尽管工业化国家控制了许多传染病，但急性病毒性呼吸道感染仍然是主要的致病原因和住院原因。呼吸道合胞病毒（RSV）和人副流感病毒3型（hPIV3）这两种副粘病毒是婴幼儿急性呼吸道疾病的病原体，导致住院儿童20%至25%的肺炎和45%至50%的细支气管炎(8). 此外，最近发现的人偏肺病毒（hMPV）似乎与儿童下呼吸道感染有关(25). 初步流行病学报告估计，儿童中hMPV的发病率为7%至10%(5,11,16,18,25). hMPV感染的症状与RSV和hPIV3引起的症状相似，在某些情况下，患有急性下呼吸道感染的幼儿需要住院治疗(17). 最近，Greensill等人报告了在30名接受RSV毛细支气管炎通气治疗的婴儿中21名（70%）的支气管肺泡灌洗液中检测到hMPV(7).
呼吸道合胞病毒（RSV）仍然是婴儿、老年人和免疫缺陷患者最常见的呼吸道病原体之一。住院治疗和免疫球蛋白治疗通常是缓解严重RSV感染的必要措施。几十年来，利用病毒亚单位或灭活病毒疫苗生产RSV疫苗的方法因缺乏免疫原性或再次感染自然发生的野生型RSV可能导致肺部疾病加重而失败。负链RNA病毒反向遗传学的出现导致了大量基因设计的RSV候选疫苗，这些候选疫苗含有RSV基本基因的突变或RSV非基本基因的缺失，以在不损害免疫原性的情况下抑制病毒复制(三). 这些研究的结果清楚地表明，RSV候选疫苗必须进行适当的微调，以平衡免疫原性和1至2个月大婴儿的接种衰减。如果RSV候选疫苗的稀释度不够，孩子们就会出现疾病迹象。如果疫苗病毒没有足够的复制，免疫儿童的免疫原性水平将很低且无效(4). RSV的两个亚群（A和B）在任何给定时间循环。两个RSV亚群的F蛋白高度保守（98%氨基酸同源性），而RSV附着糖蛋白（G）在氨基酸水平上仅显示53%同源性。
hPIV3是臀部的病原体，臀部是一种最常见于幼儿的急性下呼吸道疾病(6,8,29). 迄今为止，已在人体临床试验中对两种hPIV3减毒活疫苗候选株进行了评估。在人体临床试验中，对2至6个月大的儿童接种了减毒活牛PIV3，这是一种詹纳氏型疫苗，被证明是安全和免疫原性的(12,14). 在人类临床试验中，一株表现出温度敏感性表型的冷传hPIV3菌株（cpts-hPIV3）也被证明具有免疫原性(13,23).
人乳头瘤病毒引起的临床症状与呼吸道合胞病毒相似，从轻微的呼吸道问题到严重的咳嗽、细支气管炎和肺炎(2,25). 基于来自许多不同临床分离株的F和G基因的序列比较，鉴定了hMPV的两个亚群（分支A和B）。分支A和分支B的F基因高度保守，在氨基酸水平上显示>95%的同源性。相反，hMPV G蛋白是可变的，仅显示35%的氨基酸身份（R.a.M.Fouchier，个人通信）。根据电子显微镜和基因星座和序列的比较，hMPV被指定为变性肺病毒的属副粘病毒科家庭。hMPV显示一种独特的基因组织（3′N-P-M-M2-SH-G-L 5′），与PIV3或RSV相似但不同(24,25). 美国、加拿大、欧洲和澳大利亚的一些研究实验室已经开始努力制备中和hMPV单克隆和多克隆抗血清，并生产hMPV减毒活疫苗。
食品和药物管理局批准的RSV、hPIV3或hMPV疫苗目前尚不可用。然而，一种理想的、可销售的疫苗产品可能含有对RSV、hPIV3和hMPV这三种呼吸道病原体都有效的病毒疫苗，因为所有这些病毒都会导致同一人群、幼儿的广泛发病率和死亡率。
在本研究中，我们研究了牛/人嵌合型PIV3（b/h PIV3）的适用性，该嵌合型牛/人PIV3本身是hPIV3的候选疫苗，可作为表达RSV F、RSV G或hMPV F蛋白的减毒活病毒疫苗载体。b/h PIV3病毒载体携带hPIV3的F和HN基因(9). 产生了表达RSV或hMPV表面糖蛋白的二价疫苗候选株。通过b/h PIV3表达RSV的表面糖蛋白、融合蛋白（F）和G或hMPV的F蛋白而产生的抗体，预计将分别导致交叉中和和交叉保护，以抵抗所有RSV或hMPV菌株的感染，因为RSV F基因在RSV的A亚群和B亚群之间高度保守，分支A和B的hMPV F基因表现出高度保守。将外源抗原插入b/h PIV3 RNA基因组的两个最靠近3′的位置。位置1位于本地bPIV3先导基因和bPIV3N基因之间，位置2并列于bPIV3-N和P基因之间。由于副粘病毒RNA依赖性RNA聚合酶进入基因组RNA的3′端的一个单一位点，启动病毒基因的顺序转录，因此产生了一个转录梯度，其中位于病毒RNA 3′端附近的基因转录频率较高，产生更高水平的蛋白质表达(15). 为了获得最高水平的蛋白表达，选择用于基因插入的3′端位置不应影响所产生嵌合病毒的复制效率。
分析PIV3基因组中1或2位表达RSV或hMPV表面糖蛋白的重组b/h PIV3的抗原表达水平、组织培养中的复制、小动物模型中的复制以及引发免疫反应的能力。所有这些病毒都在用于基因插入PIV3基因组的两个位置高效表达RSV或hMPV蛋白。本研究进一步评估了结构相似的抗原是否会导致具有相似表型的嵌合病毒，以及来源于hMPV或RSV的外源糖蛋白是否在功能上并入b/hPIV3包膜。RSV F、RSV G或hMPV F基因产物具有结构特征，可将其识别为完整的膜蛋白。这些蛋白质具有功能相似的结构域，如跨膜区和信号肽，使其能够被整合到PIV3包膜中，并作为宿主免疫反应的靶点。用嵌合b/h PIV3/RSV或b/h PIV3/hMPV免疫的动物在挑战性研究中受到RSV或hMPV和PIV3的保护，并产生中和RSV或hMPV抗体和PIV3HAI抗体。最有希望的b/h PIV3/RSV和b/h PIV3/hMPV F候选疫苗将在灵长类动物和人类中进行安全性和有效性评估。
材料和方法
细胞和病毒。
RSV A2株、b/h PIV3、hMPV/NL/1/00株、b/h-PIV3/RSV和b/h PIV3/hMPV病毒在庆大霉素存在下，在Opti-MEM（最小必需培养基）（Gibco/BRL）的Vero细胞中生长。表达噬菌体T7 RNA聚合酶的改良安卡拉痘苗病毒（MVA-T7）或禽痘病毒（FP-T7）在鸡胚肾细胞（SPAFAS）中生长。Vero、HeLa和HEp-2细胞保存在补充了10%胎牛血清（FBS）、2 mM的MEM（JRH Biosciences）中我-谷氨酰胺、非必需氨基酸和抗生素。
b/h PIV3/RSV和b/h PIV3/hMPV全长cDNA的构建。
为了将外源基因插入b/h PIV3 cDNA，平均在b/h PIV3 cDNA质粒中引入II限制性内切酶位点(9,10)使用QuikChange试剂盒（Stratagene）进行定点突变。一个平均在b/h PIV3基因组的核苷酸（nt）104处引入II位点，用寡核苷酸5′GAAATCCTAAGACCTAGGCATGTTGAGTC3′及其补体改变4 nt。该限制性内切酶位点用于将RSV基因插入病毒基因组的第一个（3′近端）位置。另一个平均II位点于nt1774引入N-P基因间区，利用寡核苷酸5′CCACACTCAACCTAGGATTGGAAGAGAACAATG3′及其补体改变2 nt。使用该限制位点（指定为F1或G1）将RSV基因插入b/h PIV3（指定为F2或G2）的N和P基因之间的第二个位置（图。). 携带病毒平均从全长b/h PIV3 cDNA中恢复了nt 104和1774的II位点。
