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癌细胞。作者手稿；PMC 2008年2月15日提供。
以最终编辑形式发布为：
癌细胞。2008年1月；13(1): 23–35.
数字对象标识：2016年10月10日/j.ccr.2007.12.004
预防性维修识别码：项目经理2245859
美国国立卫生研究院：NIHMS37354
PMID：18167337

乳腺癌中TGF-β信号转导的缺失招募促进转移的Gr-1+CD11b+髓系细胞

李阳,1,4 以黄健华,三 任秀宝,5 阿格涅斯卡·戈尔斯卡,1 安娜·克提尔,1 玛丽·阿克莱,1 大卫·P·卡本,2,4 林恩·马特里西安（Lynn M.Matrisian）,1,4 安·里士满,1,4 P.查尔斯·林,三，4和哈罗德·L·摩西1,4
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

TGFβ信号异常在人类癌症中很常见，并有助于肿瘤转移。在这里，我们证明Gr-1+CD11b+髓系细胞被征募到携带II型TGFβ受体基因的乳腺癌中(Tgfbr2型)缺失并直接促进肿瘤转移。Gr-1+CD11b+细胞浸润到肿瘤组织的侵袭前沿，并通过涉及金属蛋白酶活性的过程促进肿瘤细胞的侵袭和转移。Gr-1+CD11b+细胞的这种浸润也导致肿瘤中TGFβ1的丰度增加Tgfbr2型删除。Gr-1+CD11b+细胞在肿瘤中的募集Tgfbr2型缺失涉及两个趋化因子受体轴，SDF-1/CXCR4和CXCL5/CXCR2轴。总之，这些数据表明Gr-1+CD11b+细胞通过增强肿瘤细胞的侵袭和转移而促进TGFβ介导的转移。

重要性

TGFβ是一种非常重要的肿瘤抑制因子。TGFβ信号的失活经常发生在人类癌症中，并有助于肿瘤转移。然而，宿主细胞在这一过程中的作用尚不清楚。这里，我们显示删除Tgfbr2型在乳腺癌细胞中，趋化因子信号增加，增强Gr-1+CD11b+髓样细胞向肿瘤的浸润，从而导致肿瘤的侵袭和转移增强。Gr-1+CD11b+细胞浸润也导致肿瘤中TGFβ的生成增加Tgfbr2型删除。因此，TGFβ的抑瘤作用可以通过在肿瘤微环境中招募Gr-1+CD11b+细胞而转变为促瘤作用。抑制Gr-1+CD11b+细胞的产生/募集可以提高宿主免疫监视并抑制肿瘤转移，具有“一石二鸟”的效果。

关键词：转化生长因子β、肿瘤进展、转移、炎症、肿瘤微环境、骨髓、髓样细胞、基质金属蛋白酶、趋化因子

介绍

越来越多的证据表明TGFβ信号转导的改变对肿瘤的发生和发展有显著影响(Bierie和Moses，2006年). TGFβ通过I型和II型TGFβ受体（分别为TβRI和TβRII）发出信号，导致Smad2和Smad3磷酸化，然后与Smad4结合进入细胞核调节转录(Bierie和Moses，2006年). 此外，TGFβ与其受体的结合激活了许多非规范信号通路。转化生长因子β可以作为肿瘤抑制因子或肿瘤促进剂，这取决于肿瘤进展的背景和阶段。TβRI和TβRII编码基因的突变(TGFBR1型和TGFBR2型）在许多人类癌症中都有报道(阿赫斯特和德林克，2001年). 中的突变TGFBR2型在微卫星不稳定的肿瘤中尤为常见(格雷迪和马科维茨，2002年). 虽然TGFβ受体基因突变在人类乳腺癌中并不常见，但有令人信服的证据表明该疾病中TGFβ信号受损(Bagadi等人，2006年;Chen等人，1998年;Chen等人，2006年;Seitz等人，2003年). 早期和晚期乳腺癌中经常出现TβRII表达降低(de Jong等人，1998年;Gobbi等人，1999年). 此外TGFBR1型导致TGFβ信号转导减少与乳腺癌发病率增加和转移有关(Chen等人，2006年;Pasche等人，2005年). 转基因动物研究表明，TGFβ信号传导的简单减少就足以导致乳腺癌的发展(Tang等人，1998年).

有条件淘汰Tgfbr2型结合Kras的表达G12D系列胰腺癌(Ijichi等人，2006年)或在肠癌中有APC突变(Munoz等人，2006年)导致侵袭性肿瘤表型的发展。我们已经证明了Tgfbr2型在MMTV启动子下也表达多瘤中间T抗原（PyVmT）的乳腺上皮细胞中，导致肿瘤潜伏期缩短和转移增加(Forrester等人，2005年;Ijichi等人，2006年;Munoz等人，2006年). 然而，其他研究表明，通过组成活性TGFβ1的表达增强TGFβ信号传导(Muraoka等人，2003年;Muraoka-Cook等人，2004年)或TβRI(Muraoka-Cook等人，2004年;Muraoka-Cook等人，2006年;Siegel等人，2003年)在乳腺上皮细胞中，结合PyVmT的c-Neu表达会增加肺转移，这是一个难题。目前尚不清楚这些不同观察结果背后的机制。

宿主衍生的炎性细胞渗入肿瘤组织并创造有利于肿瘤进展的环境。它们通过产生血管生成因子和基质降解酶促进肿瘤血管生成和肿瘤进展(Balkwill和Coussens，2004年;Coussens and Werb，2002年). 炎症细胞向肿瘤部位的募集受趋化因子和趋化因子受体的相互作用调节。ENA-78/CXCL5与CXCR2相互作用，负责将多形核中性粒细胞募集到炎症肺部(Ahuja和Murphy，1996年;Bozic等人，1996年;Jeyaseelan等人，2005年;Zineh等人，2006年). 此外，基质衍生因子1（SDF-1或CXCL12）被认为是外周循环和靶组织间造血干细胞和祖细胞贩运的关键调节因子之一。SDF-1通过其受体CXCR4调节其趋化作用，CXCR4在假定的干细胞和祖细胞上高度表达(Balkwill和Coussens，2004年).

