鼻腔腺病毒载体人免疫缺陷病毒疫苗增强黏膜免疫球蛋白A反应及其在中枢神经系统的定位

DNA疫苗。

pVRC 2805、2801和4306质粒分别表达HIV-1的gp145ΔCFI、gp140ΔCFI和Gag/Pol/Nef融合蛋白(12; W.-P.Kong等人，未公布数据）。质粒pVRC 2805和pVRC 2801以修饰形式表达HIV-1包膜（在切割位点、融合域和七肽重复序列1和2的间隔中缺失，称为ΔCFI）、gp145ΔCFI和gp140ΔCF1，先前证明它们能够诱导细胞毒性T淋巴细胞和抗体反应(12).

对于Pol基因，为了确保Pol蛋白在引入动物个体时没有任何不良功能，在Pol结构中进行了蛋白酶（PR）、逆转录酶（RT）和整合酶（in）的三个突变，称为Pol（ΔPRΔRTΔin）。来自B分支的Nef构建物是以一种修饰形式制成的，缺乏下调主要组织相容性复合体I类和CD4分子的能力。我们使用了具有不同抗原的融合蛋白的概念；基于Gag plus Pol（ΔPRΔRTΔIN）构建Gag-Pol-Nef结构体的融合形式，并在氨基末端融合修饰的Nef。

表达HIV基因的质粒是用序列合成的，这些序列旨在破坏限制蛋白质表达的病毒RNA结构，或通过密码子修饰使表达Rev不依赖于人类细胞中的表达(2,33,34,36,37,39). cDNA在表达载体pVR1012中克隆(12,52).

对于Gag-Pol-Nef融合蛋白，使用来自HXB2的Gag多聚蛋白（Pr55，氨基酸1至432）的蛋白质序列。合成的Gag基因制造所有成熟的Gag蛋白，但最后两个除外，后者通常从Gag多蛋白的羧基末端p1和p6（氨基酸433到500）裂解。将合成的Gag基因与编码NL4-3的Pol多聚蛋白（氨基酸3至1003）的序列连接在框架中。为了避免Gag-Pol多蛋白的翻译框架移位，核衣壳蛋白最后四个氨基酸的合成编码区通过Gag的其余部分加上Pol的另外三个氨基酸被替换为相应的病毒序列（HXB2基因组上的核苷酸2074到2302）来自NL4-3。删除的移码（ΔFS）蛋白在Gag和Pol序列之间有五个T核苷酸被删除。此外，通过突变氨基酸553（R到G）使PR失活，RT在氨基酸771（D到H）处突变，In突变在Gag-Pol氨基酸1209（D到A）处。将无任何突变的密码优化Nef基因融合到Gag（ΔFS）Pol（ΔPRΔRTΔIN）的Pol基因下游。

重组腺病毒（ADV）疫苗。

高效生成重组腺病毒载体已在前面描述过(4). 本研究中使用的腺病毒穿梭载体pVRC 1290来自AdApt载体（荷兰莱顿Crucell），用牛生长激素poly（A）和loxP位点替换现有poly（A）。为了构建编码gp140ΔCFI的腺病毒载体Xba公司我/巴姆将来自pVRC2801的HI gp140ΔCFI片段插入Xba公司我/巴姆pVRC 1290的HI。为了构建HIV-1 Gag-Pol的腺病毒载体编码萨尔我/千磅通过删除萨尔我站在4195号位置。病毒在293细胞上繁殖，并通过氯化铯梯度纯化。

免疫接种。

用质粒DNA肌肉内（i.m.）和腺病毒载体腹腔或鼻内（i.n.）免疫小鼠。用于质粒DNA（100μg）或ADV载体（10¹⁰颗粒），小鼠(n个=5）注射200μl，平均分为两股四头肌。通过轻轻麻醉小鼠进行免疫接种(n个=5），然后涂抹20μl ADV（10¹⁰微粒）通过微量吸管进入鼻孔。