b/h PIV3 RNA基因组的示意图，作为插入RSV或hMPV表面糖蛋白基因的载体主干。PIV3基因组位置1或2处的RSV F、RSV G和hMPV F基因插入用灰色方框表示。通过使用平均II限制性内切酶位点引入PIV3基因组的nt 104或平均公元1774年第二遗址。插入的转录单位包含bPIV3 N-P基因间区域，其基因停止和启动序列用于插入盒下游基因的转录。
RSV G盒式磁带的构造。
以b/h PIV3 cDNA为PCR模板，获得了一个含有b PIV3 N-P基因间区和RSV G基因3′端序列的DNA片段。该片段由5′CCCAACACCAGCCAGTCACAGAGAGACCACTAC3′和5′CCCaAGCTTCCCTAGGTGATCTTTGGTGAGTTGGGGG3′寡核苷酸PCR产生。然后将该片段用于重叠PCR，将bPIV3 N-P基因间区添加到RSV G基因中。所得到的PCR片段包含RSV G开放阅读框（ORF），其bPIV3 N-P基因间区两侧为平均II限制性内切酶位点克隆到pGEM3中。
hMPV F盒式磁带的构造。
从R.Fouchier获得了携带hMPV F基因的质粒（pRF515）（NL/1/00株）。用重叠PCR在hMPV F基因的3′端添加bPIV3 N-P基因间区，并在hMPV-F基因盒的两侧添加平均II位点的生成方式与RSV G盒的生成方式相同。
RSV F盒式磁带的构造。
通过PCR从全长bPIV3/RSV F+G cDNA质粒中分离出RSV F基因片段平均RSV F基因5′端和3′端的II位点。将RSV F基因导入1-5 bPIV3质粒，该质粒包含bPIV4基因组的第一个5200 nt和平均II站点位于nt 1774，线性化为平均二、。通过PCR分离出bPIV3 N-P基因间区。利用寡核苷酸5′GACGCGTCGACCAAGAGAGACCACTATCACC3′和bPIV3 F ORF中的寡核苷酸退火，生成包含bPIV3N-P基因间区的PCR片段，平均II位点和bPIV3序列高达nt 5200。将PCR片段添加到含有RSV F基因的1-5 bPIV3质粒的第2位，使用萨尔我和Nhe公司I站点。
对RSV G、RSV F和hMPV F基因盒进行测序，以确认存在完整的ORF、预测的氨基酸序列，并验证6的规则。通过使用平均II限制性内切酶位点转入1-5 bPIV3亚克隆。通过限制性内切酶图谱确定正确的定位后，用酶消化RSV基因位于第一位的质粒斯芬克斯我和Bss公司分离HII和4-kb（1-5 RSV G1）或4.8-kb（1~5 RSV F1或1~5 hMPV F1）DNA片段。b/h PIV3基因组的其余部分被连接为15.1-kb速度我-Bss公司HII DNA片段，产生全长cDNA。在第二个位置含有RSV基因的bPIV3亚克隆被切割速度我和Nhe公司一、 分离出5.8 kb（bPIV3/RSV G2）和6.5 kb（b PIV3/RSV F2或bPIV3/hMPV F2）DNA片段。b/h PIV3基因组的其余部分被连接为Nhe公司我-速度14 kb大小的I DNA片段，用于生成全长cDNA质粒。
通过反向遗传学恢复重组病毒。
通过上述转染方法在HeLa或HEp-2细胞中通过反向遗传学恢复感染病毒(9). 简言之，用FP-T7或MVA-T7分别以0.1至0.3或1至5的感染复数（MOI）感染HEp-2或Vero细胞，在六孔组织培养皿中以80%至90%的融合度。在感染FP-T7或MVA-T7后，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞一次，并转染以下数量的质粒DNA：2.0μg全长b/h PIV3 cDNA、0.4μg pCITE/N、0.4μgpCITE/P和0.2μg pCITE/L。在Lipofectamine 2000（Invitrogen）存在下进行转染根据制造商的说明。将转染反应混合物在33°C下培养5至12 h，然后用2 ml新鲜的含有庆大霉素的Opti-MEM替换含有Lipofectamine 2000的培养基。将转染细胞在33°C下进一步培养2天。用1×SPG稳定细胞（10×SPG为2.18 M蔗糖，0.038 M KH2人事军官4，0.072万K2高性能操作4和0.054 M我-谷氨酸），并在−80°C下通过一个冻融循环进行溶解。粗细胞裂解液被用于感染新的Vero细胞单层，以扩增被拯救的病毒。嵌合病毒是通过限制Vero细胞和10株库存中的稀释液来克隆的6到108生成PFU/ml。通过逆转录PCR（RT-PCR）分离嵌合病毒的RSV或hMPV基因，并对其序列进行了验证。用RSV山羊多克隆抗血清（生物发生）对感染的Vero细胞单层进行免疫染色，确认RSV蛋白的表达。用hMPV豚鼠多克隆抗血清（R.Fouchier）进行免疫染色，确认hMPV F蛋白的表达。
b/h PIV3/RSV或b/h PIV3/hMPV嵌合病毒的生长曲线。
Vero细胞生长到90%的融合，并在0.01或0.1的MOI下感染b/h PIV3、b/h PIV3/RSV F1、b/h PI V3/RSV G1、b/h P1V3/RSV-F2、b/hPIV3/RSVG2、b/h-PIV3/hMPV F1或b/h PIV 3/hMPV-F2。受感染的单层在37°C下孵育。在感染后0、24、48、72、96和120小时（hpi），收集细胞和培养基，并将其储存在−70°C。每个时间点收获的病毒滴度由50%的组织培养感染剂量（TCID）测定50)或Vero细胞中的斑块测定。TCID公司50在37°C下孵育6天后，目测检测细胞病变效应（CPE），而在35°C下培养5天后，用RSV或hMPV多克隆抗血清对斑块检测进行免疫染色以进行定量。
b/h PIV3/RSV嵌合病毒表达的RSV蛋白的Western blotting。
嵌合病毒以0.1的MOI感染（70%至80%）亚融合Vero细胞。感染后48小时，取下培养基覆盖层，用1 ml PBS冲洗受感染单层。随后在400μl含有5%β-巯基乙醇（Sigma）的Laemmli缓冲液（Bio-Rad）中溶解细胞。在12%Tris-HCl Ready Gel（Bio-Rad）上分离15微升每个样品，并使用半干转移池（Bio-Read）转移到尼龙膜上。在含有0.5%（体积/体积）吐温20（西格玛）（PBST）的PBS（pH 7.6）中冲洗尼龙膜，并在室温下用含有5%（重量/体积）干乳（PBST-M）的PBST封闭20至30分钟。用RSV F单克隆抗体混合物（单克隆抗体WHO 1269、1200、1153、1112、1243和1107）培养膜(1)PBST-M或RSV G 10181多克隆抗体（Orbigen）1:1000稀释，PBST-M1:2000稀释，室温下1小时。在用PBST进行四次洗涤后，在室温下用二级辣根过氧化物酶结合山羊抗鼠抗体（Dako）在PBST-M中以1:2000稀释液培养膜1小时。膜用PBST清洗四次，用化学发光底物（Amersham Pharmacia）显影，并暴露于Biomax Light Film（Kodak）以显示蛋白带。