Gr-1+CD11b+髓系细胞，也称为髓系免疫抑制细胞（MISCs）或髓系衍生抑制细胞（MDSCs），在荷瘤小鼠的骨髓和脾脏中显著过量产生(Melani等人，2003年;Serafini等人，2006年)以及癌症患者的外周血(Almand等人，2001年;Young和Lathers，1999年). 在小鼠中，它们表达CD11b，这是巨噬细胞系髓样细胞的标记，也是粒细胞的标记Gr-1，因此它们也称为Gr+CD11b+细胞。在人类癌症患者中，Gr-1+CD11b+髓系细胞被鉴定为谱系（CD3、CD14、CD19和CD57）和HLA-DR阴性（Lin负极人类白细胞抗原-DR负极)或未成熟的树突状细胞。自20世纪80年代以来，已证明Gr-1+CD11b+髓系细胞具有免疫抑制作用(Almand等人，2001年;Bronte等人，2000年;Gabrilovich等人，1996年;Serafini等人，2006年;Serafini等人，2004年;Young和Lathers，1999年). 它们代表了肿瘤逃避免疫系统控制的一种机制，并损害了癌症免疫治疗的效果。

最近，发现Gr-1+CD11b+细胞浸润到肿瘤中，并通过产生高水平的MMP9和直接并入肿瘤内皮细胞来促进肿瘤血管生成(Yang等人，2004年). Gr-1+CD11b+细胞也与抗VEGF治疗的肿瘤难治性有关(Shojaei等人，2007年). 尽管有数据表明肿瘤宿主中的过度生产和肿瘤组织中的浸润，但其招募的分子机制以及在肿瘤进展中的作用仍有待研究。在这里，我们显示Gr-1+CD11b+细胞被特异性招募到乳腺癌中，条件缺失Tgfbr2型和4T1肿瘤通过两种不同的趋化因子机制，即CXCL5/CXCR2和SDF-1/CXCR4。这些未成熟的髓细胞通过增加基质金属蛋白酶的产生和功能直接促进肿瘤的侵袭和转移。此外，Gr-1+CD11b+细胞浸润也导致肿瘤微环境中TGFβ的生成增加Tgfbr2型删除。这些发现提高了我们对肿瘤与宿主相互作用的理解。对Gr-1+CD11b+细胞的治疗干预不仅可以增强宿主免疫系统，还可以抑制肿瘤的侵袭和转移。

结果

Gr-1+CD11b+细胞被招募到具有以下基因缺失的乳腺癌中Tgfbr2型尤其是在侵入性前沿

我们之前曾报道过有条件删除Tgfbr2型与具有完整TGFβ信号传导的PyVmT癌相比，在乳腺上皮细胞中也表达PyVmT导致肿瘤潜伏期缩短和肺转移增加(Chytil等人，2002年;Forrester等人，2005年). 我们还报道了Gr-1+CD11b+髓细胞浸润到肿瘤组织并促进肿瘤血管生成(Yang等人，2004年). 为了研究Gr-1+CD11b+细胞在TGFβ介导的肿瘤进展中的作用，在PyVmT基因肿瘤模型中出现可触及的肿瘤后一周收集肿瘤组织，并用Tgfbr2型击倒（Tgfbr2MGKO公司). Tgfbr2肿瘤组织的单细胞悬液MGKO公司和漂浮PyVmT对照小鼠（Tgfbr2flox/flox公司)流式细胞仪分析。我们观察到PyVmT/Tgfbr2中Gr-1+CD11b+细胞显著增加MGKO公司与Tgfbr2相比flox/flox公司控制肿瘤(图1A和B). 肿瘤组织中的Gr-1+CD11b+细胞同时表达Gr-1和CD11b，未发现单独的Gr-1细胞群(图1C). 这使我们能够用抗Gr-1抗体的免疫组织化学染色检查肿瘤组织中Gr-1+CD11b+细胞的精确位置。非常有趣的是，Gr-1+CD11b+细胞主要出现在PyVmT/Tgfbr2的侵袭前沿MGKO公司乳腺肿瘤(图1D). 除了Gr-1+CD11b+细胞外，我们还观察到PyVmT/Tgfbr2中F4/80阳性和VEGFR I阳性细胞的浸润增加MGKO公司肿瘤与Tgfbr2的比较flox/flox公司控制肿瘤(图1E和1F)，尽管没有统计意义。因此，我们将研究集中在Gr-1+CD11b+髓系细胞上。Gr-1+CD11b+细胞的显著增加与这些动物的肺转移增加一致(Forrester等人，2005年)提示这些Gr-1+CD11b+细胞可能在乳腺癌转移中发挥作用。

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Gr-1+CD11b+髓系细胞被招募到具有以下基因缺失的乳腺癌中Tgfbr2型（PyVmT/Tgfbr2MGKO公司)

答：流式细胞术分析PyVmT/Tgfbr2中浸润的Gr-1+CD11b+细胞MGKO公司肿瘤和PyVmT/Tgfbr2flox/flox公司控制肿瘤。所示为典型的流式细胞仪图。B：肿瘤中存在Gr-1+CD11b+细胞的定量数据，如1A所示。对5至7周龄的小鼠进行分析。抄送：流式细胞术分析PyVmT/Tgfbr2中肿瘤细胞Gr-1+CD11b+细胞MGKO公司肿瘤。医生：PyVmT/Tgfbr2侵袭前沿Gr-1+CD11b+细胞的IHCMGKO公司乳腺癌与PyVmT/Tgfbr2的比较flox/flox公司肿瘤。图中显示了比例尺。E和F：流式细胞术分析PyVmT/Tgfbr2中浸润的F4/80和VEGFR1阳性细胞MGKO公司肿瘤和PyVmT/Tgfbr2flox/flox公司控制肿瘤。代表性流式细胞仪图显示在左侧，定量数据显示在右侧。毫克：邻近乳腺组织；图：肿瘤组织。所有定量数据均以平均值±标准误差表示。

Gr-1+CD11b+细胞促进乳腺癌转移

确认我们在PyVmT/Tgfbr2中的观察结果MGKO公司肿瘤，我们使用4T1原位肿瘤模型。这种肿瘤模型与人类乳腺癌有许多共同特征，特别是其自发转移到肺部的能力。此外，与正常乳腺上皮细胞或PyVmT/Tgfbr2相比，4T1肿瘤显示TGFβ对生长的抑制显著降低flox.flox公司癌细胞（数据未显示）。重要的是，在患有大型4T1肿瘤的小鼠的骨髓和脾脏中，Gr-1+CD11b+细胞明显过度生成(图2A). 肿瘤接种后28-35天，Gr-1+CD11b+细胞数量随着肿瘤的生长而增加，其中50%以上在脾脏，80%以上在骨髓。这使我们能够对大量Gr-1+CD11b+细胞进行分类，以研究它们在乳腺癌转移中的作用体内和在体外分析。在4T1乳腺肿瘤中，Gr-1+CD11b+细胞平均占总细胞的7.2%(图2B). Gr-1+CD11b+细胞主要存在于侵袭前沿(图2C)，类似于MMTV PyVmT模型。

