《维罗尔杂志》。2003年10月；77(20): 11201–11211.
两株人呼吸道合胞病毒突变株联合感染过程中的基因重组
, ,*和†
克里斯汀·斯潘
马里兰州贝塞斯达国家过敏和传染病研究所传染病实验室，邮编：20892
彼得·柯林斯
马里兰州贝塞斯达国家过敏和传染病研究所传染病实验室，邮编：20892
迈克尔·滕（Michael N.Teng）
马里兰州贝塞斯达国家过敏和传染病研究所传染病实验室，邮编：20892
马里兰州贝塞斯达国家过敏和传染病研究所传染病实验室，邮编：20892
*通讯作者。通讯地址：美国马里兰州贝塞斯达市MSC 8007 South Dr.50号6503室50号楼NIAID，邮编：20892-8007。电话：（301）594-1590。传真：（301）496-8312。电子邮件：vog.hin.diain@snillocp. †现住址：宾夕法尼亚州大学公园宾夕法尼亚州立大学生物化学和分子生物学系，邮编16802。
2003年4月24日收到；2003年7月15日接受。
摘要
对于非片段化负链RNA病毒（单核病毒），先前没有记录到共感染病毒之间的重组。我们通过将HEp-2细胞与两种缺乏G基因（ΔG/HEK）或NS1和NS2基因（ΔNS1/2）的重组呼吸道合胞病毒（rRSV）突变体共感染，研究了呼吸道合胞病毒（RSV）分子间重组的潜力。这些病毒复制效率低下，并在HEp-2细胞中形成精确斑块。因此，具有生长和/或斑块形成优势的潜在重组病毒应易于识别并与两种亲本病毒区分。通过在ΔG/HEK的F和L基因中加入点突变标记，以及设计能够检测这些标记的逆转录PCR（RT-PCR）引物，可以进一步鉴定潜在重组体。通过这两种rRSV突变株进行独立的联合感染和控制单一感染。在六种复合感染中的一种中，发现一种RSV变体在HEp-2细胞中产生的斑块略大于野生型RSV。RT-PCR和测序证明该变异体为重组RSV（rec-RSV）。rec-RSV似乎是由从ΔG/HEK基因组到ΔNS1/2基因组的聚合酶跳跃产生的，然后在SH-G-F基因附近再次产生。这显然分别涉及非同源重组和同源重组事件。重组的基因组与ΔG/HEK突变体的基因组相同，除了SH基因的前12个核苷酸以外的所有核苷酸都被删除，并被由G基因的最后91个核苷酸及其下游基因间区组成的插入物取代。这个插入物可能只来自于共同感染的ΔNS1/2病毒。这导致形成一个短嵌合SH:G基因。Northern和Western blot分析证实，rec-RSV不表达正常的SH和G mRNA和蛋白质，但表达异常的SH:G mRNA。这为分子间重组提供了一个实验证明，可产生一种活性的、独立的单核病毒。然而，在这些优化条件下仅分离出一个rec-RSV支持RSV重组确实罕见的观点。
RNA病毒保持广泛的遗传变异性，通过这种变异可以发生快速进化。例如，这种变异性允许病毒减轻抗病毒免疫反应并适应新的宿主。RNA病毒以多种方式产生这种遗传多样性。RNA病毒的RNA依赖性RNA聚合酶相对容易出错，有人估计每10个错误合并一次4到105核苷酸（nt）(7). 由此产生的突变基因组群被称为准物种，并被认为可以使病毒快速适应其环境的变化。另一种保持遗传多样性的方法是在同一宿主细胞共同感染期间，通过基因型不同菌株或变体之间的核酸交换。这种交换形成的子代基因组包含两个或多个亲本基因组的元素。对于分段RNA病毒，如流感病毒和轮状病毒，遗传物质的交换最常见的是通过重组进行的，重组涉及到整个基因片段的交换，从而产生包含来自亲本病毒片段的子代病毒(5,12,24). 当然，非片段基因组不会发生重组。
另一种交换遗传信息的方法是通过重组，重组包括产生包含来自多个亲本分子片段的嵌合分子。对于RNA病毒来说，当聚合酶从一个模板（供体）转换到另一个（受体）时，大多数（可能所有）重组事件都发生在RNA复制过程中。这形成了一个嵌合体子代分子，其中包含来自两个亲本模板的元素(16,26). 如果重组涉及到具有显著序列相关性的供体和受体模板，则称为同源重组，其中碱基配对可能引导聚合酶从一个模板到另一个模板(11,16). 同源重组可能是“不精确的”，即接合处包含插入、缺失或其他突变的证据，或“精确的”（即没有此类畸变的证据，并且接合处看起来准确而干净）。如果供体模板和受体模板没有明显的序列相关性，那么重组被称为非同源重组，因此碱基配对显然不参与模板切换。
重组对于小核糖核酸病毒等阳性RNA病毒很常见(6)，托加病毒(8)、黄病毒(9)，逆转录病毒(13)和冠状病毒(11). 甲型流感病毒的重组也已被鉴定(14)和图拉汉坦病毒(18)，例如分段负义RNA病毒。然而，以前没有实验记录过非片段负链RNA病毒（单阴性病毒）的重组产生可存活的后代。导致大量缺失和产生缺陷干扰粒子的重组在单核病毒中非常常见，但这些粒子并不能单独存活，很可能并不代表维持遗传多样性的重要储存库，这里不再赘述。在本研究中，我们检测了单核病毒-人呼吸道合胞病毒（RSV）体外混合感染期间分子间重组的可能性。
RSV是该属的原型成员肺炎病毒家庭的副粘病毒和订单单核糖核酸RSV菌株A2基因组是15222nt（或此处使用的cDNA衍生版本为15223nt）的单负义RNA，其编码10个主要亚基因组mRNA和11个病毒蛋白（图。). RNA复制的最小单位由核衣壳N蛋白包裹的病毒基因组组成，并与磷蛋白P和大聚合酶亚基L相关，这两个亚基共同组成RSV复制酶。此外，转录还需要M2 mRNA上游开放阅读框编码的M2-1蛋白。封装的基因组作为转录模板，其中病毒基因被复制到mRNA中，RNA复制则需要基因组或抗原的精确阳性拷贝，被合成和封装，并作为子代基因组合成的模板。
用于HEp-2细胞共感染的两个rRSV突变体ΔG/HEK和ΔNS1/2的基因图谱。基因由其编码的蛋白质识别：NS1和NS2，非结构蛋白1和2；N、 核衣壳蛋白；P、 磷酸蛋白；M、 基质蛋白；SH，小疏水蛋白；G、 附着蛋白；F、 融合蛋白；M2-1，转录抗终止因子；M2-2，RNA合成因子（M2-1和M2-2由相同M2 mRNA中的两个重叠开放阅读框编码）；五十、 大聚合酶蛋白。HEK和SITES分别是F和L基因的点突变，是ΔG/HEK突变所特有的（参见材料和方法）。虚线框表示每个rRSV突变体的基因缺失。ΔG/HEK中的SH-F结包含原始SH-G结的上游31 nt与原始G-F结的下游38 nt融合（括号中的数字）。在ΔNS1/2中，N开放阅读框的ATG融合到NS1基因的上游非翻译区。引物（A、B、C、D、E-HEK、E-wt、14065和14535）的放置，用于通过RT-PCR区分突变结构（表以及材料和方法），用箭头表示。