通过b/h PIV3/hMPV表达的hMPV F蛋白的免疫沉淀。
为了免疫沉淀b/h PIV3/hMPV表达的hMPV F蛋白，Vero细胞在0.05的MOI下感染b/h PIV 3或b/h PIV/hMPV F1或F2。感染后20小时，细胞在Dulbecco改良的Eagle's培养基（DME）中培养30分钟，该培养基缺乏半胱氨酸和蛋氨酸（ICN）。去除培养基，0.5 ml二甲醚缺乏半胱氨酸和蛋氨酸，含有100μCi的[35S] 将Pro-Mix（Amersham）添加到细胞中。感染细胞在35在37°C下进行5小时的S同位素测试。取出培养基，在含有0.15M NaCl的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中溶解感染细胞。将细胞裂解物与豚鼠或人抗人MPV多克隆抗血清孵育，并在4℃下与重组蛋白G琼脂糖（Invitrogen）结合过夜。将琼脂糖珠制成颗粒，用0.3 M NaCl RIPA缓冲液清洗一次，用0.15 M NaCl-RIPA缓冲溶液清洗两次。用含有0.05 M NaCl、2.5 mM EDTA和0.05 M Tris-HCl（pH 7.5）的缓冲液进行最终清洗后，在10%蛋白质凝胶上对样品进行分馏。将凝胶干燥并暴露于MR胶片（柯达）。
b/h PIV3/RSV和b/h PIV3/hMPV的遗传稳定性研究。
将T25烧瓶中的亚流入Vero细胞感染b/h PIV3/RSV或b/h PIV3/hMPV，MOI为0.1，并在33°C下培养4天，或直到CPE可见。在孵育期结束时，采集受感染的细胞和培养基并冷冻和解冻两次，然后使用所得细胞裂解液感染一个新的T25烧瓶Vero细胞。这个循环重复了10次。所有从P1到P10的细胞裂解物（P表示传代数）通过斑块试验和免疫染色分析RSV或hMPV蛋白的表达和病毒滴度。通过RT-PCR从P10裂解物中分离出RSV F、RSV G和hMPV F基因盒，并测序以确定可能的核苷酸改变。
叙利亚金黄地鼠体内b/h PIV3/RSV和b/h PIV3/hMPV嵌合病毒的复制。
五周大的叙利亚金黄仓鼠（每组六只）被10只感染6b/h PIV3、b/h PIV3/RSV、RSV A2、b/h PI V3/hMPV、hMPV/NL/1/00或安慰剂培养基的PFU，体积为100μl。不同组分别保存在微隔离器笼中。感染后4天，采集动物的鼻鼻甲和肺，匀浆，并在−70°C下储存。用TCID测定组织中病毒的滴度50Vero细胞中的测定。在挑战性研究中，动物在第28天经鼻接种10只6每毫升hPIV3、RSV A2或hMPV/NL/1/00的PFU。在激发后4天，分离动物的鼻甲和肺部，并通过Vero细胞上的斑块试验检测激发病毒复制。通过免疫染色对斑块进行可视化定量。
中和试验。
对b/h PIV3、b/h PIV3/RSV嵌合病毒或Vero细胞上的RSV进行中和试验。从Judy Beeler和WHO试剂库获得的RSV多克隆抗血清（Biogenesis，Poole，England）、RSV F 1200 MAb的连续两倍稀释液(1)、hPIV3 F（C191/9）和HN（68/2）MAbs(26,28)在室温下用约100个b/h PIV3、b/h PIV3/RSV嵌合病毒或RSV的PFU在0.5 ml Opti-MEM中孵育60分钟。孵育后，将病毒-血清混合物转移到Vero细胞单层中，在35°C孵育1小时，在EMEM/L-15培养基中覆盖1%甲基纤维素（JRH Biosciences；Lenexa，Kans.），含2%FBS和1%抗生素，并在35°C下培养。接种6天后，对感染细胞单层进行免疫染色。中和滴度表示为导致病毒滴度抑制50%的最高血清稀释度的倒数。
对感染后第28天从用b/h PIV3、b/h PIV3/RSV或b/h PIV 3/hMPV嵌合病毒、RSV A2或hMPV免疫的仓鼠获得的血清进行中和试验。将仓鼠血清进行两倍连续稀释，并与100个RSV A2或hMPV PFU孵育1h。将病毒-血清混合物转移到Vero细胞单层并覆盖甲基纤维素。在35°C下孵育5或10天后，分别用RSV或hMPV多克隆抗血清对单层进行免疫染色，以进行定量。
HAI分析。
血凝抑制（HAI）检测是通过将第28天仓鼠血清的连续两倍稀释液在25°C下与hPIV3在V-底96-well板中孵育30分钟来进行的。添加豚鼠红细胞后，再继续培养90分钟，并记录每个孔中是否存在血凝。标题表示为平均倒数对数2抑制血凝的最高血清稀释度。
结果
恢复在基因组位置1或2携带RSV F、RSV G或hMPV F基因的嵌合PIV3。
此前已有研究表明，bPIV3在恒河猴中的复制作用减弱，在儿童中安全且具有免疫原性(12,27). 表明恒河猴bPIV3基因衰减的遗传决定因素位于N、P和L基因中(22). 根据这些数据，预计携带hPIV3 F和HN基因的嵌合b/h PIV3在人类中仍会减弱，因此有必要发展成为疫苗载体。将诸如RSV或hMPV基因等外来抗原插入b/h PIV3基因组中会产生额外程度的衰减。
已知RSV的表面糖蛋白负责激发中和抗体。预计仅高度保守的RSV F蛋白就能引起对A亚群和B亚群RSV株的保护性免疫。同样，仅hMPV F蛋白就可以保护hMPV的所有分支。为了测试糖蛋白的免疫原性，设计了b/h PIV3载体，以在两个位置插入基因。独特平均II限制性内切酶位点被引入PIV3基因组N基因翻译起始密码子上游（位置1）以及bPIV3 N和P基因之间（位置2）。将RSV F或G基因和与bPIV3 N-P基因间区偶联的hMPV F基因作为转录盒插入PIV3基因组的位置1和位置2，以生成二价PIV3/RSV或PIV3/hMPV候选疫苗（图。). PIV3病毒RNA基因组中最靠近3′的基因位置的转录频率高于靠近5′端的基因。因此，插入PIV3 1或2位的外源抗原应高水平表达，以引起强烈的免疫反应。PIV3 N基因从基因组位置1转移到2使得重组病毒的恢复效率降低，可能是因为N蛋白的数量较少和/或N蛋白的产生延迟。与基因插入位置2相比，需要更多的转染才能恢复在位置1含有基因插入的嵌合病毒。
PIV3基因组1或2位携带RSV或hMPV基因的嵌合病毒复制动力学的比较。
为了研究PIV3基因组第1或2位的基因插入是否对病毒复制有影响，在0.1的MOI下，对Vero细胞中的b/h PIV3/RSV F1、F2、G1和G2以及b/h PIV3/hMPV F1和F2进行了多周期生长曲线（图。). b/h PIV3/RSV G2和F2复制到8.3和7.7 log的峰值滴度1072 hpi时的PFU/ml，仅为0.5至1.0 log10低于载体b/h PIV3的峰值滴度（图。). b/h PIV3 F1复制到6.9 log的峰值滴度10，为~1对数10低于第2位携带RSV F基因的b/h PIV3的观察值。与b/h PIV3/RSV G2相比，b/h PIV3/RSV G1显示延迟复制动力学（图。). 在b/h PIV3/RSV G1中观察到的复制延迟导致峰值滴度为7.0 log1096 hpi（图。).