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Gr-1+CD11b+细胞促进肿瘤转移

答：接种肿瘤后4T1荷瘤小鼠脾脏和骨髓中Gr-1+CD11b+细胞增加。左侧面板：移植后28天荷瘤小鼠脾脏中Gr-1+CD11b+细胞的流式细胞术分析（每个时间点4只或更多小鼠）。中间面板：脾脏；右侧面板：骨髓（b.m.）。B：流式细胞术分析4T1肿瘤中的Gr-1+CD11b+细胞。抄送：IHC显示在肿瘤接种后15天，4T1肿瘤的侵袭前沿有Gr-1+CD11b+细胞。比例尺，100μM。医生：肿瘤接种35天后4T1荷瘤小鼠肿瘤和脾脏Gr-1+CD11b+细胞的单细胞分选。显示了分选后Gr-1+CD11b+细胞的流式细胞术分析。电子邮箱：当4T1细胞与肿瘤衍生的Gr-1+CD11b+细胞（包括来自肿瘤组织（tu-inf Gr-1+CD11b+）脾脏的Gr-1+CD11b+cells）共同注射时，转移显著增加。以4T1细胞和正常小鼠的Gr-1+CD11b+细胞（非Gr-1+CD11b+）作为对照。使用的动物数量显示在栏中。毫克：邻近乳腺组织；图：肿瘤组织。结果显示为平均值±SE。

为了研究Gr-1+CD11b+细胞在肿瘤转移中的作用，将4T1细胞注射到雌性Balb/c小鼠的乳腺脂肪垫中，将4T1细胞与4T1肿瘤小鼠4T1组织或脾脏中分离出来的Gr-1+CDM1b+细胞混合或不混合。取正常脾脏的Gr-1+CD11b+细胞作为对照。我们获得了95%–98%纯度的分选Gr-1+CD11b+细胞(图2D). 原发性肿瘤在12至14天后被切除，这样可以在肺部形成转移，避免了大型原发性癌引起的发病率或死亡率。在小鼠表现出痛苦的迹象后，采集肺部并计算肿瘤结节数。我们观察到，与4T1单独注射或4T1与正常Gr-1+CD11b+细胞联合注射相比，4T1联合注射来自肿瘤组织或荷瘤动物脾脏的Gr-1+CDM1b+细胞的小鼠肺部肿瘤结节显著增加(图2E). 这些数据证实来源于肿瘤宿主的Gr-1+CD11b+细胞增强了肿瘤转移。

在进一步鉴定Gr-1+CD11b+细胞时，我们发现在Gr-1+CD11b+的细胞群中，约有14%的CD34+、31%的VEGFR1+和44%的F4/80+细胞(补充图1). 这些数据支持我们的假设，即Gr-1+CD11b+细胞由处于不同分化阶段的未成熟髓细胞组成。

Gr-1+CD11b+髓系细胞促进乳腺癌细胞侵袭体内和在体外

非常有趣的是，手术切除原发肿瘤后，4T1细胞与肿瘤衍生的Gr-1+CD11b+细胞联合注射后，原发注射部位的复发肿瘤明显大于对照组(图3A). 此外，我们发现在注射后的前10-14天内，原发性肿瘤的生长没有差异（数据未显示）。这表明来源于肿瘤组织或肿瘤脾脏的Gr-1+CD11b+细胞增加了肿瘤细胞对周围组织的侵袭，支持我们早期的观察，即Gr-1+CD11b+的细胞促进肿瘤转移，因为侵袭是转移过程的第一步。

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Gr-1+CD11b+髓系细胞增加4T1肿瘤侵袭体内和体外

答：4T1细胞与来源于肿瘤组织或荷瘤小鼠脾脏的Gr-1+CD11b+细胞联合注射，增加复发肿瘤的生长。栏中显示了动物数量。结果显示为平均值±SE。B：与肿瘤衍生的Gr-1+CD11b+细胞共同培养时，通过基质涂层跨孔侵入4T1细胞的荧光显微镜观察(B-B型)与正常Gr-1+CD11b+细胞相比(B-a公司). 4T1细胞用绿色追踪染料标记，Gr-1+CD11b+细胞用红色追踪染料标记。B-c：4T1细胞和Gr-1+CD11b+细胞之间的密切相互作用。比例尺，所有数字均为50μM。抄送：MMP抑制剂（GM6001，1mM）阻断Gr-1+CD11b+细胞促进的4T1细胞侵袭在体外。结果来自两个实验，每组三份，以平均值±SE表示。tu-inf Gr-1+CD11b+细胞：肿瘤组织中的Gr-1+CD11b+细胞；tu-sp-Gr-1+CD11b+细胞：荷瘤小鼠脾脏Gr-1+CD11b+细胞；Gr-1+CD11b+细胞：正常小鼠脾脏的Gr-1+CD11b+细胞。毫克：邻近乳腺组织；图：肿瘤组织。

为了进一步研究Gr-1+CD11b+细胞对肿瘤侵袭的影响，我们进行了在体外入侵检测。用绿色细胞追踪染料标记4T1细胞。用红细胞追踪染料标记分选的Gr-1+CD11b+细胞。将含有或不含Gr-1+CD11b+细胞的4T1细胞接种到涂有Matrigel的Transwell过滤器的顶部室中。隔夜培养后，对侵入细胞膜的4T1细胞进行计数（8-10场/过滤器）。我们发现4T1细胞与Gr-1+CD11b+细胞混合后，肿瘤细胞侵袭性显著增加(图3B和3C). 有趣的是，广谱MMP抑制剂GM6001（1 uM）完全减弱了观察到的侵袭(图3C). 这些结果与我们的体内发现Gr-1+CD11b+细胞直接促进肿瘤细胞的侵袭和转移。

此外，我们观察到PyVmT/Tgfbr2的侵袭面积明显增加MGKO公司肿瘤比PyVmT/Tgfbr2flox.flox公司当两种肿瘤类型处于同一阶段且大小相似时(补充图2A和2C). PyVmT/Tgfbr2的侵袭区域MGKO公司肿瘤通常充满大量Gr-1+CD11b+细胞(补充图2B). E-Caddherin的免疫荧光染色在PyVmT/Tgfbr2之间的E-Cadderin表达没有明显变化MGKO公司并控制肿瘤，表明EMT不太可能参与PyVmT/Tgfbr2MGKO公司肿瘤侵袭(补充图2D和2E). 这些数据表明PyVmT/Tgfbr2MGKO公司Gr-1+CD11b+细胞可能通过Gr-1+CD11b+与肿瘤细胞之间的集体事件来帮助肿瘤侵袭。