以前生成的重组RSV（rRSV）缺乏非结构蛋白NS1和NS2（ΔNS1/2）或缺乏连接蛋白G（ΔG/HEK）(22). （注意，关于rRSV，术语“重组”是指cDNA衍生的病毒，而混合感染期间RNA重组的产物将被指定为“重组”RSV[rec-RSV]。）这两种rRSV在Vero细胞中的复制类似于野生型rRSV（rA2），而在HEp-2细胞中，它们的复制效率低得多，并形成小斑块。这两种病毒的生长限制为两个基因组之间的重组提供了可能性，以生成生长改善的嵌合子代，然后将很容易从两个生长不良的亲本的背景中恢复和鉴定。事实上，这种策略提供了对两个亲本之间重组产生的嵌合rec-RSV的鉴定。据我们所知，这项研究是第一次报道单核病毒在实验环境中进行分子间重组。
材料和方法
构建ΔG/HEK和ΔNS1/2 RSV突变体。
ΔG/HEK的结构如前所述(22). G基因的缺失导致含有SH-G基因间区的31个上游nt的SH-F基因间区与G-F基因间区的38个下游nt融合。此外，该病毒与其wt重组亲本的不同之处在于，在L基因中引入了六个翻译沉默的限制性位点，统称为“限制性位点”（sites）突变。具体来说，这些引入的站点是Bsu公司36I（nt位置9399），斯纳BI（nt 11848），个人电脑I（nt 13342），Rsr公司II（nt 14083），Bst公司EII（nt 14318），以及斯纳BI（nt 14477）(25). 还有两种氨基酸变化，Lys-68-Glu和Gln-101-Pro，它们与相邻的限制性位点标记一起引入F基因，被称为HEK突变。这些氨基酸分配与RSV的wt分离物中发现的氨基酸匹配，该分离物用于衍生一系列候选疫苗，不会显著影响病毒体外复制(25). 为了构建ΔNS1/2，D51质粒通过SH基因末端信号包含抗原组的5′端（先导补体）(21)通过Byrapa等人的方法，使用Vent DNA聚合酶（新英格兰生物实验室）作为PCR突变模板(三). 该方法包括通过PCR将突变引入完整质粒，其中两个寡核苷酸以相反的方向启动，产生一个突变的线性质粒，然后自联并克隆。使用的5′-磷酸化引物如下：正向引物，5′-GCT CTT AGC AAA GTC AAG TTG AAT G-3′（nt 1144～1168）；反向引物，5′-CAT公司CTC TAA CCA AGG GAG TTA AAT TTA AGT GG-3′（nt 101至70）。反向引物包含NS1起始蛋氨酸密码子的补体（下划线）以及NS1非翻译区的相邻序列。正向引物从N开放阅读框的第二个密码子开始，从而将NS1非翻译区与N开放阅读框架连接，导致NS1和NS2都被删除。所得PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离、自联并转化为DH10B活性细胞（生命科技）。结构经限制性消化证实Aat公司二-平均测序确认D51ΔNS1/2的II片段，然后将该片段插入全长抗原克隆（D53）的同一窗口(4). 如前所述，基本上恢复了缺少NS1和NS2（ΔNS1/2）的编码rRSV(4,20). ΔG/HEK和ΔNS1/2病毒在Vero细胞中繁殖，和病毒滴度通过Vero细胞上甲基纤维素下的斑块试验测定，病毒斑块通过小鼠抗F单克隆抗体免疫染色显示，随后是辣根过氧化物酶偶联抗小鼠免疫球蛋白G抗体和4CN底物（克尔凯郭尔和佩里实验室），如前所述(15).
HEp-2细胞的复合感染。
在T-25烧瓶中约80%汇合处的HEp-2细胞单层接种ΔNS1/2、ΔG/HEK或两者，每种病毒的感染倍数（MOI）为2 PFU/细胞。建立了六种独立的复合感染和重复的单病毒感染。让病毒在37°C下吸附3 h，然后用4 ml含有4%胎牛血清（FBS）的Opti-MEM替换病毒悬浮液。从每个烧瓶中收集4-ml上清液，每24小时用新鲜培养基替换一次，持续7天。通过离心澄清上清液，在干冰上进行snap冷冻，并将其储存在−70°C下进行菌斑分析。如上所述，在六孔板中的HEp-2和Vero细胞中，通过斑块分析法分析收集的每种病毒上清液的等分试样（600μl），以评估斑块的大小和形态。从第4天收集的每个上清液的一部分（400μl）中提取病毒RNA，并使用歧视性引物（见下文）通过逆转录PCR（RT-PCR）进行分析，以确认每次复合感染和单次感染中亲本突变体的生长。
rec-RSV的菌斑纯化和生长。
在混合感染1第4天至第7天收集的上清液感染HEp-2细胞后，观察到大的wt斑块。单个病毒斑块的分离方法如下：将培养基上清液未稀释地吸附在HEp-2细胞单层的六孔板上。将细胞在37°C下培养2 h。用3 ml 0.8%琼脂（SeaKem）在改良的L15培养基（Biowittaker）中替换接种物。将细胞在37°C下培养6天，直到感染复合感染1上清液的细胞中出现大斑块。然后用1.5 ml含有5%中性红的0.8%琼脂培养基覆盖琼脂培养液，再培养24 h。从共感染1中取出7个大斑块，转移到含有1×SPG（0.218 M蔗糖，3.8 mM KH）的2 ml Opti-MEM中2人事军官4，7.2毫微米K2高性能操作4，5.4mM谷氨酸钠）。用1毫升感染新鲜单层HEp-2细胞，将其覆盖琼脂培养基并以相同方式处理以纯化斑块。剩下的1 ml被snap冷冻并储存在−70°C下。作为对照，从复合感染2和3中提取并并行处理精确斑块。
通过这种方式，取斑块并通过HEp-2细胞传代三次。第三轮纯化后，将悬浮在Opti-MEM-SPG中的琼脂培养基塞中的病毒感染HEp-2细胞单层，制成小病毒库。rec-RSV分离物被指定为rec-RSV1-1至1-7。在Vero细胞中进一步扩增rec-RSV 1-1和1-2，以制备用于图中所示实验的病毒储备。
病毒RNA提取、RT-PCR和测序。
用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒（Qiagen）从上清液中提取病毒RNA。RNA被用作上标II和随机六聚体（Invitrogen）逆转录的模板。PCR使用下面列出的特定正向（阳性）和反向（阴性）引物以及Advantage cDNA聚合酶混合物（Clontech目录号8417-1）进行。每个引物后面括号中的数字表示其在wt-rRSV的完整152223-nt序列中的位置。