（A） 以0.1的MOI在Vero细胞中进行b/h PIV3/RSV F1、F2、G1、G2和b/h PIV 3的多周期生长曲线。（B） MOI为0.1时Vero细胞中B/h PIV3/hMPV F1、F2和B/h PIV 3的多周期生长曲线。在0、24、48、72、96和120 hpi时收集细胞和上清液。样品的效价通过Vero细胞上的菌斑试验测定。
在b/h PIV3基因组第2位携带hMPV F基因的嵌合病毒的复制效率与b/h PIV3载体相同。96 hpi时b/h PIV3/hMPV F2的峰值滴度为8.1 log10PFU/ml（图。). 相比之下，1位PIV3表达的hMPV F蛋白显示病毒复制延迟，峰值滴度降低了1.8 log10与96 hpi时b/h PIV3/hMPV F2相比。在Vero细胞中获得的b/h PIV3/hMPV F1最高效价为6.3 log10PFU/ml（图。). b/h PIV3/hMPV F1显示的病毒复制缺陷比b/h PIV3/RSV G1或b/h PIV 3/RSV F1更严重，表明插入的蛋白可能对病毒复制产生影响。
总的来说，数据显示在基因组位置1或2表达RSV或hMPV蛋白的b/h PIV3复制到10的峰值滴度6到108Vero细胞中的PFU/ml。在组织培养中，与在位置1含有外源基因的病毒相比，在位置2含有抗原插入的病毒复制效率更高。
通过嵌合b/h PIV3表达RSV或hMPV蛋白。
通过Western blotting验证嵌合b/h PIV3/RSV表达RSV F或RSV G蛋白。在48 hpi、MOI为0.1时比较了b/h PIV3/RSV F1和b/h PIV3/RSV F2的RSV F蛋白表达水平（图。). 代表RSV F的～50-kDa频带1在感染b/h PIV3/RSV F1和b/h PIV3/RSV F2以及野生型RSV的细胞中检测到蛋白水解片段（图。，车道1、2和3）。RSV F的金额148 hpi时，b/h PIV3/RSV F1和b/h PIV3/RSV F2的表达相似。只有低水平的未分离F0在感染b/hPIV3/RSVF1和b/hPIV3/RSVF2的细胞中检测到，表明大多数F0如野生型RSV感染所观察到的，嵌合病毒感染期间前体被有效处理。正如预期的那样，b/h PIV3和模拟感染的细胞裂解物没有产生RSV F蛋白的信号（图。，车道4和5）。在b/h PIV3/RSV F1和F2裂解物中也观察到约26kDa的较小条带（图。，1和2巷），在野生型RSV裂解物中不存在。由于RSV F单克隆抗体与F中的表位结合1片段，该蛋白水解片段可能来自F1蛋白质。RSV感染细胞中缺乏这种蛋白水解酶片段可能是由于RSV F在全套RSV蛋白存在的情况下进行了更真实的加工（图。，车道3）。
Vero细胞中通过嵌合b/h PIV3表达RSV或hMPV蛋白。（A） 感染b/h PIV3/RSV F1或F2或野生型RSV A2、b/h PIV 3（MOI为0.1）或48 hpi模拟感染细胞的Vero细胞裂解物的免疫印迹用RSV F特异性单克隆抗血清进行探测。与处理的RSV F相对应的～50-kDa频带1在b/h PIV3/RSV F1和F2裂解液以及RSV A2中观察到蛋白质。～90 kDa的较大频带，未分离F0前体也相对较少地存在于通道1和通道2中，这表明RSV F蛋白在嵌合病毒中有效地进行加工。（B） 感染B/h PIV3/RSV G1或G2、RSV A2、B/h PIV 3（MOI为0.1）和模拟感染细胞裂解液的细胞裂解液在48 hpi时的Western blot。用RSV G多克隆抗血清进行Western blot检测，显示由b/h PIV3/RSV G1或G2或RSV A2表达的RSV G蛋白的成熟糖基化和未成熟形式。正如预期的那样，在感染b/h PIV3的Vero细胞或模拟感染细胞的裂解液中未观察到信号。（C） b/h PIV3/hMPV F1-或F2-、b/h PIV3-或模拟感染35收集48 hpi的S标记细胞裂解物，并用hMPV特异性多克隆豚鼠抗血清进行免疫沉淀。在来源于b/h PIV3/hMPV F1和F2的细胞裂解液中观察到～80 kDa的条带，而b/h PIV 3-或模拟感染裂解液中不存在该条带。此大小与未合并的F一致0hMPV蛋白。
图中显示了RSV G在b/h PIV3/RSV G1、b/h PIV3/RSV G2和野生型RSV感染细胞中的相对表达，MOI为0.1，48 hpi。检测到RSV G的未成熟型和糖基化型分别在约50和90 kDa时迁移。b/h PIV3/RSV G1感染细胞的RSV G表达水平与野生型RSV感染细胞相似（图。，车道1和3）。然而，在b/h PIV3/RSV G2感染细胞中，RSV G的蓄积量是野生型RSV感染细胞中蓄积量的2-3倍（图。，车道2和3）。RSV G基因在PIV3基因组中的近端位置比其在RSV基因组中的本地位置更近，这可能是RSV G表达水平更高的原因。RSV G在位置1没有观察到更高的表达水平，其复制效率不如b/h PIV3/RSV G2。在来自b/h PIV3-或模拟感染细胞的细胞裂解液中未观察到RSV G特异性条带（图。，泳道4和5）。
由于现有hMPV多克隆抗血清在Western blot中不能识别完全变性的hMPV F蛋白，因此通过免疫沉淀法分析回收的b/h PIV3/hMPV病毒的hMPV-F蛋白表达。通过用豚鼠hMPV抗血清的免疫沉淀显示b/h PIV3/hMPV F1和F2对hMPV F蛋白的表达（图。). 有趣的是，在约80 kDa时，在b/h PIV3/hMPV F1和F2的裂解液中观察到一条特异带，这与未分离的F前体蛋白F的大小相对应0尽管hMPV F蛋白由b/h PIV3 F1和F2表达，但很难比较b/h PIV3/hMPV F1和F2产生的量。b/h PIV3/hMPV F1预计表达较少的hMPV F蛋白，因为它的复制效率也低于b/h PIV3/hMPV-F2。
总的来说，这些数据表明嵌合b/h PIV3/RSV在位置1和位置2高效表达RSV F和G蛋白。b/h PIV3/hMPV F从两个基因组位置表达hMPV F-蛋白。PIV3基因组位置1或位置2的抗原表达水平相似，因此任何位置都可以用于基因插入。然而，b/h PIV3对位置2基因插入的耐受性更好，因为病毒复制比位置1受到的危害更小。