在存在或不存在对ADV载体的预先免疫的情况下，测试各种免疫途径的效果。为了诱导预先存在的免疫，在初次接种前9周用控制载体（delta E1 ADV）免疫小鼠(5)剂量为10¹⁰如图所示，静脉注射或静脉注射微粒。然后，对启动和增强的各种免疫途径组合进行测试：ADV i.m.启动和ADV i.m增强（ADV i.m/ADV i.m.）、ADV i.n./ADV i.n.、DNA i.m./AVD i.m.和DNA i.m./ADV i.n.。对于ADV单独方案，小鼠在第9周启动，在第14周增强。对于DNA/ADV方案，小鼠在第9、10和11周接受三次DNA，然后在第13周注射ADV。

所有样本（血液、粪便、唾液和阴道分泌物）均在每次免疫后1周和处死时，即加强后13周采集。通过收集四个新鲜的排泄粪便颗粒，将其混合在粪便提取物缓冲液（磷酸盐缓冲液[PBS]、0.1%叠氮化钠）中，并在室温下旋转15分钟，制备粪便提取物。在Eppendorf微型离心机中以13000 rpm的转速将旋涡混合物离心10分钟，收集上清液并将其储存在−20°C下，直至进行分析。通过向小鼠腹腔注射50μl匹罗卡品（PBS中的0.5%[wt/vol]）（密苏里州圣路易斯市西格玛）来收集唾液分泌物，以诱导唾液分泌。收集大约100μl唾液，并将其储存在−20°C下。阴道灌洗是通过用50μl PBS冲洗阴道三次获得的。收集的所有样品在−20°C下保存，直到进行分析。

HIV-1特异性免疫球蛋白G（IgG）和IgA分析。

使用涂有HIV-1抗原（病毒裂解物和大肠杆菌重组，遗传系统rLAV EIA；华盛顿州雷蒙德生物实验室）。小鼠血清和分泌物在PBS、1%胎牛血清和0.02%吐温20（稀释缓冲液）中稀释。血清从1:1000连续稀释至1:128000。分泌物稀释如下：粪便，1:10；唾液，1:2；阴道分泌物，1:5。将血清和分泌物稀释液加入到HIV-1涂层的平板中，并在4°C下孵育过夜。然后用PBS-0.2%吐温20清洗板五次，并在室温下与辣根过氧化物酶结合的山羊抗鼠IgG（1:5000；Chemicon International Inc.，Temecula，Califor.）或辣根过氧化物结合的山羊防鼠IgA（1:500；Zymed Laboratories Inc.，San Francisco，Calif.）孵育1小时。将平板清洗五次，并向每个孔中添加100μl OPD过氧化物酶底物（Sigma）。30分钟后，通过添加50μl 2N H停止反应₂SO公司₄在酶联免疫吸附测定（ELISA）阅读器上在490 nm处读取平板。

细胞因子分泌分析。

对治疗动物的脾脏进行无菌清除，通过将脾脏穿过金属网制备单细胞悬浮液。通过将脾细胞悬浮在Pharmlyse缓冲液（Pharmingen）中来溶解红细胞。然后清洗细胞，10⁶使用2.5μg/ml的HIV-1肽库（覆盖整个细胞的15肽）刺激细胞堵住（122个肽），波尔（248肽），以及环境价值HIV-1 B亚型（158肽）基因；每个肽之间有11个残基重叠）。在存在1μg/ml的抗CD28和抗CD49D抗体（BD Pharmingen）的情况下进行刺激。使用25 ng/ml的佛波肉豆蔻酸酯（Sigma）和1μg/ml的离子霉素（Sigma-）作为刺激物进行阳性对照刺激。阴性对照组包括非刺激细胞和用无关肽库（埃博拉病毒糖蛋白特异性肽）刺激的细胞。首先在37°C下进行刺激1小时。然后添加Brefeldin A（10μg/ml）（Sigma）以抑制细胞因子分泌，并通过在37℃下再培养5小时来完成刺激。