肿瘤居住的Gr-1+CD11b+细胞显示MMPs的产生和功能升高

基质金属蛋白酶有助于肿瘤的进展和转移(林奇和马特里西安，2002年). 微阵列分析表明，与脾脏细胞相比，肿瘤细胞Gr-1+CD11b+细胞中的MMP14（MT1-MMP）、MMP13和MMP2高度升高（数据未显示）。我们用实时RT-PCR进一步证实了结果(图4A&B). 由于MMP活性的抑制在体外消除了Gr-1CD11b+细胞介导的肿瘤侵袭(图3C)，我们表演了就地使用经明胶酶裂解后释放荧光肽的猝灭荧光底物进行酶谱分析。该试验允许我们直接检测肿瘤组织中Gr-1+CD11b+细胞中MMPs的功能。正如预期的那样，非常强的荧光强度位于肿瘤-乳腺组织界面，我们在那里观察到大量Gr-1+CD11b+细胞(图4C，a-c4T1肿瘤和4C-d MMTV-PyVmT/Tgfbr2MGKO公司肿瘤）。在接受EDTA治疗的对照组中未观察到这种情况(图4C-e). 与在体外数据显示了对金属蛋白酶活性的需求，我们建议肿瘤细胞Gr-1+CD11b+产生多种MMPs，这些MMPs有助于乳腺癌细胞的侵袭。

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肿瘤细胞Gr-1+CD11b+中MMPs的产生和功能增加

MMP14和MMP2的实时RT-PCR(A）以及MMP13(B）来自肿瘤组织的Gr-1+CD11b+细胞与来自脾脏的细胞相比。结果显示为平均值±SE。C、。4T1乳腺癌和PyVmT/Tgfbr2中MMPs的原位酶谱MGKO公司癌症。在4T1肿瘤侵袭前沿观察到丰富的绿色荧光（MMP活性的指示物）(C类-空调)和PyVmT/Tgfbr2MGKO公司癌(C类-d日). 细胞核用7AAD（红色）标记。使用EDTA处理的肿瘤切片作为阴性对照(C-e公司). 比例尺，所有数字为50 uM。毫克：邻近乳腺组织；图：肿瘤组织。

基因缺失乳腺癌中TGFβ生成增加Tgfbr2型

乳腺癌的特征是Tgfbr2型缺失，我们发现它们的TGFβ1水平显著高于未缺失的对照肿瘤Tgfbr2型删除(图5A). 因为更多的Gr-1+CD11b+细胞浸润到肿瘤中Tgfbr2型我们从微阵列分析中获得的初步数据表明，Gr-1+CD11b+细胞产生大量TGFβ1，我们推断，Gr-1+CD11b+cells可能有助于增加这些肿瘤中TGFβ1。我们用ELISA测定了Gr-1+CD11b+细胞中的TGFβ1。来自肿瘤脾脏的Gr-1+CD11b+细胞产生的TGFβ1水平显著高于来自正常脾脏的细胞(图5B，左侧面板）。在有或无乳腺癌来源的3个肿瘤细胞系之间，TGFβ1的产生没有差异Tgfbr2型删除(图5B，右侧面板）。肿瘤切片的免疫组织化学进一步证明TGFβ1阳性细胞大多为基质细胞(图5C)尤其是在侵袭前沿，Gr-1+CD11b+细胞主要存在(图5C). 这些数据支持我们的观察，即Gr-1+CD11b+细胞可能是乳腺癌中TGFβ13生成增加的来源之一，乳腺癌的基因缺失Tgfbr2型.

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基因缺失乳腺癌中TGFβ1的生成增加Tgfbr2型

答：PyVmT/Tgfbr2中TGFβ1生成增加MGKO公司肿瘤与PyVmT/Tgfbr2的比较flox/flox公司肿瘤。n=每组4只小鼠。B左侧面板：与正常脾脏的Gr-1+CD11b+细胞相比，患有大4T1肿瘤的小鼠脾脏的Gr-1+CD11 b+细胞显示出显著更高的TGFβ1生成量。n=2只/组。B右侧面板：在PyVmT/Tgfbr2来源的肿瘤细胞株之间，TGFβ1的产生没有差异MGKO公司肿瘤vs PyVmT/Tgfbr2flox/flox公司肿瘤。ELISA法测定条件培养液中TGFβ1的含量。结果显示为平均值±SE。抄送：Gr-1+CD11b+细胞可能是乳腺癌TGFβ13生成增加的来源，其基因缺失Tgfbr2型.TGFβ1的IHC(左侧面板）显示TGFβ1阳性细胞主要位于侵袭前沿，其中Gr-1+CD11b+细胞主要存在(右侧面板Gr-1染色）。比例尺，两个数字均为50 uM。毫克：邻近乳腺组织；图：肿瘤组织。

Gr-1+CD11b+细胞向肿瘤募集的机制

我们的微阵列分析表明，CXCL5在PyVmT/Tgfbr2中显著增加MGKO公司肿瘤与PyVmT/Tgfbr2的比较flox/flox公司肿瘤（数据未显示）。我们使用已建立细胞系的细胞培养上清液进行ELISA分析，进一步证实了这一观察结果(图6A，左侧面板）。有趣的是，我们还观察到，与c-Neu癌细胞相比，MMTV启动子下显性负II型TGFβ受体（DNIIR）与c-Neu1共同表达的癌细胞中CXCL5的生成增加(补充图3A). 此外，胰腺癌Tgfbr2型删除还显示CXCL5产量增加（Ijichi和Moses，未公布的数据）。这些数据表明CXCL5可能是肿瘤微环境中TGFβ信号缺失或减少的常见机制。进一步分析证实，重组CXCL5增加了Gr-1+CD11b+细胞迁移在体外(图6B)，并使用单克隆抗体中和CXCL5，显著阻止Gr-1+CD11b+细胞对PyVmT/Tgfbr2的迁移MGKO公司细胞条件培养基(图6B). 检测CXCL5/CXCR2在Gr-1+CD11b+细胞招募到肿瘤微环境中的作用体内，我们移植了有或无乳腺癌Tgfbr2型在同基因FVB小鼠的第四乳腺中删除，并允许肿瘤生长14天。然后，我们通过I.P.注射，用2 mg/kg/天的特异性CXCR2拮抗剂SB-265610治疗肿瘤大小相等的小鼠两周。研究表明，SB-265610以1-3 mg/kg/天的剂量使用时，对中性粒细胞的积累具有选择性抑制作用(Auten等人，2001年). 我们发现SB-265610治疗显著抑制Gr-1+CD11b+细胞向乳腺癌的募集Tgfbr2型缺失而非对照肿瘤(图6C)，对肿瘤生长没有显著影响（数据未显示）。从PyVmT/Tgfbr2分离的Gr-1+CD11b+细胞MGKO公司肿瘤组织表达CXCR2，与脾脏Gr-1+CD11b+细胞相比，CXCR2水平略有升高（数据未显示）。这些数据表明，CXCL5的生成增加，而不是相应的CXCR2受体调节PyVmT/Tgfbr2中Gr-1+CD11b+细胞的募集MGKO公司肿瘤微环境。