所有嵌合b/h PIV3/RSV和b/h PIV3/hMPV病毒都能稳定地插入RSV或hMPV基因多次传代。
大规模生产活病毒疫苗需要病毒多次传代才能获得高病毒滴度。因此，在Vero细胞中多次传代后，重要的是确定嵌合PIV3中位置1或位置2的基因插入是否被稳定保留。嵌合病毒在Vero细胞中连续盲传10次。在每个传代水平上，通过使用RSV或hMPV多克隆抗血清进行免疫染色的斑块分析，分析感染细胞裂解液中RSV或hMPV蛋白的表达。传代10后，通过RT-PCR分离导入的RSV或hMPV转录单位。通过DNA序列分析验证了RSV或hMPV基因序列，包括基因末端序列和基因起始序列。所有携带RSV或hMPV糖蛋白的b/h PIV3病毒均能稳定地保持RSV和hMPV基因盒以及RSV和hMPV蛋白表达10代（数据未显示）。
嵌合b/h PIV3/RSV不能被RSV抗血清中和。
我们研究了引入的外源表面糖蛋白是否并入b/h PIV3病毒的病毒膜，这可能会影响病毒的向性。为了解决这个问题，使用b/h PIV3/RSV进行中和分析（表). RSV F 1200 MAbs在1:2000稀释度下中和了50%的野生型RSV A2（表). 相反，即使稀释1:25也不能中和任何b/h PIV3/RSV嵌合物。同样，稀释1:400的多克隆RSV抗血清可以中和50%的RSV A2，但即使稀释1:15.6也不能中和b/h PIV 3 RSV（表). hPIV3 F C191/9 MAb以1:500的稀释度中和了50%的b/h PIV3和b/h PIV3/RSV（表). hPIV3 HN 68/2 MAb以1:16000稀释度中和b/h PIV3，以1:32000稀释度中和c/h PIV3/RSV（表). 当在相同条件下进行这些分析时，但在存在豚鼠补体的情况下，仍然没有观察到b/h PIV3/RSV的中和作用（数据未显示）。结果清楚地表明，RSV蛋白没有功能：即RSV F蛋白不能在功能上替代被hPIV3 F抗体阻断的hPIV3F蛋白。此外，这些结果表明RSV蛋白不存在于病毒外壳中。仍有可能在b/h PIV3包膜中错误合并RSV F或G蛋白，从而导致RSV抗体无法获得中和表位，或者RSV G或F蛋白数量不足，无法改变b/h PIV 3病毒的原始中和特性。尽管目前的实验无法区分这些可能性，但表达外源抗原的b/h PIV3不太可能导致病毒向性改变。
表1。
用RSV和hPIV3抗血清中和b/h PIV3/RSV
| 中和试验中使用的病毒 | 50%中和抗体稀释
|
|---|
| RSV F 1200 MAb（RSV F 1200MAb） | RSV PAb一 | hPIV3 F C191/9 MAb | hPIV3 HN 68/2 MAb |
|---|
| 相对标准偏差 | 2,000 | 400 | 62.5 | <500 |
| b/h PIV3 | <25 | <15.6 | 500 | 16,000 |
| b/h RSV F1 | <25 | <15.6 | 500 | 32,000 |
| b/h呼吸道合胞病毒F2 | <25 | <15.6 | 500 | 32,000 |
| b/h RSV G1 | ND（无损检测）b条 | <15.6 | ND（无损检测） | 32,000 |
| b/h RSV G2型 | ND（无损检测） | <15.6 | ND（无损检测） | 32,000 |
叙利亚金黄仓鼠体内b/h PIV3/RSV F1、G1、F2和G2的复制。
叙利亚金黄地鼠是一种允许的小动物模型，适合评估基因工程b/h PIV3的复制和免疫原性(9). 预计RSV抗原的引入不会改变嵌合b/h PIV3在仓鼠中感染和复制的能力，因为外源抗原没有在功能上并入病毒（表). 当动物经鼻免疫后，结果显示所有嵌合b/h PIV3/RSV复制到4.2至4.6 log10TCID公司50/g仓鼠鼻甲组织（表). 这些复制水平与b/h PIV3的复制水平相似，后者复制到4.8 log10TCID公司50/g组织（表). 叙利亚金黄仓鼠只允许感染RSV。在仓鼠上呼吸道观察到的RSV滴度降低了1.4 log10TCID公司50/g组织与b/h PIV3相比（表). 在位置1携带RSV基因的b/h PIV3/RSV显示滴度降低0.9-1.5 log10与b/h PIV3相比，仓鼠肺部中). 相反，在位置2含有基因插入的b/h PIV3/RSV复制到与仓鼠下呼吸道中观察到的b/h PI V3滴度相似的滴度（表). 嵌合体PIV3在位置1或2含有外源基因，能够在仓鼠的下呼吸道和上呼吸道有效复制。在b/h PIV3基因组的1或2位引入额外的基因并没有在体内显著减弱病毒。
表2。
表达RSV F或G蛋白的b/h PIV3在仓鼠PIV3基因组1或2位的复制
| 病毒一 | 感染后第4天的平均病毒滴度（对数10TCID公司50/g组织±SE）b条
|
|---|
| 鼻甲 | 肺 |
|---|
| b/h枢轴3 | 4.8 ± 0.4 | 4.4 ± 0.3 |
| RSV A2（RSV A2） | 3.4 ± 0.5 | 3.3 ± 0.5 |
| b/h RSV G1 | 4.2 ± 0.7 | 2.9 ± 0.7 |
| b/h RSV F1 | 4.6 ± 0.4 | 3.5 ± 0.2 |
| b/h RSV G2型 | 4.2 ± 0.9 | 4.3 ± 0.2 |
| b/h RSV F2 | 4.6 ± 0.6 | 4.4 ± 0.5 |
接种b/h PIV3/RSV的仓鼠免受RSV A2或hPIV3的攻击，并产生RSV中和和PIV3 HAI血清抗体。
为了评估观察到的b/h PIV3/RSV复制水平是否足以在仓鼠中引发保护性免疫反应，用106接种后第28天每只动物的RSV或hPIV3 PFU。用b/h PIV3/RSV免疫的动物完全免受hPIV3和RSV感染（表). 在仓鼠的上下呼吸道中未发现hPIV3攻击病毒，RSV攻击病毒的检测水平很低。只有接受安慰剂培养基的动物显示4.4和4.1 log10TCID公司50hPIV3/g组织，3.6和3.1 log10上呼吸道和下呼吸道每克组织中RSV的PFU（表). 这项研究还表明，用RSV免疫的动物没有受到hPIV3攻击的保护。同样，接种bh/PIV3的动物显示出高滴度的RSV挑战病毒（表).