根据F基因中是否存在NS1和NS2基因、G基因和HEK标记，使用以下一组引物来区分两个亲本病毒（图。和表)：A（向前），5′GAAAAAATGCGTACAAAACTTGC 3′（nt 5至29）；B（反面），5′TTATGGTGTCTCTTCCTAACC 3′（公元1381年至1358年）；C（正向），5′ACAATTGGAAGCACACCC 3′（nt 3979至3998）；D（反面），5′TACCAACCAGTTCTCTCAGAGC 3′（nt 5819至5800）；E-wt（反向），5′TTGTTGCTTGTGCTTTGC 3′（nt 5971至5952）；E-HEK（背面），5′TTGTTGCTGGAGTTACTTGC 3′（nt 5971至5952）。引物对A-B和C-D根据RT-PCR产物的大小分别区分NS1和NS2基因或G基因的存在与否（图。; 表). 引物对C-E-wt和C-E-HEK分别检测到位置5963、5966和5968处存在或不存在三个核苷酸替换，导致F中的HEK点突变Gln-101-Pro和附近标记限制位点的插入（图。; 表) (25). PCR通过25个变性周期（88°C，30 s）、退火周期（62°C，30s）和延伸周期（68或72°C，3 min）进行，然后在68或72℃下进行最后3 min延伸。
表1。
引物对用于根据产品大小和F基因中是否存在HEK点突变来区分ΔG/HEK和ΔNS1/2病毒
| 正向底漆一 | 反向底漆一 | 病毒 | 产品尺寸b条（bp） |
|---|
| A类 | B类 | 重量rA2 | 1,327 |
| | ΔG/HEK | 1,327 |
| | ΔNS1/2 | 273 |
| C类 | D类 | 重量rA2 | 1,801 |
| | ΔG/HEK | 852 |
| | ΔNS1/2 | 1801年 |
| C类 | 电子重量 | 重量rA2 | 1,954 |
| | ΔG/HEK | 无 |
| | ΔNS1/2 | 1,954 |
| C类 | E-HEK公司 | 重量rA2/HEK | 1,963 |
| | ΔG/HEK | 1,014 |
| | ΔNS1/2 | 无 |
| 14065 | 14535 | 以上全部 | 521 |
为了确定L基因中是否存在SITES突变，用上述随机六聚体cDNA和以下两个引物对基因组RNA进行RT-PCR：14065正向，5′GTAGCATAGGTGAAGGAGC 3′（nt 14041至14065）；背面为14535，5′ATTAAATACTGGGAATATTCGCAGG 3′（nt 14561至14535）。
这两个寡核苷酸同时在L基因的wt和SITES版本上启动，产生一个521-bp的产物，其中包含六个SITES突变中三个突变的位置：然后使用Applied Biosystems Big Dye系统（Perkin-Elmer）对这个未连接的cDNA进行测序分析。结果中描述了用于生成核苷酸测序的RT-PCR产物的其他引物对。
体外生长分析。
在MOI为0.01的情况下，用rA2、ΔG/HEK、ΔNS1/2、rec-RSV 1-1或rec-RSV-1-2三次感染六孔板中的HEp-2和Vero细胞单层。活病毒在Opti-MEM-2%FBS中稀释。在37°C下吸附3h后，用Opti-MEM清洗细胞三次，然后添加2ml含有2%FBS的Opti-EM。每24小时取出整个2ml上清液，并用新鲜培养基替换，持续7天。上清液通过离心澄清，快速冷冻，并储存在−70°C下进行滴定。使用甲基纤维素覆盖物和免疫染色，通过Vero细胞中的斑块试验测定病毒滴度(15).
Northern印迹分析。
6孔板中的汇合Vero细胞在MOI为3时感染rA2、ΔG/HEK、ΔNS1/2、rec-RSV 1-1或rec-RSV1-2，或未感染。24小时后采集细胞，每种细胞制剂的一半用于Northern blot分析，另一半用于Western blot分析（见下文）。使用Trizol-LS试剂（Invitrogen）和RNeasy迷你试剂盒（Qiagen）提取总RNA。RNA通过含有甲醛的1%琼脂糖凝胶电泳，转移到硝化纤维素膜上（Optitran，0.2μm孔径；Schleicher&Schuell），并与32P标记的双链DNA（dsDNA）探针对G、SH、P或N mRNA具有特异性。
蛋白质印迹分析。
用2×样品缓冲液（100 mM Tris-Cl[pH6.8]，4%十二烷基硫酸钠，20%甘油，0.2%溴酚蓝，200 mM二硫苏糖醇）破坏细胞颗粒，并通过Qiashredders（Qiagen）离心。5微升（约7.5×105细胞当量）通过十二烷基硫酸钠-4至20%聚丙烯酰胺凝胶（Novex）进行电泳，并转移到硝酸纤维素膜上。将膜与纯化的RSV的兔多克隆抗血清或代表RSV G蛋白的186至201氨基酸或RSV SH蛋白的53至64氨基酸的肽一起孵育。通过与辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔免疫球蛋白G抗体和化学发光（Amersham）孵育，观察结合抗体。
结果
识别和隔离潜在rec-RSV的策略。
以前没有关于单核病毒在复合感染过程中的分子间重组的记录，这表明这最多是一种罕见的事件。为了便于在实验环境中检测可能存在的罕见重组体，我们选择“杂交”两个RSV基因缺失突变体，即缺乏NS1和NS2基因的ΔNS1/2和缺乏G基因的△G/HEK。这些病毒在Vero细胞中复制良好，而在HEp-2细胞中复制效率低下，并形成精确的斑块。NS1和NS2基因是基因序列中的前两个基因，而G基因是第七个基因（图。)其基本原理是，在干预区域中重组可能会恢复全套基因，并产生一种复制效率提高的rec-RSV，这种复制效率可以很容易地从衰弱的亲本缺失病毒的背景中恢复和鉴定。该策略中的另一个考虑是，NS1、NS2、SH和G基因对于RSV体外复制来说是不必要的，它们提供了一些区域，在这些区域中，由于不精确重组而可能出现的核苷酸插入或缺失可以被容忍。此外，已对ΔG/HEK病毒进行了改造，使其包含导致F基因中两个氨基酸替换（称为HEK突变）的点突变，以及导致插入六个限制性位点标记（称为SITES突变）的L基因中翻译沉默核苷酸替换。这些标记的存在将在下游F和L基因方面区分两种亲本病毒。除了这些差异外，ΔG/HEK和ΔNS1/2病毒的主干是相同的。因此，我们将两种病毒一起感染六个独立的培养瓶HEp-2细胞，每个培养瓶的输入MOI为每个细胞2个PFU，并连续7天每24小时从感染细胞中收集上清液。作为对照，HEp-2细胞分别在同一MOI感染亲本病毒。然后，我们对上清液进行斑块分析，以筛选潜在的重组病毒。