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Gr-1+CD11b+细胞向肿瘤微环境募集的机制

答：PyVmT/Tgfbr2细胞培养上清液中CXCL5的产生增加MGKO公司乳腺癌。B：Gr-1+CD11b+细胞对CXCL5的体外迁移反应。对培养6-8小时后的Gr-1+CD11b+细胞迁移进行计数和绘制。所示为三个典型实验之一。抄送：抑制Gr-1+CD11b+细胞向PyVmT/Tgfbr2募集MGKO公司CXCR2拮抗肿瘤。PyVmT/Tgfbr2中所有细胞中Gr-1+CD11b+细胞的百分比MGKO公司并绘制对照肿瘤。携带PyVmT/Tgfbr2的小鼠MGKO公司用CXCR2特异性拮抗剂SB-265610以2 mg/kg/天的剂量通过静脉注射治疗对照肿瘤两周。医生：流式细胞术分析CXCR4在4T1肿瘤浸润性Gr-1+CD11b+细胞及PyVmT/Tgfbr2中的表达MGKO公司肿瘤，与相同荷瘤小鼠（如标签所示）脾脏中的肿瘤进行比较。在Gr-1+CD11b+双阳性细胞上检测CXCR4表达直方图。所示为所分析的代表性小鼠之一，每组3-5只。电子邮箱： 体外Gr-1+CD11b+细胞迁移对SDF-1的反应。对培养6-8小时后的Gr-1+CD11b+细胞迁移进行计数和绘制。所示为三个典型实验中的一个。传真：PyVmT/Tgfbr2型MGKO公司单独或同时阻断CXCR2或CXCR4的肿瘤转移。用CXCR2或CXCR4拮抗剂治疗14天肿瘤小鼠3周后，计算肺部肿瘤结节数。所有结果均以平均值±SE表示。

SDF-1/CXCR4趋化因子轴介导包括造血祖细胞在内的多种细胞类型的募集(Burger和Kipps，2006年;Mohle等人，1998年;Peled等人，1999年;Urbich和Dimmeler，2004年). 因此，我们使用流式细胞术分析检测了CXCR4在Gr-1+CD11b+细胞中的表达。与来自荷瘤小鼠脾脏的细胞相比，肿瘤浸润性Gr-1+CD11b+细胞表达的CXCR4显著增加(图6D). 这包括来自4T1和PyVmT/Tgfbr2的Gr-1+CD11b+细胞MGKO公司肿瘤(图6D)这表明，上调CXCR4表达是这些细胞的一个固有特性，而不管它们被招募到的肿瘤微环境是否存在差异。从肿瘤组织中分离的Gr-1+CD11b+细胞迁移以响应重组SDF-1在体外(图6E). 重要的是，使用抗体中和CXCR4显著阻止了这一过程(图6E). 除CXCR4外，CXCR7已被确定为SDF-1的另一个信号受体(Balabanian等人，2005年;Burns等人，2006年). 我们发现约19%的Gr-1+CD11b+细胞为CXCR7阳性(补充图3B). 因此，也可以通过SDF-1/CXCR7招募Gr-1+CD11b+细胞。总之，我们的数据表明，通过SDF-1/CXCR4和潜在的CXCR7相互作用，肿瘤驻留Gr-1+CD11b+细胞被招募到肿瘤组织中。此外，PyVmT/Tgfbr2MGKO公司肿瘤增加了CXCL5的生成，CXCL5也负责向TGFβ信号缺失或减少的肿瘤募集Gr-1+CD11b+细胞。

进一步研究Gr-1+CD11b+细胞招募在PyVmT/Tgfbr2中的关键作用MGKO公司肿瘤侵袭和转移，我们移植了乳腺癌Tgfbr2型在同基因FVB小鼠的第四乳腺中删除，并允许肿瘤生长7天。然后，我们用CXCR2特异性拮抗剂SB-265610以2 mg/kg/天的剂量通过静脉注射给小鼠，或CXCR4拮抗剂AMD3100以1.25 mg/kg/日的剂量通过皮下注射给小鼠治疗，每天两次，或两次同时治疗10天。然后手术切除原发肿瘤。这些小鼠被允许再活三周，以便肺部发生肿瘤转移。评价拮抗剂对肿瘤转移、生长和侵袭的影响。我们发现，与溶媒对照组相比，用CXCR2拮抗剂、CXCR4拮抗剂或CXCR2和CXCR4抑制剂治疗的小鼠肺转移受到显著抑制(图6F). 治疗组和对照组的原发性肿瘤生长无显著差异（数据未显示）。肿瘤组织的H&E染色显示，与溶媒对照组相比，CXCR2和/或CXCR4治疗小鼠的肿瘤侵袭程度降低(补充图2F-J). 这些数据以及来自在体外共同培养(图3B和C)以及体内肿瘤细胞与Gr-1+CD11b+细胞共注入(图3A2E）强烈提示Gr-1+CD11b+细胞在肿瘤细胞侵袭和转移形成中起关键作用。