表3。
用表达RSV F或RSV G蛋白的b/h PIV3免疫的仓鼠免受RSV A2或hPIV3的攻击
| 免疫病毒一 | 激发后第4天的平均hPIV3滴度（对数10TCID公司50/g组织±SE）b条
| 挑战后第4天的平均RSV A2滴度（log10PFU/g组织±SE）b条
|
|---|
| 鼻甲 | 肺 | 鼻甲 | 肺 |
|---|
| b/h PIV3 | <1.2 ± 0.0 | <1.0 ± 0.1 | 3.3 ± 0.9 | 2.9 ± 0.4 |
| b/h RSV G1 | <1.2 ± 0.1 | <1.1 ± 0.1 | <1.0 ± 0.3 | <0.7 ± 0.1 |
| b/h RSV F1 | <1.0 ± 0.0 | <1.0 ± 0.0 | <0.8 ± 0.1 | <0.5 ± 0.0 |
| b/h RSV G2型 | <1.2 ± 0.2 | <1.1 ± 0.2 | <0.8 ± 0.1 | <0.8 ± 0.3 |
| b/h RSV F2 | <1.2 ± 0.1 | <1.0 ± 0.1 | <1.3 ± 0.6 | <1.6 ± 1.0 |
| RSV A2型 | 4.5 ± 0.6 | 4.8 ± 0.6 | <0.6 ± 0.2 | <0.6 ± 0.1 |
| 安慰剂 | 4.4±0.1 | 4.1 ± 0.1 | 3.6±0.8 | 3.1 ± 0.7 |
在给予激发剂量之前，于第28天从b/h PIV3/RSV免疫动物中获取血清样本。使用50%斑块减少试验分析仓鼠血清中是否存在RSV中和抗体，并通过进行HAI试验分析PIV3 HAI血清抗体（表). 结果表明，在基因组位置1或2表达RSV F蛋白的病毒的RSV中和抗体滴度分别为5.5和6.9 log2分别是。这些滴度略低于从接种野生型RSV的动物获得的血清中观察到的抗体滴度（表). 相反，表达RSV G蛋白的病毒显示RSV中和抗体滴度降低了4 log2与野生型RSV相比（表). 所有嵌合b/h PIV3/RSV仓鼠血清显示HAI血清抗体水平降低0.5至2.0 log2与b/h PIV3观察到的水平相比（表). 结果表明，嵌合b/h PIV3/RSV能够在仓鼠体内高效感染和复制。在接种各种b/h PIV3/RSV嵌合病毒后，观察到一系列针对RSV和hPIV3的中和血清抗体滴度。然而，所有免疫过的动物在受到这些病毒的攻击后都能抵抗RSV和hPIV3感染。
表4。
用b/h PIV3/RSV接种仓鼠可诱导PIV3血清HAI和RSV中和抗体
| 病毒一 | 中和抗体对RSV的反应（平均倒数对数2±SE）b条,c（c） | HAI抗体对hPIV3的反应（平均倒数对数2±SE）c（c） |
|---|
| RSV公司 | 7.9 ± 1.0 | <2.0 ± 0.0 |
| b/h RSV F1 | 5.5 ± 0.5 | 5.5 ± 0.5 |
| b/h RSV G1 | 3.4 ± 0.5 | 6.6 ± 0.7 |
| b/h RSV F2 | 6.9±0.7 | 6.7 ± 0.8 |
| b/h呼吸道合胞病毒G2 | 3.4 ± 0.5 | 5.2 ± 0.4 |
| b/h枢轴3 | <2.0 ± 0.0 | 7.2 ± 0.5 |
叙利亚金黄仓鼠可以感染嵌合型PIV3/hMPV。
人乳头瘤病毒的小动物模型尚未确定。然而，由于嵌合b/h PIV3仅表达一个hMPV蛋白，因此预计嵌合病毒将在仓鼠的呼吸道中高效复制。叙利亚金黄仓鼠经鼻感染b/h PIV3/hMPV F1和F2，并分析这些病毒在呼吸道中复制的能力（表). 结果表明，b/h PIV3/hMPV F1和F2在仓鼠鼻甲中的复制水平分别为5.3和5.7 log10TCID公司50/g组织。这些滴度与b/h PIV3的滴度相似（4.8 log10TCID公司50/g组织）。为了进行比较，野生型hMPV的滴度为5.3 log10TCID公司50/g仓鼠上呼吸道组织（表). b/h PIV3/hMPV F1和F2复制到5.7和4.6 log的滴度10TCID公司50/仓鼠肺组织的克数（表). 这些滴度也与b/h PIV3的滴度相似（5.6 log10TCID公司50/g组织）。野生型hMPV滴度降低3.6 log10TCID公司50/g仓鼠下呼吸道组织（表). 这些数据表明，b/h PIV3/hMPV F1和F2可在叙利亚金黄地鼠的上呼吸道和下呼吸道有效感染和复制，表明仓鼠是研究hMPV免疫原性和hMPV疫苗候选的合适小动物模型。
表5。
表达hMPV F蛋白的b/h PIV3在仓鼠PIV3基因组1或2位的复制
| 病毒一 | 感染后第4天的平均病毒滴度（log10TCID公司50/g组织±SE）b条
|
|---|
| 鼻甲 | 肺 |
|---|
| b/h PIV3 | 4.8 ± 0.2 | 5.6±0.6 |
| b/h hMPV F1型 | 5.3±0.5 | 5.7 ± 0.4 |
| b/h hMPV F2型 | 5.7 ± 0.5 | 4.6±0.3 |
| 百万英里/小时 | 5.3 ± 0.1 | 3.6 ± 0.3 |
接种b/h PIV3/hMPV的仓鼠免受hMPV或hPIV3的攻击，并产生hMPV中和和PIV3 HAI血清抗体。
正如预测的那样，表达hMPV F蛋白的嵌合b/h PIV3在仓鼠呼吸道中复制到高水平（表). 免疫后第28天，接种疫苗的动物经鼻内注射106hPIV3或hMPV的PFU。通过菌斑试验对攻击后4天鼻鼻甲和肺组织中的病毒进行定量。接受b/h PIV3/hMPV F1或F2的动物在下呼吸道完全免受hMPV攻击。正如预期的那样，野生型hMPV免疫动物免受hMPV攻击。只有接受安慰剂培养基的动物的hMPV挑战病毒滴度高达4.5 log10PFU/g肺组织（表). 在上呼吸道，b/h PIV3/hMPV F1仅部分保护hMPV攻击。减少2.5 log10在b/h PIV3/hMPV F1疫苗接种动物中观察到hMPV攻击病毒滴度，与安慰剂治疗对照组中的hMPV挑战病毒滴度相比，后者为6.0 log10PFU/g鼻甲组织。相反，b/h PIV3/hMPV F2完全保护了仓鼠的上呼吸道，只检测到微量hMPV挑战病毒（表). 所有b/h PIV3/hMPV F免疫动物均完全免受hPIV3的攻击。只有接受安慰剂免疫培养基的动物在肺部和鼻甲组织中显示出高水平的hPIV3，导致滴度分别为4.5和4.3 log10TCID公司50/g组织（表).