染色时，丢弃刺激培养基和细胞（10⁶)在4°C下用抗CD16/CD32抗体（5μg/ml）（BD Pharmingen）处理15分钟。细胞在900×克4°C，持续3分钟，将细胞颗粒重新悬浮在150μl的Cytofix/Cytoperm（BD Pharmingen）中，并在室温下培养20分钟。用PBS-0.1%皂苷（Sigma）清洗细胞，并将其重新悬浮在100μl的PBS-0.1%皂甙中，该皂甙含有0.15μg抗CD3藻红蛋白、0.3μg抗-CD哌啶叶绿素a蛋白（PerCP）、，0.6μg抗CD8别藻蓝蛋白、0.375μg抗γ-干扰素（IFN-γ）异硫氰酸荧光素和0.188μg抗肿瘤坏死因子α（TNF-α）异硫氰荧光素酶。将细胞与这些抗体在4°C下孵育25分钟。然后通过流式细胞术对细胞进行清洗和分析，以进行细胞内IFN-γ和TNF-α染色。

静脉注射后腺病毒载体的生物分布。

如前所述，制备了一种编码胎盘碱性磷酸酶（PlAP）的重组ADV，用作报告基因(三). 用10只雌性BALB/c小鼠（每组3只）进行免疫¹⁰或2×10¹⁰PlAP-ADV颗粒。阴性对照组（三只动物）在鼻孔中接受20μl PBS。通过牺牲动物进行组织学检查，在腺病毒给药后2天和7天监测载体的生物分布。通过苏木精-伊红染色玻片和碱性磷酸酶（AP）染色玻片的显微镜观察，检查各种器官（中耳、大脑、腹股沟淋巴结、卵巢、肝脏、脾脏、肾脏、心脏、甲状腺、胸腺、骨髓、肺、鼻甲和嗅球）的组织学(第页-硝基蓝四氮唑氯化物-5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，甲苯胺盐染色，然后进行甲基绿复染）。

全身和粘膜免疫小鼠的免疫球蛋白生成。

用ELISA分析全身体液反应，以表征HIV-1特异性IgG反应。在所有组中，在腺病毒增强10天后检测到IgG抗体（图。​（图4）。4). 通过Wilcoxon秩检验，具有ADV免疫的小鼠产生的IgG水平显著低于没有抗ADV载体免疫的小鼠。在没有预先存在免疫的小鼠中，注射ADV并增强的小鼠产生的抗体水平显著低于所有其他组。其他三组的IgG反应相似，DNA/ADV方案的结果优于ADV方案。

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图4。

先前对ADV的免疫抑制了使用rADV或DNA启动和病毒载体增强免疫诱导的系统体液免疫反应。在存在或不存在对腺病毒载体的预先存在的免疫力的情况下，使用各种途径（i.m.或i.n.），从用各种方案（单独的rADV或DNA/ADV）免疫的BALB/c小鼠的血清中检测HIV-1特异性IgG抗体。在暴露前（封闭栏）和增强后（开放栏）采集血样。血清样本按1:1000稀释，并按前述方法进行ELISA分析（见材料和方法）。数据表示为具有标准偏差的平均值。

