酶(26,44)，整合酶(15)和RT(10,43).
令人惊讶的是，在SPBN-Pr160中掺入超过4kb不会干扰重组RV的生长，而HIV-1环境表达型RV的滴度降低了约10倍(47). 这些结果与其他RV和VSV的结果相似，重组VSV的滴度降低了3倍(19)或10倍(25)HIV-1合并后89.6环境。这些是重要的发现，因为使用两种复制速度不同的病毒可能会干扰较慢病毒的免疫原性。使用单个疫苗载体表达来自单个基因组的所有免疫原可以避免这个问题。89.6P-RVG-Pr160最终滴度仍高达约108，但多周期生长曲线显示了Env表达的加性效应，此外，由于来自载体BNSP的N和P基因之间的外源基因表达导致生长较慢(31). 值得注意的是，我们先前对表达HIV-1 Gag的高度减毒RV的研究结果清楚地表明，这些疫苗载体的滴度降低或传播速度减慢都不会干扰其免疫原性，但这些因素会进一步降低其致病性(31). 然而，需要进行并行免疫原性研究，以分析由单个细胞表达多个基因的单个载体或由不同细胞表达单个基因的载体组合产生的免疫反应是否存在差异。
最后，我们使用了一个新的恢复系统来生成89.6P-RVG-Pr160的l8.5-kb基因组，这是一种我们用标准恢复系统无法获得的病毒(31). 早期工作表明，在RV抗原组的5′端引入的三个额外的胞苷干扰了重组RV的有效回收，这三个胞苷是T7 RNA聚合酶启动子高效转录所必需的(12,48). 我们的新系统基于Inoue等人的发现，即当使用CMV启动子和抗原组两侧的两种核酶时，感染性RV的产生更有效(23,28). 本文提供的数据表明，回收频率的提高可能是由于产生了精确的抗原组5′端。这一结论基于我们的发现，通过切换到包含CMV、T7启动子和5′端HH核酶的新RV载体，BSR-T7细胞的恢复频率大大增加。值得注意的是，CMV启动子的引入现在允许我们追求T7 RNA聚合酶自由系统，并可能使用批准用于人类疫苗生产的细胞系，如Inoue等人(23).
因此，我们的结果表明，包含多个外来基因的RV基因组大小超过50%的超大疫苗载体可以被利用和回收。这些免疫原是融合原，能够释放未成熟和成熟的HIV-1 VLP。这两种特征可能对HIV-1疫苗有帮助，因为它们（i）可能暴露出只有在融合过程中才能获得的HIV-1 Env表位；（ii）产生高度稳定和免疫原性的HIV-1 VLP；和（iii）提供来自其他外源蛋白的CTL表位的表达，如蛋白酶、整合酶和RT。进一步的研究将分析这些新的Gag-Pol或Gag-Pol-Env免疫原是否优于之前描述的表达HIV-1 Gag或Env的RV载体，这些载体目前正在小型和大型动物模型中进行研究。此外，最近对大部分人群进行天花疫苗接种或重新接种的努力可能会干扰牛痘病毒及其改良版本作为疫苗载体的效用。
致谢
FACS分析由托马斯杰斐逊大学Kimmel癌症中心CORE流式细胞仪设施的Paul L.Hallberg提供。针对p24的人单克隆抗体(30)、针对HIV-1 RT的兔抗体、针对HIV-1 gp120的羊抗体、编码HIV-1感染性克隆的质粒pNL4-3NL4-3型(46)，以及编码HIV-1 3′区的质粒89.6便士通过NIAID艾滋病司艾滋病研究和参考试剂项目（ARRRP）获得。
这项研究得到了NIH向M.J.S.提供的AI49153赠款的支持。
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