表6。
用表达hMPV F蛋白的b/h PIV3免疫的仓鼠可免受hMPV或hPIV3的攻击
| 挑战病毒 | 挑战后第4天的平均hPIV3滴度（log10TCID公司50/g组织±SE）b条
| 激发后第4天的平均hMPV滴度（对数10PFU/g组织±SE）b条
|
|---|
| 免疫病毒一 | 鼻甲 | 肺 | 鼻甲 | 肺 |
|---|
| b/h枢轴3 | <1.3 ± 0.2 | <1.1 ± 0.1 | ND（无损检测）c（c） | ND（无损检测） |
| b/h hMPV F1 | <1.3 ± 0.1 | <1.1 ± 0.1 | 3.5 ± 0.8 | <0.5 ± 0.2 |
| b/h hMPV F2型 | <1.2 ± 0.1 | <1.2 ± 0.1 | <0.9 ± 0.4 | <0.5 ± 0.1 |
| 百万英里/小时 | ND（无损检测） | ND（无损检测） | <0.8 ± 0.3 | <0.4 ± 0.0 |
| 安慰剂 | 4.3 ± 0.3 | 4.5 ± 0.5 | 6.0 ± 0.3 | 4.5 ± 1.3 |
在给药激发病毒之前的第28天，从仓鼠中获取血清样本，并分析是否存在hMPV中和抗体和HAI血清抗体（表). hMPV中和抗体水平高，7.4 log2观察到来自野生型hMPV感染动物的血清。从b/h PIV3/hMPV F1或F2-接种仓鼠获得的血清显示中和抗体滴度为7.8和7.4 log2分别与野生型hMPV血清中观察到的结果相同（表). HAI抗体水平也与病毒载体b/h PIV3的抗体水平相似。嵌合b/h PIV3/hMPV F1和F2的HAI滴度分别为5.8和6.3 log2分别为1.2和0.7 log2低于从b/h PIV3感染的仓鼠血清中获得的HAI滴度（表).
表7。
用b/h PIV3/hMPV接种仓鼠可诱导PIV3血清HAI和hMPV中和抗体
| 病毒一 | 中和抗体对hMPV的反应（平均倒数对数2±SE）b条,c（c） | HAI抗体对hPIV3的反应（平均倒数对数2±SE）c（c） |
|---|
| 百万英里/小时 | 7.4 ± 1.5 | <2.0 ± 0.0 |
| b/h hMPV F1型 | 7.8 ± 1.0 | 5.8 ± 0.7 |
| b/h hMPV F2型 | 7.4 ± 1.0 | 6.3 ± 0.5 |
| b/h PIV3 | <2.0 ± 0.0 | 7.0 ± 0.8 |
综上所述，结果表明，表达hMPV F蛋白的b/h PIV3能够在叙利亚金黄地鼠体内高效感染和复制，并诱导对hPIV3和hMPV攻击的保护性免疫。用这些嵌合病毒对仓鼠进行免疫也能诱导产生与野生型hMPV或b/h PIV3水平相似的hMPV中和抗体和HAI血清抗体。
讨论
本研究评估了外源基因插入b/h PIV3基因组的1或2位对体内外病毒复制和外源抗原表达的影响。所选的三种抗原是RSV F、RSV G和hMPV F表面糖蛋白，所有这些抗原都有可能并入b/h PIV3病毒。我们想研究由b/h PIV3表达的所有外源膜糖蛋白是否会产生具有相似表型的病毒，或者插入的蛋白类型是否会产生不同复制特征的病毒。由于副粘病毒以最高频率转录最接近的3′基因，PIV3基因组位置1和2有望产生最高水平的外源蛋白表达。在位置1插入外源基因可能通过延迟和/或减少bPIV3 N蛋白的表达来干扰病毒复制，而这种表达现在发生在基因组位置2。在第一个位置插入也更有可能影响抗原组的转录和复制的启动。相反，在位置2插入基因会改变N-P mRNA比率，这可能也会损害病毒复制。因此，在不影响病毒复制的情况下，测试哪一个基因组位置能够更好地耐受外源基因插入，是很有意义的。
我们的研究表明，b/h PIV3从基因组位置1和2高效表达RSV F、RSV G或hMPV F蛋白。奇怪的是，与野生型RSV相比，外源抗原的3′近端位置并没有导致蛋白质表达增强，正如非片段负链RNA病毒产生的转录梯度所预期的那样。嵌合b/h PIV3/RSV G在位置1表达的RSV G蛋白略低于位置2；然而，对于b/h PIV3/RSV F1或b/h PIV3/hMPV F1未观察到这种影响。呼吸道合胞病毒F0PIV3表达的蛋白质被加工成F1和F2类似于来源于野生型RSV的RSV F蛋白。在来源于b/h PIV3/RSV F1和F2的裂解物中大量积累了较小的蛋白水解片段，这在野生型RSV裂解物中没有观察到。该肽的确切来源尚不明确，但用于探测蛋白质N末端半部分的蛋白质印迹识别表位的抗体。而前体RSV F0以及处理后的RSV F1对于b/h PIV3/RSV F1和F2，未观察到F蛋白加工，对于b/h PI V3从位置1或2表达的hMPV F，未观察出F蛋白加工。b/h PIV3/hMPV F1或F2只显示与未分离F大小相对应的蛋白带0蛋白质前体。对F蛋白裂解位点的分析表明，hMPV F蛋白裂解部位由多个带电荷的氨基酸残基（R质量体系R） 但与RSV或APV（R韩国R和R右后R、 分别）。下划线表示hMPV中不同的氨基酸改变。仙台病毒是一种副粘病毒，具有不敏感的呋喃蛋白酶裂解位点，需要外源蛋白酶才能在组织培养中进行多轮复制(19). 因此，hMPV F蛋白的“弱”裂解位点可能只负责F的存在0在本研究中，免疫沉淀法检测到的蛋白质，由于F1和F2碎片只会出现在低水平。F蛋白切割效率低下可能会阻碍hMPV的细胞间传播，这是组织培养中复制缓慢的原因，也可能解释某些hMPV株对胰蛋白酶的需求(25).