免疫接种和静脉注射相结合。

由于静脉注射ADV，单独或与DNA启动相结合，不会比静脉注射诱导产生显著更高的抗HIV-1 IgG或T细胞反应，因此对同时静脉注射和静脉注射进行测试，以确定其是否会进一步改善免疫反应。分析了ADV或DNA/ADV的各种组合（表​（表1），1)，并在ADV增强10天后使用细胞内流式细胞术分析IFN-γ和TNF-α的T细胞反应。仅用ADV免疫的所有组均表现出类似的CD4反应（图。​（图5A）。第5页). 用DNA/ADV i.m.免疫的小鼠产生了显著更高的反应(P（P）=0.02）。在DNA/ADV和Env肽中观察到类似的反应（图。​（图5A，第5页,P（P）= 0.02). 注射和注射联合免疫产生的反应介于两种途径之间。所有的DNA/ADV协议，无论通过何种途径，都比任何单独的ADV协议（图。​（图5A，第5页,P（P）= 0.01). 当用波尔肽刺激时，所有组的小鼠细胞都给出了类似的结果。任何组的HIV-特异性（Gag、Pol和Env）CD4反应均显著高于用无关肽刺激的相应组。

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图5：。

使用i.n.途径免疫比使用i.m.途径免疫诱导的细胞免疫反应更低，但这种反应可以通过i.n.和i.m.联合免疫途径部分缓解。用不同的途径（i.m.、i.n.或i.m.加i.n.）对用不同方案免疫的BALB/c小鼠（rADV单独或DNA/ADV）的HIV-特异性细胞免疫反应进行量化。最后一次免疫后10天，在小鼠处死时，从脾脏T细胞测定HIV-特异性IFN-γ和TNF-α分泌物。用Gag、Pol和Env肽池体外刺激脾细胞，并用流式细胞术计数产生IFN-γ和TNF-α的细胞。显示了不同组中每只动物产生IFN-γ和TNF-α的CD4（A）和CD8（B）T细胞的百分比。条形代表几何平均值。对照图表示各组用无关肽池刺激的脾细胞。

HIV-特异性CD8应答证实了上述CD4细胞的结果（图。​（图5B）。5亿). 对于受Gag肽刺激的小鼠，免疫途径的效果不如静脉注射(P（P）DNA/ADV为0.01）；然而，DNA/ADV协议中两种增强途径的结合大大挽救了(P（P）=0.03）通过i.n.途径获得的低细胞反应。其他两种兴奋剂（Pol和Env）也证实了这一观察结果。

免疫后的体液反应分析使用HIV-特异ELISA进行（图。​（图6）。6). 使用各种途径和载体（ADV单独或DNA/ADV、i.m.、i.n.或i.m.和i.n.）对小鼠进行免疫，可诱导血清中IgG的类似滴度（图。​（图6A）。6A级). 相反，通过免疫接种在唾液中诱导了较高水平的IgA反应（图。​（图6B）。6亿). 在仅用ADV免疫的小鼠中，静脉注射和增强的动物中HIV-特异性IgA水平最高，而静脉注射并没有诱导任何IgA反应。对于DNA/ADV方案，静脉注射ADV也能诱导最高的IgA反应。静脉注射和静脉注射联合疫苗诱导的IgA反应与各自相比是中等水平的。血清、粪便和阴道分泌物中的IgA抗体反应模式通常与唾液中的相似（数据未显示），证实了i.n.途径在不同粘膜部位诱导IgA抗体的能力。如图所示，在这些分析中，总IgA水平的数值没有标准化；然而，随后对所有组的样品进行了总IgA的分析，并且具有可比性（数据未显示），这表明在免疫小鼠中观察到的HIV-特异性IgA增加不是由于采集方法引入的稀释效应所致。

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图6。

i.n.免疫途径在粘膜水平诱导的体液免疫反应大于i.m.免疫途径，两者结合可诱导中间反应。在用各种方案免疫的小鼠的血清和唾液中检测HIV-1特异性IgG和IgA抗体。如材料和方法所述，用ELISA检测免疫前动物（白条）或免疫后10天动物（黑条）的血清（A）和唾液（B）中的IgG。

我们感谢Nabel实验室成员的有益评论和讨论，感谢Ati Tislerics的手稿准备，感谢Nancy Sullivan对手稿的批评，感谢Mathew Starost参与组织学分析，感谢Mario Roederer对统计分析的帮助，感谢Karen Stroud和Toni Miller对数字的准备。