人类乳腺肿瘤中的未成熟髓样细胞

最后，我们研究了人类乳腺癌中是否存在未成熟髓细胞。我们选择髓过氧化物酶（MPO）作为人未成熟髓细胞IHC的标志物。这是基于：1）通过微阵列分析，来自几种小鼠模型的Gr-1+CD11b+未成熟髓系细胞中MPO的表达显著升高（数据未显示）。2） MPO是一种血液蛋白，在中性粒细胞中大量表达。MPO具有促炎特性并参与肿瘤的发生和发展(Knaapen等人，2006年). 我们检查了8例人类乳腺癌组织。MPO阳性细胞在所有检测样本的侵袭前沿明显丰富(图7A). 其中包括富含胶原蛋白区域的前部(图7A，a–c)和正常乳腺脂肪组织的前部(图7A，d–f)). 两种情况下均发现MPO阳性细胞(图7A、a和d). 这些肿瘤组织的H&E染色进一步支持了我们的观察(图7A、b和e). 为了进一步证实人类乳腺肿瘤组织中的髓样细胞浸润，我们利用流式细胞术技术。我们用抗体鸡尾酒标记新鲜人乳腺导管腺癌（2-3期）的单细胞悬液。这些抗体包括用于血统鉴定的抗体：T细胞的CD3、B细胞的CD19、NK细胞的CD56、树突状细胞的CD40/CD86/HLA-DR和单核细胞的CD14，以及包括CD33、CD34和CD15在内的髓细胞标记物的抗体。髓系标志物通常用于检测骨髓增生异常患者的外周血。肿瘤浸润的未成熟髓样细胞被鉴定为T、B、NK、单核细胞和树突状细胞，CD33、CD34和CD15髓样标记物呈阴性和阳性。对每名患者（共4名患者）的未成熟髓细胞百分比进行评估。我们发现肿瘤组织中平均5.82%+/-2.3的细胞是髓细胞(图7B). 总之，我们的数据表明，未成熟髓细胞不仅参与小鼠模型中的肿瘤侵袭，还可能参与人类乳腺癌。总之，我们的研究结果指出了一种新的策略，通过干扰未成熟细胞向肿瘤的募集来靶向肿瘤转移。

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人类乳腺肿瘤组织中的未成熟髓样细胞

答：髓过氧化物酶IHC染色鉴定人乳腺导管腺癌侵袭前沿骨髓源性未成熟髓样细胞(a和d). 顺序肿瘤切片的H&E染色分别如图b至a和E至d所示。图c和f为阴性对照。比例尺，所有数字为100μM。B：人乳腺导管腺癌（2～3期）单细胞悬液中未成熟髓样细胞的流式细胞术分析。分析的细胞选通为7AAD阴性（左上图，P1），谱系标记阴性，包括T细胞的CD3、B细胞的CD19、NK细胞的CD56、树突状细胞的CD40/CD86/HLA-DR、单核细胞的CD14以及CD33、CD34和CD15阳性（右上面板，P2）。FITC阳性髓系细胞的直方图显示在右下窗格中，同型对照显示在左下窗格中。

讨论

使用MMTV PyVmT鼠标模型，我们演示了删除Tgfbr2型在乳腺癌中，Gr-1+CD11b+髓样细胞特异性地向侵袭前沿募集。我们进一步证明Gr-1+CD11b+细胞通过增加MMP的产生来促进肿瘤的侵袭和转移。TGFβ作为肿瘤抑制因子或肿瘤启动子发挥作用，这取决于肿瘤进展的背景和阶段。我们和其他人已经证明，TGFβ信号转导的缺失Tgfbr2型在几种小鼠模型中导致恶性肿瘤进展（Biswas等人，2004；Forrester等人，2005年;Ijichi等人，2006年;Munoz等人，2006年;Lu等人，2006年). 然而，其他报告显示，与c-Neu或PyVmT结合的乳腺上皮细胞中TGFβ信号的增强会增加肺转移(Muraoka等人，2003年;Muraoka-Cook等人，2004年;Muraoka-Cook等人，2006年). 这些似乎是相互矛盾的观察结果，现在可以用Gr-1+CD11b+细胞募集到肿瘤微环境中来解释。我们的数据表明，乳腺上皮细胞中的自身TGFβ信号传导起到抑癌作用；当它被删除或修改时，会导致Gr-1+CD11b+细胞招募。这导致MMP和TGFβ的生成增加，从而增强肿瘤的侵袭和转移。因此，TGFβ信号作为肿瘤抑制因子向肿瘤启动因子的转换涉及到一个额外的成分，即肿瘤微环境中Gr-1+CD11b+细胞的招募。事实上，在缺乏TGFβ信号的头颈部肿瘤中观察到炎症细胞（CD45和BM8阳性细胞）(Lu等人，2006年). 此外，炎症会导致TGFβ1缺乏小鼠的癌前病变，进而发展为结肠癌(恩格尔等人，2002年). 最近，CCR1+髓系细胞（CD34+）被发现被招募到结肠癌中，Smad4缺失，TGFβ信号的下游信号分子，促进肿瘤侵袭(Kitamura等人，2007年). 这些CCR1+细胞似乎是我们在这里描述的不同的Gr-1+CD11b+细胞，因为它们不表达高水平的Gr-1。

一些证据表明Gr-1+CD11b+对肿瘤转移的作用特别有趣。1） 这些细胞在包括各种肿瘤患者在内的肿瘤宿主体内过度生成。2） Gr-1+CD11b+细胞由分化早期的未成熟髓细胞组成(Almand等人，2001年;Yang等人，2004年). 它们不同于最终分化的肿瘤相关巨噬细胞（TAM），被鉴定为Mac-1（CD11b）和F4/80+，它们已被证明通过提高肿瘤细胞中CSF-1的生成和增强EGF信号来促进肿瘤的进展和转移(Condeelis和Pollard，2006年). 从分析工作中注意到TAM和这些未成熟髓细胞之间的相似性(Biswas等人，2006年)然而，这两个群体之间的差异也很明显。例如，髓样抑制细胞产生高水平的TGF-β1，而TAM中TGF-(Biswas等人，2006年). Gr-1+CD11b+细胞也不同于肿瘤微环境中的其他两种细胞类型，即中性粒细胞和肥大细胞，它们表达Gr-1，但不表达CD11b。3） Gr-1+CD11b+细胞与其他宿主免疫细胞相互作用，包括T、B和NK细胞。这些免疫细胞可能指示肿瘤微环境，即在转移性肝环境中，炎症/免疫反应向抗炎/免疫抑制反应的转变（Th1/Th2-样细胞因子的转变）可能与之有关（Budhu等人，2006年）。目前尚不清楚系统免疫抑制和直接参与肿瘤进展是同一过程的两种不同性质还是不同表现。