与在位置2含有基因插入的病毒相比，在位置1含有外源基因的PIV3更难通过反向遗传学恢复。这可能是由于bPIV3 N蛋白水平受损，因为N基因被转移到b/h PIV3的基因组位置2，在位置1含有外源基因。对病毒复制动力学的分析表明，携带外源基因插入位置2的病毒复制到病毒载体b/h PIV3的峰值滴度。相反，与b/h PIV3相比，在PIV3基因组的位置1含有基因插入的病毒表现出病毒复制峰值延迟，病毒峰值滴度降低。这对于b/h PIV3/hMPV F1和b/h PIV3/RSV G1最为明显，这表明插入PIV3基因组的外源基因类型也对病毒复制有影响，尽管所有抗原都是具有类似功能的表面糖蛋白。所有在位置2插入基因的嵌合PIV3病毒复制到高滴度107到108Vero细胞中的PFU/ml，因此位置2是外源基因最大表达水平的更好位置。
为了研究外源基因插入是否对体内病毒复制产生影响，仓鼠经鼻感染表达RSV或hMPV蛋白的嵌合b/h PIV3。只有表达RSV F或RSV G蛋白的b/h PIV3在仓鼠下呼吸道中的复制受到限制。然而，对于b/h PIV3/RSV G1或F1，仓鼠肺部的复制水平较低，并不影响对hPIV3或RSV攻击的保护。值得注意的是，与b/h PIV3/RSV F2相比，b/h PIV 3/RSV F1显示出更低的RSV中和和HAI血清抗体滴度。b/h PIV3/hMPV F1和F2的复制水平较高，但b/h PIV3/hMPV-F1仅在上呼吸道部分保护免疫仓鼠。需要进行其他研究，以确定b/h PIV3/hMPV F1显示的部分保护原因。b/h PIV3/hMPV F1和F2的RSV中和水平和PIV3 HAI抗体滴度不受基因组位置的影响，因为这两种病毒所诱导的抗体滴度与野生型hMPV所观察到的相同。
b/h PIV3以前曾被用于表达RSV蛋白，并在仓鼠和灵长类动物中证明免疫保护作用(20,21). 在这些研究中，编码RSV F或G蛋白的基因单独插入PIV3基因组的3′近端位置或串联插入作为RSV G和F的组合。数据表明，RSV F蛋白在PIV3基因组中的位置1（b/h PIV3-F）表达量较小A类)而不是来自位于b/h PIV3 G第2位的RSV F基因A类F类A类，这在存在转录梯度的情况下是不期望的。同样，插入3′近端位置的单个RSV G基因的RSV G蛋白表达高于b/h PIV3 RSV G的表达A类F类A类，其中RSV G基因也位于病毒基因组的3′-最近端(21). 这些结果表明，PIV3基因组位置可能不是外源基因表达水平的唯一决定因素。指导mRNA稳定性或翻译效率的基因起始或基因结束序列和/或RNA元件也可能在确定病毒mRNA转录和病毒蛋白表达效率中发挥作用。有趣的是，在Schmidt等人的研究中，来源于感染b/h PIV3/RSV F1或G1的仓鼠的血清中存在的RSV中和抗体滴度(20)虽然两项研究中野生型RSV血清的中和抗体滴度相同，但均高于我们的数据。抗体滴度的差异可能是由于Schmidt等人在仓鼠呼吸道中产生的b/h PIV3/RSV F1或G1的复制水平较高。b/h PIV3/RSV F1和G1显示滴度0.5和1.7 log10上呼吸道和1.1和2.2 log10仓鼠下呼吸道的滴度分别高于本研究中观察到的复制滴度(20). 仓鼠呼吸道中病毒复制水平的增加可能导致RSV中和抗体滴度升高。hPIV3 F和HN基因的起源，本研究中产生的b/h PIV3的得克萨斯株和Schmidt等人产生的b/hPIV3JS株(20)，可以指导观察到的嵌合病毒在仓鼠体内的复制效率。b/h PIV3/RSV F1和G1仓鼠血清的中和抗体滴度也高于野生型RSV血清滴度(20). 相反，当在恒河猴中评估相同的病毒时，野生型RSV感染恒河猴的中和抗体滴度高于b/h PIV3/RSV F1或G1灵长类血清的中和抗体效价，尽管野生型RSV-复制到恒河猴体内的滴度低于嵌合型PIV3/RSV(21). 为了解决这些差异，有必要在同一研究中直接比较两个不同实验室产生的b/h PIV3/RSV F1和G1病毒，以确定hPIV3表面糖蛋白基因和/或其他遗传成分的来源，例如基因启动和停止序列的类型，可以影响病毒复制和免疫原性。
在本研究中，表达RSV或hMPV表面糖蛋白的嵌合b/h PIV3病毒在小动物模型中表现为二价疫苗。这些病毒的特性使其适合作为RSV、hMPV和hPIV3的减毒活病毒疫苗进行评估。嵌合病毒在组织培养中生长到高滴度。嵌合b/h PIV3的插入抗原在Vero细胞中遗传稳定，并维持到第10代。在接种疫苗的仓鼠中，这些病毒在受到野生型hPIV3、RSV和hMPV的攻击后引发保护性免疫反应。挑战是用同源型病毒进行的；然而，RSV A和B两个亚群（89%）以及hMPV A和B两个亚组（95%）的氨基酸同源性很高，因此预计会发生免疫交叉保护。尽管这还需要直接测试，但RSV F单克隆抗体（如Synagis）可以中和来自A亚群和B亚群的RSV。嵌合病毒尽管未并入病毒中，但仍能诱导对载体化非PIV3糖蛋白的有效中和抗体反应。后一项发现应缓解人们的担忧，即病毒趋向性的改变不太可能是RSV或hMPV中表达b/h PIV3糖蛋白的新病毒-细胞受体相互作用的结果。将在灵长类动物模型中进一步评估b/h PIV3/RSV F2和b/h PIV3/hMPV F2病毒的安全性和有效性。
本研究证明了b/hPIV3作为一种病毒载体用于表达和传递三种不同的外源病毒抗原：RSV F、RSV G和hMPV F的实用性和多功能性，以及为新发现的病毒病原体（感染性cDNA和重组病毒回收系统尚不可用）生成潜在候选疫苗的有效性，进一步强调了开发b/h PIV3作为病毒疫苗载体的重要性。