突变rRSV形成菌斑。
正如预期的那样，ΔNS1/2和ΔG/HEK单一感染产生的病毒上清液在HEp-2细胞上产生精确斑块，在Vero细胞上产生更大、更明显的斑块，这也是这些缺失病毒的特征（图。和). 此外，广泛的斑块分析没有发现用于感染的ΔG/HEK和ΔNS1/2病毒库存中存在任何大塑性变体的证据（数据未显示）。同样，在六种复合感染中的五种上清液感染的HEp-2细胞中，只观察到精确的斑块（数据未显示）。然而，对复合感染1第4天至第7天收集的上清液的分析显示，在精确斑块的背景下，有少量大斑块，其大小略大于wt rRSV菌株A2（wt rA2）（图。). 当HEp-2细胞暴露于共感染1第4天收集的600μl病毒上清液（含有约108000个PFU）中时，其中8个形成了大斑块（图。). 从这些大斑块中挑选了7个，在HEp-2细胞中对斑块进行了三次纯化，并将其指定为rec-RSV菌株1-1至1-7。作为对照，还从复合感染2和3的第4天上清液中提取并纯化了几个小斑块：这些斑块在整个斑块纯化步骤中保持其小斑块表型。因此，保留了亲本突变病毒和rec-RSV的斑块形态表型。
来自共感染1（六种共感染之一）的收获中存在的ΔG/HEK和rec RSV之间的斑块大小的比较。在甲基纤维素下培养6天后，按照材料和方法中的描述，通过免疫染色检测菌斑形成。注意在ΔG/HEK感染（a）中形成的针尖斑块，以及在针尖斑块背景下在复合感染1（b；箭头）中观察到的大斑块变体。其他复合感染或涉及ΔG/HEK的任何单一感染（如图所示）或ΔNS1/2（未显示数据）中均未观察到大斑块。
感染rA2（a和e）、△NS1/2（b和f）、△G/HEK（c和G）或斑块纯化rec-RSV 1-1（d和h）的HEp-2（a到d）和Vero（e到h）细胞中斑块形成的显微照片，这些细胞来源于共感染1子代中确定的一个大斑块。感染细胞在甲基纤维素下培养6天，用抗F单克隆抗体混合物进行免疫染色，观察斑块。
在斑块纯化后，使用rec-RSV分离物1-1和1-2感染HEp-2和Vero细胞单层，并将感染后6天的斑块形成与wtrA2、ΔG/HEK和ΔNS1/2的斑块形成进行比较（图。). 在HEp-2细胞中，rec-RSV的斑块比wt rA2的斑块大约45%，并且很容易与ΔG/HEK和ΔNS1/2的精确斑块区分开来（图。). 在Vero细胞中，wt rA2形成的斑块略大于纯化的rec-RSV形成的斑块，wt rA2或rec-RSV形成的斑块大于ΔG/HEK和ΔNS1/2形成的斑块（图。). 应该注意的是，在图。，形成较大斑块的病毒是在较低的MOI感染的，因此，斑块数量的差异并不能反映每种病毒的斑块效率。图中仅显示了rec-RSV 1-1。：rec-RSV 1-2产生了相同的结果（未显示数据）。
斑点纯化病毒的RT-PCR。
底漆对A-B和C-D（图。和表)设计用于分别跨越NS1-NS2基因和SH-G基因，从而根据RT-PCR产物的大小区分ΔNS1/2和ΔG/HEK亲本突变体。底漆对C-E-wt和C-E-HEK（图。和表)设计用于区分携带wt F基因的病毒和携带包含编码Gln-101-Pro替代的HEK突变的F基因的那些病毒。
用引物对a-B对感染wt rA2/HEK（一种含有HEK和SITES突变但在其他方面相同的wt rA2版本）、wt rA1和ΔG/HEK的细胞内RNA进行RT-PCR，确定NS1和NS2基因的存在（1327-bp产物，图。以及ΔNS1/2（273-bp产品，图。，车道3）。用引物对C-D对wt rA2/HEK、wt rA2和ΔNS1/2进行RT-PCR，在每种情况下都产生1801-bp的产物（图。（分别为第1、2和3车道），与预期存在的完整SH和G基因一致。相反，用引物对C-D对ΔG/HEK进行RT-PCR，得到预期的852-bp产物（图。，车道4），与已知删除一致。
亲本病毒基因组RNA和细胞内感染细胞总RNA中rec-RSV的RT-PCR分析。引物对A-B（A）、C-D（B）、C-E-wt（C）和C-E-HEK（D）（表和图。)用于确定rA2/HEK（第1车道）、wt rA2（第2车道）、ΔNS1/2（第3车道）、△G/HEK（第4车道）、plaque-purified rec-RSV1-1（第5车道）和rec-RSV1-2（第6车道）中的基因缺失和HEK点突变的存在与否。请注意，rA2/HEK和wt rA2是wt rRSV的两个版本，其区别仅在于前者中存在HEK和SITES突变。M、 DNA阶梯-ve（第7道），一个缺乏模板的阴性对照。底漆对A-B根据产品尺寸检测是否存在NS1和NS2。引物对C-D根据产品大小检测G基因的存在或缺失。引物对C-E-wt和C-E-HEK还通过产物大小检测G基因的存在，此外，它们分别对F基因中的wt和HEK序列具有特异性。
在wt rA2和ΔNS1/2的情况下，带有引物对C-E-wt的RT-PCR产生了预期的1954-bp产物（图。，泳道2和3），但不是wt rA2/HEK或ΔG/HEK（图。，泳道1和4），证实了该引物对wt F基因的特异性。相反，引物对C-E-HEK产生了wt rA2/HEK和ΔG/HEK的预期产物（图。，通道1和4），并且没有生成wt rA2或ΔNS1/2的产品（图。，通道2和3），确认其对包含Gln-101-Pro-HEK突变的F基因的特异性。
在确认了它们的特异性后，这些引物集被用于分析六种复合感染产生的上清液。用引物对A-B（跨越NS1-NS2）和C-D（跨越SH-G）进行的RT-PCR分析表明，在第4天采集的所有上清液中都存在ΔNS1/2和ΔG/HEK，证实两个亲本病毒在复合感染期间都复制了（数据未显示）。然而，从总上清液的分析来看，潜在的重组病毒基因组并不明显。
接下来，通过RT-PCR分析rec-RSV菌株1-1至1-7，以确定其基因型。带有引物对A-B的RT-PCR表明，NS1和NS2基因存在于7个rec-RSV分离物中，1327-bp的产物证明了这一点（图。，车道5和6，数据未显示）。令人惊讶的是，使用引物对C-D（跨越SH-G）对七个分离物中的每一个进行分析，得到了约500 bp的产物（图。，车道5和6，数据未显示），小于从wt rA2导出的1801-bp产品或从ΔG/HEK导出的852-bp产品。这表明rec-RSV分离株在SH-F区持续存在一个额外的缺失。用引物对C-E-wt和C-E-HEK进行RT-PCR分析表明，7个rec-RSV分离物均含有ΔG/HEK亲本的HEK点突变，如图中1954-bp的带所示。，车道5和6，图中没有。，第5和第6车道。因此，这些分析表明，7个rec-RSV分离物是相同的，包含ΔG/HEK亲本的NS1、NS2和F基因，但在以引物对C-D表示的SH-G区域中包含大量缺失。