我们的数据表明，至少有两个不同的趋化因子轴调节肿瘤组织中Gr-1+CD11b+细胞的募集。一个是SDF-1/CXCR4。有趣的是，来自乳腺肿瘤和Tgfbr2型与对照组相比，缺失或4T1肿瘤高水平表达CXCR4(图6D). 这表明CXCR4在Gr-1+CD11b+细胞中的上调是Gr-1+CDM1b+细胞的固有特性，而不管它们被招募到的肿瘤微环境如何不同。SDF-1/CXCR4与造血干细胞和祖细胞的招募有关(Balkwill和Coussens，2004年;Jin等人，2006年;Mohle等人，1998年;Peled等人，1999年;Urbich和Dimmeler，2004年)支持我们的观察，即Gr-1+CD11b+细胞是造血祖细胞。除了SDF-1/CXCR4趋化因子轴外，乳腺癌Tgfbr2型删除显示CXCL5的产量增加(图6A). CXCL5在前列腺癌相关炎症中的作用(Hochreiter等人，2000年). CXCL5还具有巨大的血管生成潜力(Wente等人，2006年). 有趣的是，在显性阴性II型TGFβ受体/MMTV-C-Neu细胞中也观察到CXCL5的生成增加(补充图3)表明CXCL5可能是肿瘤微环境中TGFβ信号减弱的结果。这些数据提示了Gr-1+CD11b+细胞募集的两种不同机制：CXCR4在Gr-1+CDM1b+细胞中的表达增加是一种固有特性，CXCL5在PyVmT/Tgfbr2中的表达升高MGKO公司肿瘤作为肿瘤微环境线索。当PyVmT/Tgfbr2MGKO公司用CXCR2特异性拮抗剂或CXCR4拮抗剂治疗肿瘤，肿瘤转移显著减少，强烈提示Gr-1+CD11b+细胞在PyVmT/Tgfbr2中起关键作用MGKO公司肿瘤侵袭和转移。

Gr-1+CD11b+细胞可能通过增强包括MT1-MMP（MMP14）、MMP13和MMP2在内的MMPs的产生和功能来促进肿瘤转移。泛MMP抑制剂治疗显著减轻肿瘤侵袭在体外.MT1-MMP在降解细胞外基质中起着关键作用，并允许肿瘤细胞逃避基质增强的生长控制效应(Hotary等人，2003年). 众所周知，MT1-MMP能够激活MMP2和MMP13，两者都与肿瘤侵袭有关(d'Ortho等人，1997年;English等人，2001年;Leeman等人，2002年;Nelson等人，2000年). 我们的结果在体外共同文化(图3B和C)和体内肿瘤细胞与Gr-1+CD11b+细胞共注入(图3A2E）强烈提示这些细胞在肿瘤侵袭和转移中的作用。此外，PyVmT/Tgfbr2MGKO公司与PyVmT/Tgfbr2相比，具有大量Gr-1+CD11b+细胞的肿瘤显示出更大的侵袭面积flox.flox公司肿瘤。此外，用CXCR2或CXCR4拮抗剂治疗的肿瘤显示侵袭性降低。这些数据表明PyVmT/Tgfbr2的侵袭性增加MGKO公司通过Gr-1+CD11b+细胞和髓样细胞提供基质金属蛋白酶的肿瘤细胞之间的集体事件，Gr-1+CD11b+可能对肿瘤有帮助。我们不能排除Gr-1+CD11b+细胞产生的其他因子对肿瘤细胞侵袭的影响，但我们的结果强烈表明，蛋白水解活性的诱导是主要的影响因素。此外，正如我们之前报道的那样，Gr-1+CD11b+细胞的肿瘤生长和转移促进作用也可能是由于它们对血管生成的影响(Yang等人，2004年).

肿瘤滤过性Gr-1+CD11b+髓系细胞可能是TGFβ13生成增加的主要来源之一，在基因3缺失的乳腺癌中观察到Tgfbr2型(图5). 肿瘤切片的IHC显示TGFβ1阳性细胞主要是基质细胞(图5C)尤其是在侵袭前沿，Gr-1+CD11b+细胞最为丰富。我们的观察得到了最近一份出版物的支持，该出版物表明Tgfbr2型缺失，基质中TGFβ1表达增加(Lu等人，2006年). 我们现在已经证明Gr-1+CD11b+细胞是这些基质细胞的组成部分。此外，由于Gr-1+CD11b+细胞产生高水平的TGFβ1，它们可能对肿瘤逃避宿主免疫检测产生重要影响。

总之，我们已经证明，乳腺癌中II型TGFβ受体基因的缺失通过两种不同的机制导致Gr-1+CD11b+髓系细胞的募集：SDF-1/CXCR4作为Gr-1+CD11b+细胞的内在机制和CXCL5/CXCR2。Gr-1+CD11b+细胞通过增强MMP和TGFβ的产生直接促进肿瘤转移(图8). Gr-1+CD11b+细胞产生/募集的细胞和分子靶向性不仅可以提高宿主免疫监视，还可以抑制肿瘤转移，具有“一石二鸟”的效果，并提供额外的治疗选择。

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TGFβ信号转导缺失导致肿瘤进展增强的机制

乳腺癌中II型TGFβ受体基因的缺失导致CXCL5的产生增加，CXCL5与Gr-1+CD11b+细胞上的CXCR2相互作用，从而将细胞招募到肿瘤微环境中。Gr-1+CD11b+细胞作为造血细胞，表达高水平的CXCR4，其在肿瘤微环境中与SDF-1相互作用，并且也被募集。Gr-1+CD11b+细胞通过高表达MMP14、MMP13和MMP2促进肿瘤侵袭。此外，Gr-1+CD11b+细胞产生高水平的TGFβ1，抑制宿主免疫监视。

实验程序

细胞系和小鼠

获得4T1乳腺癌细胞系，并按照标准细胞培养技术进行保存。MMTV-PyVmT/Tgfbr2MGKO公司并按照描述建立了悬浮的对照细胞系(Forrester等人，2005年). 8至10周龄雌性Balb/c小鼠购自Harlan Inc.（印第安纳波利斯）。Tgfbr2型flox/flox公司，Tgfbr2MGKO公司，MMTV-PyVmT/Tgfbr2flox/flox公司和MMTV-PyVmT/Tgfbr2MGKO公司按照描述建立和维护小鼠(Forrester等人，2005年). 这些研究由范德比尔特大学医学中心IACUC批准。

流式细胞仪分析

单细胞悬液由正常和荷瘤小鼠的脾脏和骨髓制成(Yang等人，2004年)和肿瘤组织(Ljung等人，1989年). 用荧光结合抗体（BD-PharMinen）和等型匹配的IgG对照物标记这些细胞。细胞在FACScan流式细胞仪（Becton Dickinson）上进行分析。

单细胞分选

用荧光标记抗体对正常小鼠或荷瘤小鼠的脾细胞进行染色，并用FACStarPlus进行分类®流式细胞仪（Becton Dickinson）。收集Gr-1+CD11b+细胞进行肿瘤生长、侵袭和迁移实验。

4T1乳腺肿瘤转移模型

4T1（5×105细胞），无或有Gr-1+CD11b+细胞（0.5×105)，注射到雌性Balb/c小鼠的乳腺脂肪垫中。在接种肿瘤后12-14天，将原发肿瘤完全切除并称重。4周后处死小鼠，检查肺转移情况。此外，还记录了初次注射部位复发肿瘤的重量。

全肺安装

麻醉剂过量导致小鼠死亡。肺按照描述进行处理(Jessen等人，2004年). 然后对肺部肿瘤结节进行计数。

免疫组织化学和免疫荧光

石蜡包埋肿瘤切片固定在4%多聚甲醛中，并与大鼠多克隆抗Gr-1抗体（BD Pharmingen）、兔多克隆抗骨髓周氧化酶（Abcam）或抗TGFβ1（Pharminggen）孵育。A生物素化2第应用抗体，然后与链霉亲和素结合的HRP孵育。用二氨基联苯胺（Vectastain ABC试剂盒，Vector Laboratories）对过氧化物酶活性进行定位。对于免疫荧光，将抗E-钙粘蛋白抗体（BD转导实验室，1:500稀释）应用于石蜡包埋的肿瘤切片，使用Alexa面粉488缀合的山羊抗小鼠第二抗体（Molecular Probes，10ug/ml）来检测E-钙粘蛋白的表达。

趋化因子的免疫测定

使用商业试剂盒（R&D Systems）通过ELISA分析条件培养基和组织裂解液中CXCL5、TGFβ1的表达。

体外细胞迁移和侵袭检测

为了进行细胞迁移，将Gr-1+CD11b+细胞（50000）接种到transwell过滤器的顶部腔室（8 uM，VWR Scientific）。将过滤器置于含有重组小鼠SDF-1或同型对照100 ng/ml培养基的24孔板中。为了中和CXCR4，将10 ug/ml的CXCR4单克隆抗体添加到跨孔顶部室中。孵育6–8小时后，对迁移的Gr-1+CD11b+细胞进行计数（5–7个场/孔，每个实验组一式三份）。在体外侵袭试验中，用绿色荧光染料CMFDA（分子探针）标记4T1细胞。用红色荧光染料CMTMR标记Gr-1+CD11b+细胞。将4T1细胞（30000）单独或与Gr-1+CD11b+细胞（3000）一起接种到涂有Matrigel（Becton-Dickinson）的跨阱过滤器的顶部室中。将过滤器置于含有10%FCS RPMI培养基的24孔板中。培养6-8小时后，对入侵的4T1细胞进行计数（每个实验组3个场/过滤器，一式三份）。

体内抑制乳腺腺癌Gr-1+CD11b+细胞募集

MMTV-PyVmT/Tgfbr2MGKO公司和MMTV-PyVmT/Tgfbr2flox/flox公司供体小鼠的肿瘤被切成约1mm三并植入同基因FVB受体小鼠的#4乳腺脂肪垫中。如前所述，两周后确定肿瘤大小(Yang等人，2004年). 将CXCR2特异性拮抗剂SB-265610（GSK Pharmaceuticals）以2 mg/kg/天的剂量通过静脉注射治疗肿瘤大小相似的小鼠两周（DMSO作为载体）。治疗结束时再次测量肿瘤大小。关于CXCR2和CXCR4阻断对PyVmT/Tgfbr2的影响MGKO公司肿瘤转移后，将小鼠植入肿瘤7天，然后按照上述方法使用SB-265610或CXCR4拮抗剂（AMD3100，Sigma，1.25 mg/kg/天，每天两次通过皮下注射，PBS作为载体）或两者同时使用10天。然后手术切除原发肿瘤。在不进行进一步治疗的情况下，允许小鼠再存活三周，以进行肺转移。对转移结节进行计数。切除原发肿瘤，称重并进行HE染色。

基质金属蛋白酶的原位酶谱

将底物（DQ明胶、分子探针）溶解在2%明胶和2%蔗糖的PBS+0.02%叠氮化钠的混合物中，最终浓度为25 ug/ml。然后将100 ul该溶液涂在载玻片上，在冰上放置10分钟，然后在室温下保存至第二天。蛋白酶抑制剂，包括Aprotinin（2 ug/ml）、Leupetin（100μM）和pepstatin被包括在底物溶液中，以排除除MMPs之外的其他蛋白酶活性。阴性对照组使用金属蛋白酶抑制剂EDTA（25 mM）。将冰冻肿瘤切片（5–10 um）直接切至涂布载玻片上，将载玻片在30°C的黑暗中孵育24–36小时。然后使用带有50 nM 7AAD（核酸染色剂，分子探针）的节水型荧光贴装剂安装载玻片。然后在荧光显微镜下检查载玻片。

定量RT-PCR

使用RNeasy Mini Kit（QIAGEN Inc.）从分类的Gr-1+CD11b+细胞中提取总RNA。cDNA是用In Vitrogen上标合成的tm（tm）RT-PCR第一流合成系统。使用MMP2、MMP13和MT1-MMP特异性引物，并使用BioRad iCycler iQ SYBR Green PCR试剂盒（BioRad Laboratories）测定相对基因表达。使用比较阈值循环方法计算标准化为β-肌动蛋白作为基因参考的基因表达。引物是使用Beacon Designer 4软件设计的，由Operon（Qiagen公司）合成。可根据要求提供引物序列。

人类乳腺肿瘤组织

人类乳腺导管腺癌（2～3期）是从中国天津肿瘤研究所手术患者中收集的，并获得了书面同意。样品在冷PBS中冲洗，并放入添加FCS的RPMI中。然后对样品进行处理，以获得如前所述的单细胞悬浮液。然后用荧光结合抗体（BD-PharMinen）和等型匹配的IgG对照物标记细胞。细胞在FACSaria流式细胞仪上进行分析（Becton Dickinson，Mountain）。

统计分析

所有数据均通过Student t检验进行分析，以平均值±SE表示，当p值<0.05时，差异具有统计学意义。

补充材料

01

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致谢

我们感谢Carlos Arteaga博士对手稿的批判性阅读。我们感谢肯塔基州伯里亚学院的Leigh Moberly和Mergan Jackson在暑期实习期间对这些研究所做的贡献。我们感谢VA FACS核心、范德比尔特FACS核心和小鼠病理学和免疫组织化学核心的技术援助（部分资金由CA068485拨款提供）。我们感谢Barbara Fingleton博士对原位酶谱分析的建议。这项工作得到了哈罗德·摩西（Harold Moses）CA085492、CA102162和U54 CA126505、查尔斯·林（Charles Lin）CA108856和林恩·马特里西安（Lynn Matrisian）CA126506的资助，以及李阳（Li Yang）P30 DK58404（布伦特·波尔克）试点拨款和乳腺SPORE 5P50CA098131（Carlos Arteaga）职业发展奖的支持。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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