rec-RSV分离株选定区域的序列分析。
如上所述，带有引物对C-D（跨越SH-G）的rec-RSV分离物的RT-PCR产生了意外的小分子产物，约为500 bp，表明该区域包含大量缺失。因此，对来自七个rec-RSV分离物中每个分离物的～500-bp RT-PCR产物进行了测序；直接对未粘合的材料进行测序，得到每个分离物的相同序列。该序列显示，rec-RSV在SH基因中包含一个大的缺失，只剩下基因的前12 nt，包括基因启动信号（图。). 此外，就在截短的SH基因的下游，rec-RSV含有91nt的G插入，包括基因末端信号。随后是完整的52-nt G-F基因间区，其中只有下游38 nt存在于ΔG/HEK中（图。). 此外，SH基因的12-nt段和G基因的91-nt段由可能来自SH或G基因的CA二核苷酸分离。这导致了一个105-nt嵌合SH:G基因，该基因包含一组完整的基因起始和基因结束转录信号，两侧有完整的基因间区域，因此编码一个短RNA；然而，RNA缺乏一个重要的开放阅读框架。为了证实这些结果，使用跨越相同一般区域（nt 4004至6094）的独立引物对生成用于测序的RT-PCR产物，其产生与上述相同的结果。
rec-RSV的结构。（a）wt rA2和rec-RSV.细胞内重组事件产生的嵌合SH:G基因的序列如方框所示：斜体核苷酸（共12个）来自SH基因，常规文本中的核苷酸（共91个）来自G基因，黑体中的介入CA二核苷酸是重组连接，存在于这两个基因中，并且可以从任何一个基因中衍生。（b） SH:G基因重组连接两侧的序列比对。顶部序列是亲本ΔG/HEK病毒的序列，从nt 4222开始，以粗体显示具有CA连接二核苷酸的SH基因的上游端；底部序列为亲本ΔNS1/2病毒的序列，起始于nt5495，以粗体显示G基因的下游末端和CA连接二核苷酸；中间序列是rec-RSV的序列。这表明CA二核苷酸是两个亲本模板之间该区域中少数几个分散的序列一致性点之一。（c） 亲本ΔG/HEK和ΔNS1/2病毒的基因图谱，显示了聚合酶从ΔG/HEK基因组跳到ΔNS1/2基因组并再次跳回来时的推断路径（见正文）。面板a中的序列分析确定了上游重组连接；下游连接的位置未知，但考虑到rec-RSV中存在wt-like G-F连接和HEK标记，推测发生在F基因前基因间区域下游38 nt内的某个点，或第一个HEK标记（虚线）的F基因上游并且没有任何序列插入或删除。
嵌合SH:G基因明显代表了一个重组接合点，上游序列来自ΔG/HEK，下游序列源自ΔNS1/2。确定重组区域中两个模板之间的序列相关性程度是很有意义的。如图所示。，其中顶行是SH基因上游端附近的ΔG/HEK序列，第三行是G基因下游端附近的△NS1/2序列，中间行是rec-RSV序列。这一比较表明，除了共享的CA二核苷酸外，这两个序列片段之间没有明显的序列一致性，表明涉及到非同源重组事件。
NS1和NS2基因以及SH基因上游端在rec-RSV中的存在表明，连接处上游的所有序列都来自ΔG/HEK亲本，而G下游端和相邻的基因间序列则来自ΔNS1/2。然而，如上所述，使用C-E-wt和C-E-HEK引物对的RT-PCR表明，rec-RSV分离物也包含F基因中的HEK突变（图。). 这表明rec-RSV分离物的这一区域也来源于ΔG/HEK，而不是ΔNS1/2。这意味着发生了第二次重组事件，其连接位于G-F基因间区域和第二次HEK突变之间的某处。为了研究这一点，使用RT-PCR扩增了rec-RSV分离株的nt4384至4894，然后对其进行测序。序列显示，F基因包含ΔG/HEK亲本的两个HEK标记，并且不包含任何核苷酸变化。HEK标记的存在证实了第二次重组的发生。这一事件一定发生在HEK标记的上游，在G-F基因间区的下游38 nt或F基因的上游198 nt内。核苷酸变化的缺乏表明这一重组事件是同源的和精确的。
ΔG/HEK亲本的L基因中存在SITES标记，因此可以确定rec-RSV分离物中存在的L基因的起源。对这七个分离株进行RT-PCR，以扩增在ΔG/HEK中包含六个位点中三个突变的L基因的一部分。这些引物对不涉及SITES突变的序列（材料和方法）具有特异性，因此将退火为wt或SITES L序列。对得到的RT-PCR产物进行测序，结果表明七个分离物中的每一个都是相同的，并且包含三个位点的突变，Rsr公司II（nt 14083），Bst公司EII（nt 14318），以及斯纳BI（nt 14477），是ΔG/HEK突变亲本所特有的。从这些结果推导出的拟议重组途径如图所示。.
rec-RSV在HEp-2和Vero细胞中的生长。
将rec-RSV 1-1和1-2在HEp-2和Vero细胞中的生长动力学与亲本和wt病毒的生长动力学进行了比较。两种细胞系的三份培养物均感染rec-RSV 1-1或1-2，或感染wt rA2、ΔG/HEK或ΔNS1/2，MOI为0.01。每天采集病毒上清液，持续5天，并测定得到的病毒滴度（图。).
与wt rA2、ΔNS1/2和ΔG/HEK相比，plaque-purified rec-RSV菌株1-1和1-2的生长动力学。HEp-2（a）或Vero（b）细胞的三种培养物在0.01 PFU/细胞的MOI下感染。每天采集上清液，并通过Vero细胞的菌斑分析进行分析。通过RSV F特异性抗体免疫染色观察斑块。平均滴度（log10每毫升PFU）显示的平均值两侧的标准误差是标准误差的两倍。
在HEp-2和Vero细胞中，两个rec-RSV显示出相同的生长模式。在HEp-2细胞中，从第2天到第4天，wt-rA2的滴度显著高于rec-RSV，但到第5天，两种病毒的滴度相似（图。). 相比之下，亲本ΔNS1/2和ΔG/HEK病毒的生长速度较慢，最终滴度比wtrA2和rec-RSVs低约1000倍。在Vero细胞中，rA2和rec-RSV的生长动力学非常相似（图。). 直到第4天，Vero细胞中ΔG/HEK生成的动力学与rec-RSVs和rA2的动力学相似，但此后滴度似乎显著高于其他病毒（图。). 这可能反映了rA2和rec-RSV感染在第4-5天观察到的广泛细胞病理学和活细胞减少，而不是ΔG/HEK的生长优势。ΔNS1/2在Vero细胞中的生长效率低于其他病毒，最终滴度比rA2低约100倍（图。).
通过rec-RSV表达病毒RNA。
从感染wt rA2、ΔG/HEK、ΔNS1/2、rec-RSV 1-1或rec-RSV1-2或未感染的Vero细胞中提取总细胞RNA。使用针对RSV N、P、SH和G基因的dsDNA探针进行Northern杂交。包括rec-RSV在内的所有病毒均按预期表达P和N mRNA（图。). 如预期的那样，单体SH mRNA通过wt rA2、ΔNS1/2和ΔG/HEK表达，但未通过rec-RSV表达（图。，车道1、2和3与车道4和5）。全长G mRNA通过wt rA2和ΔNS1/2表达，但如预期，不是通过ΔG/HEK或rec-RSV表达（图。，通道1和2相对于通道3、4和5）。使用G特异性探针检测到一个大小适合代表嵌合SH:G基因的小mRNA用于rec-RSV（图。，车道4和5）。SH探针检测该mRNA的失败是意料之中的，因为它只包含14个与SH基因相关的nt（图。). 此外，来自rec-RSV的RNA包含少量的mRNA，该mRNA略大于全长G mRNA，并且其大小适合读取M和新SH:G基因（图。，车道4和5）。
感染后24小时从感染wt rA2（泳道1）、ΔNS1/2（泳道2）、ΔG/HEK（泳道3）、斑块纯化的rec RSV 1-1（泳道4）或斑块纯化的rec RSV 1-2（泳道5）或模拟感染（泳道6）的Vero细胞中分离的总细胞内RNA的Northern印迹杂交。RNAs在甲醛凝胶上进行电泳，转移到硝化纤维素中，然后杂交到32P标记的dsDNA探针，用于P（a）、N（b）、SH（c）或G（d）基因。单顺反子P、N、SH和G的位置以及推测的SH:G mRNA显示：通道4和通道5中的微弱上带具有合适的大小，可以作为M和SH:G基因的通读。
rec-RSV蛋白质合成。
Western blot分析进一步证实rec-RSV中没有功能性SH和G基因。用于提取总RNA进行Northern blot分析的部分细胞颗粒用于Western blot分析。通过使用针对纯化RSV的多克隆抗血清对感染细胞的总细胞蛋白进行Western blot分析，确定病毒蛋白的表达（图。)或来源于SH蛋白的肽（图。)或G蛋白（图。). 如预期的那样，被任何病毒感染的细胞表达N、P、M和M2-1蛋白（图。). wt rA2和ΔNS1/2均表示G和SH（图。，车道1和2）。正如预期的那样，ΔG/HEK病毒感染的细胞不含G（图。，车道3），但保留了SH表达式（图。，车道3）。然而，rec-RSV分离株均未诱导G或SH的表达（图。，第4和第5道），这与重组病毒中没有任何功能基因一致。
来自用wt rA2（泳道1）、ΔNS1/2（泳道2）、ΔG/HEK（泳道3）、斑块纯化的rec RSV 1-1（泳道4）或斑块纯化的rec RSV 1-2（泳道5）或模拟感染（泳道6）感染的Vero细胞的细胞相关蛋白的蛋白质印迹分析。使用抗血清对代表G蛋白（a）186至201氨基酸的肽、纯化RSV（b）或代表SH蛋白（c）53至64氨基酸的肽进行Western blot分析。图中显示了斑点的相关裁剪部分。
讨论
虽然阳性RNA病毒的基因组之间的重组很常见，但单核病毒进行基因重组的能力以前没有描述过。因此，我们设计了实验条件以便于检测可能的重组事件。为了做到这一点，我们对两种突变RSV进行了联合感染，由于NS1和NS2基因（△NS1/2）或G基因（△G/HEK）的缺失，这两种RSV复制效率低下，并在HEp-2细胞中形成小斑块。NS1/2和G基因缺失在RSV基因组中的分离量超过3500 nt，这就提供了一种可能性，即重组可能发生在该区域内，并产生一种具有完整基因集的病毒，该病毒可以有效生长，并且很容易从衰弱的亲本突变病毒的背景中分离出来。此外，事实上，NS1、NS2、SH和G基因对RSV体外复制不是必需的，这意味着这些基因中可以容忍可能发生的不精确重组。事实上，双亲中的每一个在HEp-2细胞中复制不良，这有助于识别一种高效复制的病毒，因为它有可能超过双亲中任何一个并在其存在时被检测到。事实上，这种策略导致了rec RSV的鉴定。然而，出乎意料的是，尽管这种病毒确实比其亲本表现出了生长优势，但这并不是因为通过重组重新获得了缺失的基因。此外，回收的rec-RSV似乎是两次重组事件的产物，而不是一次。
与两种亲本缺失病毒相比，与ΔG/HEK和ΔNS1/2共感染六种病毒中的一种产生了rec-RSV，具有生长优势和形成大斑块的能力。从这一次共感染中回收的七个分离物似乎是相同的，这表明该实验中的所有rec-RSV都来自于单个重组基因组。通过鉴定遗传标记来研究rec-RSV的结构，特别是在ΔG/HEK亲本的F和L基因中是否存在NS1和NS2或G基因以及HEK和SITES标记。这与核苷酸序列分析一起提供了证据，证明rec-RSV的大多数基因组来自ΔG/HEK亲本，并且涉及两个重组事件。
发现rec-RSV的SH基因的前12 nt与G基因的后91 nt融合，后者可能仅来自ΔNS1/2亲本。这两个片段由一个CA二核苷酸分离，该二核苷酸在SH和G基因中都有表达，否则不会表现出明显的序列相关性，因此可能来自任何一个基因。似乎有理由认为，虽然碱基配对显然不涉及将两个模板对齐以进行重组，但这种“同源”二核苷酸可能有助于将新生链引导到新模板。因此，这个重组事件符合“非同源”的一般类别(11)注意，可能需要碱基配对来重新引发聚合。也可能是这两个模板通过沿着两条链的其他地方的碱基配对而并置，即使在重组附近没有涉及碱基配对。
第二个重组连接发生在G-F连接的最后38 nt或F基因的第一个198 nt内。这是从发现rec-RSV包含（i）wt RSV的完整52-nt G-F基因间区域推断出来的，该区域在ΔNS1/2亲本中完整存在，而在ΔG/HEK中仅存在下游38-nt，以及（ii）来自ΔG/HEK的两个HEK标记。然而，由于没有序列异常，无法推断出该区域内的确切连接点。因此，这一重组步骤似乎是同源和精确的。之前没有描述过负链RNA病毒的这种重组，如果不使用多个标记物（如本研究中使用的标记物），很难检测到这种重组。
似乎重组发生在从基因组模板合成抗原RNA的过程中，因为后者在受感染细胞中更为丰富，这一因素将增加事件的效率和概率。如果是这样，那么可能的重组途径是：（i）合成开始于ΔG/HEK基因组的先导区，然后进入SH基因；（ii）聚合酶和新生抗原组从ΔG/HEK的SH基因的上游区域向ΔNS1/2的G基因的下游区域进行了“非同源”、不精确的跳跃，复制在G基因的末端恢复，进入基因间区域，可能还有F基因；以及（iii）聚合酶和新生链“同源”，精确跳回到ΔG/HEK链，并在该模板上完成合成（图。).
为了使重组事件被视为产生重组的、可存活的病毒，它必须在随后的世代中持续存在，并且不能通过恢复主要亲本基因组而丢失(23). 我们已经证明，含有SH:G嵌合基因和其他标记的rec-RSV在Vero细胞中通过连续传代进行斑块纯化和病毒扩增的过程中得到了保持。Northern和Western分析表明，尽管G和SH蛋白都被消除，但rec-RSV仍能有效复制。序列信息显示ΔG/HEK基因组没有逆转。因此，嵌合SH:G基因产物的形成是一个稳定的重组事件，rec-RSV是一种可行的重组病毒。
有趣的是，在rec-RSV中鉴定的嵌合SH:G基因与Karron等人所描述的相似(10)对于一种冷传递的、减弱的RSV B亚群突变体，称为内容提供商-52.两种病毒的嵌合基因都具有SH基因起始信号、G基因终止信号，并且所代表的G基因比例比SH基因多。这两种病毒的嵌合基因长度相似，共有91个碱基内容提供商-rec-RSV的52和105个碱基。预测的嵌合mRNA在每种情况下都有表达，并且每种情况都缺乏显著的开放阅读框。通过重组机制内容提供商-52个基因组的发生尚不清楚，但重组可能也发生在抗原合成过程中（由于模板的丰富性和概率，如上所述）可能涉及从一个模板的SH上游端到同一模板或不同模板的G基因下游端的非同源跳跃。在两项研究中，SH-G区参与重组，这可能会成为重组的“热点”，尽管目前这只是推测。rec-RSV含有完整的NS1和NS2基因，缺乏功能性SH和G基因，其基因组分别比wt RSV短1274 nt，比ΔG/HEK或ΔNS1/2短165或450 nt。与ΔNS1/2亲本相比，rec-RSV的生长优势很容易理解，因为NS1和NS2蛋白参与对抗宿主干扰素介导的抗病毒状态(17). 与ΔG/HEK相比，rec RSV生长改善的基础尚不清楚，但可能涉及SH基因的缺失和基因组长度的缩短：这两个因素都已被证明会增加RSV的生长或斑块大小(1,2,19). 出乎意料的是，rec RSV在HEp-2细胞中的生长与wt rA2相似，因为rec RSV缺乏G蛋白，而G蛋白的缺乏先前与HEp-2细胞中生长适应性的降低有关(22). 可能是SH的额外丢失和基因组长度的缩短起了作用。也可能是嵌合SH:G基因起了作用；除了上面提到的奇怪的巧合外，这个想法没有任何根据，即有效增长内容提供商-52也含有类似的嵌合基因。因此，rec-RSV获得wt-like生长适合度的原因尚不明确，但不是这里的中心问题。
在本研究建立的六种共感染中，仅在一种中检测到两个rRSV突变体重组形成新的子代基因组，并且似乎只涉及一个重组基因组，尽管实验条件已被优化以促进重组变体的产生和鉴定。这表明在细胞培养中形成可存活的重组RSV是罕见的，因此在自然界中可能更不常见，因为在自然界中不太可能存在大量的复合感染细胞。这需要注意的是，我们的条件会检测到具有生长优势的重组体。
我们的期望是，在最佳条件下，重组将被更频繁地检测到，因为ΔG/HEK的大塑性形成理论上只需要在NS2结束和G开始之间的约3500 nt内通过一次交叉重新获得G基因。由于我们只能在六个独立的复合感染中观察到一个重组事件，因此重组的频率似乎很低，无论是同源还是非同源。然而，最近发现流感病毒重组(14)RNA片段似乎经常出现，这表明应仔细检查单核病毒。我们正在进一步完善我们目前的系统，以更准确地检测RSV重组。
虽然目前的研究表明RSV重组率很低，但这并不意味着重组在单核病毒进化中没有任何作用。例如，现有单核病毒的基因组共享一组常见的基因，即N-P-M-（G/H/HN）-L，但也可变地包含额外的散布基因，如NS1、NS2、SH和M2。假设现在的单核病毒起源于一个共同的祖先，重组可能在基因的插入或删除中起作用，尽管也可能有其他机制。第二个例子涉及两种肺炎病毒之间的基因顺序差异，即RSV（NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L）和人类偏肺病毒（N-P-M-F-M2-SH-G-L）。这些差异包括人类偏肺病毒中缺乏NS1和NS2基因，以及F-M2基因对相对于SH-G基因对的顺序不同。后一种差异说明了基因顺序中可能的重排，可能是由重组介导的，与这两种肺炎病毒的分化有关。
第三个例子来自RSV分离株的序列分析，其中一个遗传谱系的几个分离株的SH基因片段似乎来自第二个谱系(27). 这表明聚合酶已经跳过去，复制了SH基因的一部分，然后又跳回来。有趣的是，SH基因再次参与其中。尽管有这些先例，RSV的重组频率明显较低，这表明它对单核病毒群体特有的突变体群没有重要贡献，也可能对RSV特有的遗传多样性菌株的维持和进化没有重大贡献。
关于含有明确的、限制性减弱突变的RSV候选疫苗的开发，即使重组频繁，也不应引起对疫苗安全性的担忧，因为弱毒株和弱毒株之间的杂交将产生中度弱毒株后代，在一个已经充满弱毒株RSV的世界中不会构成威胁。此外，人类和动物RSV似乎没有高致病性变体或生物型，否则可能通过重组产生新的毒株。鉴于这里观察到的重组率明显较低，很明显，重组与疫苗的稳定性和安全性无关。
致谢
我们感谢Kim-Chi Tran和Chris Hanson在细胞培养和测序方面提供的技术援助。
为了充分披露，我们承认，我们的实验室得到惠氏公司的支持，开发针对RSV的减毒活疫苗，尽管这一特定项目没有得到该项目的支持。
参考文献
1Bukreyev，A.、S.S.Whitehead、B.R.Murphy和P.L.Collins。1997年，删除了整个SH基因的重组呼吸道合胞病毒在细胞培养中高效生长，并在小鼠呼吸道中表现出特定部位的衰减。J.维罗尔。 71:8973-8982.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 2Bukreyev，A.、B.R.Murphy和P.L.Collins。2000.呼吸道合胞病毒可以耐受至少160个核苷酸的基因间序列，对体外和体内的转录或复制几乎没有影响。J.维罗尔。 74:11017-11026.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 3Byrapa，S.、D.K.Gavin和K.C.Gupta。1995.使用Vent DNA聚合酶对全长质粒进行位点特异性诱变的高效程序。基因组研究。 5:404-407. [公共医学][谷歌学者] 4柯林斯，P.L.，M.G.希尔。，E.Camargo、H.Grosfeld、R.M.Chanock和B.R.Murphy。1995年。从克隆的cDNA生产传染性人呼吸道合胞病毒证实了来自M2 mRNA 5′近端开放阅读框的转录延伸因子在基因表达中的重要作用，并为疫苗开发提供了能力。程序。国家。阿卡德。科学。美国 92:11563-11567.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5康迪特，R.C。2001.病毒学原理，第19-52页。在D.M.Knipe、P.M.Howley、D.E.Griffin、R.A.Lamb、M.A.Martin、B.Roizman和S.E.Straus（编辑），《菲尔德病毒学》，第四版，利宾科特·威廉姆斯和威尔金斯出版社，宾夕法尼亚州费城。
6Cooper，P.D.、A.Steiner-Pryor、P.D.Scotti和D.Delong。1974年。关于脊髓灰质炎病毒基因重组的性质。《病毒遗传学杂志》。 23:41-49. [公共医学][谷歌学者] 7Drake、J.W.和J.J.Holland。1999.RNA病毒的突变率。程序。国家。阿卡德。科学。美国 96:13910-13930.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Hahn，C.S.、S.Lustig、E.G.Strauss和J.H.Strauss。西部马脑炎病毒是一种重组病毒。程序。国家。阿卡德。科学。美国 85:5997-6001.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9霍尔姆斯、E.C.、M.沃罗比和A.拉姆鲍特。登革热病毒重组的系统发育证据。分子生物学。进化。 16:405-409. [公共医学][谷歌学者] 10Karron，R.A.、D.A.Buonagurio、A.F.Georgiu、S.S.Whitehead、J.E.Adamus、M.Clements-Mann、D.O.Harris、V.B.Randolph、S.A.Udem、B.R.Murphy和M.S.Sidhu。1997年。呼吸道合胞病毒（RSV）SH和G蛋白对病毒复制不是必需的在体外：冷传减毒RSV B亚群突变株的临床评估和分子特征。程序。国家。阿卡德。科学。美国 94:13961-13966.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12McCullers，J.A.，G.C.Wang，S.He和R.G.Webster。1999.重组和插入-删除是B型流感病毒在自然界进化的策略。J.维罗尔。 73:7343-7348.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13Mikkelsen，J.G.和F.S.Pedersen。2000.逆转录病毒中通过重组进行基因重组和修补。J.生物识别。科学。 7:77-99. [公共医学][谷歌学者] 14Mitnaul，L.J.、M.N.Matrosovich、M.R.Castrucci、A.B.Tuzikov、N.V.Bovin、D.Kobasa和Y.Kawaoka。平衡的血凝素和神经氨酸酶活性对A型流感病毒的有效复制至关重要。J.维罗尔。 74:6015-6020.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Murphy，B.R.、A.V.Sotnikov、L.A.Lawrence、S.M.Banks和G.A.Prince。1990年。在用福尔马林灭活的呼吸道合胞病毒（RSV）或纯化的F糖蛋白免疫并在免疫3-6个月后用RSV攻击的棉花大鼠中观察到增强的肺组织病理学。疫苗 8:497-502. [公共医学][谷歌学者] 16Nagy，P.D.和A.E.Simon。1997年，对RNA重组机制的新见解。病毒学 235:1-9. [公共医学][谷歌学者] 17Schlender，J.、B.Bosser、U.Buchholz和K.-K.Conzelmann。牛呼吸道合胞病毒非结构蛋白NS1和NS2协同拮抗α/β干扰素诱导的抗病毒反应。J.维罗尔。 74:8234-8242.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Sibold，C.、H.Meisel、D.H.Kruger、M.Labuda、J.Lysy、O.Kozuch、M.Pejcoch、A.Vaheri和A.Plyusnin。1999.图拉汉坦病毒进化中的重组：斯洛伐克遗传谱系分析。J.维罗尔。 73:667-675.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Techaarpornkul，S.、N.Barretto和M.Peeples。2001.缺乏小疏水性和/或附着糖蛋白基因的重组呼吸道合胞病毒缺失突变体的功能分析。J.维罗尔。 75:6825-6834.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Teng，M.N.和P.L.Collins。1998年。识别形成和传代辅助依赖性感染颗粒所需的呼吸道合胞病毒蛋白。J.维罗尔。 72:5707-5716.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Teng，M.N.和P.L.Collins。1999.改变了不产生NS2蛋白的重组呼吸道合胞病毒的生长特性。J.维罗尔。 73:466-473.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Teng，M.N.、S.S.Whitehead和P.L.Collins。2001.呼吸道合胞病毒G糖蛋白及其分泌型和膜结合型对病毒复制的贡献在体外和体内.病毒学 289:283-296. [公共医学][谷歌学者] 23托卢、H.J.G.、P.库西尼尔-巴黎、J.-P.杜兰德、V.Mercier、J.-J.de Pina、P.de Micco、F.Billoir、R.N.Charrel和X.de Lamballerie。2001.基于完整基因组序列分析的1型登革热病毒自然种群重组证据。《病毒遗传学杂志》。 82:1283-1290. [公共医学][谷歌学者] 24Watanabe，M.、T.Nakagomi、Y.Koshimura和O.Nakagomy。同时循环的人类轮状病毒株之间基因组片段重组的直接证据。架构（architecture）。维罗尔。 146:557-570. [公共医学][谷歌学者] 25Whitehead，S.S.，K.Juhasz，C.-Y.Firestone，P.L.Collins和B.R.Murphy。1998年。携带一组冷传呼吸道合胞病毒突变的重组呼吸道合胞菌病毒（RSV）在黑猩猩中被减弱。J.维罗尔。 72:4467-4471.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26M.沃罗比和E.C.福尔摩斯。1999.RNA病毒重组的进化方面。《病毒遗传学杂志》。 80:2535-2543. [公共医学][谷歌学者] 27郑海清、G.A.Storch、C.Zang、T.C.T.Peret、C.S.Park和L.J.Anderson。1999.密切相关的呼吸道合胞病毒A组毒株包膜相关蛋白基因的遗传变异性。病毒研究。 59:89-99. [公共医学][谷歌学者] 
