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乳腺癌研究。2007; 9（5）：R74。
2007年10月26日在线发布。 数字对象标识：1783年10月1186日
预防性维修识别码：项目经理2242672
PMID：17963511

用血清HER2水平和循环肿瘤细胞测定HER2状态在原发肿瘤为HER2阴性或未知HER2状态的复发性乳腺癌患者中的应用

坦尼娅·费姆,通讯作者1 斯文·贝克尔,1 Silke Duerr-Stoerzer公司,1 卡尔·索特拉尔,2 沃尔克马尔·米勒,三 迪瑟姆·沃维纳,1 南希·莱恩,4 埃里希·索洛梅耶,1和乔纳森·乌尔4
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

介绍

在确定转移性疾病时，如果在首次诊断时未确定HER2状态，并且在疾病进展过程中获得HER2阳性，则评估人类表皮生长因子受体（HER）2状态可能有助于优化治疗决策。在这种情况下，血清HER2的测定或循环肿瘤细胞（CTC）中HER2状态的评估可能具有临床意义，因为由于其定位，可能很难获得用于分析的转移组织。因此，本研究的目的是确定原发肿瘤为HER2阴性或未知HER2状态的转移性乳腺癌患者的血清和相应CTC中HER2状态。

方法

血液样本取自77例转移性乳腺癌阴性患者(n个=44）或未知(n个=33）HER2状态。使用商业HER2/neu ELISA试剂盒测定血清HER2。CTC通过免疫磁性富集的玻片法检测，并通过表型和基因分型进行表征。或者，使用基于RT-PCR的商业试剂盒检测和表征CTC。

结果

77例转移性疾病患者中有20例血清HER2水平升高。对67例患者的血样进行CTC分析。21例可检测到CTC的患者中有8例出现HER2扩增。使用至少一种方法，77名患者中有23名HER2阳性。在21名患者中有15名（71%）观察到CTC的HER2状态与血清HER2一致。在6名患者中获得了相互矛盾的结果。三名血清HER2水平升高的患者的HER2阴性CTC，而三名HER2阳性CTC的患者的血清HER2浓度正常。

结论

HER2初始阴性或未知状态的亚组患者在发生转移性疾病时血清HER2水平和/或HER2阳性CTC升高。虽然只对少数患者进行了研究，但我们的观察结果具有临床相关性，因为目前这些患者无法获得HER2靶向治疗。

介绍

人类表皮生长因子受体（HER）2是一种跨膜酪氨酸激酶生长受体蛋白，由染色体17q21上的原癌基因编码。大约20%至25%的侵袭性原发性乳腺癌中HER2原癌基因扩增或过度表达[1-三]. HER2阳性状态与侵袭性肿瘤行为以及对细胞毒性和内分泌治疗的抵抗有关[三-5]. HER2扩增或过度表达的患者有资格接受曲妥珠单抗（Herceptin）治疗®)，一种针对HER2的单克隆抗体。曲妥珠单抗抑制肿瘤细胞增殖体内和在体外增强化疗敏感性[6,7]. 它已被批准用于转移性乳腺癌的临床治疗。根据最近四项大型曲妥珠单抗试验（赫赛汀佐剂试验、中北癌症治疗组N9831试验、国家手术佐剂项目-31和乳腺癌国际研究组006）的报告结果，曲妥珠单抗也可用于HER2阳性原发性乳腺癌的辅助治疗[8-10]. 除了曲妥珠单抗外，最近还开发了其他治疗策略以靶向HER2蛋白，如酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼，曲妥珠单抗治疗失败后似乎具有临床活性[11].

选择HER2靶向治疗患者的方法是基于免疫组化检测HER2过度表达和荧光显示HER2基因扩增就地初级组织杂交[12]. 然而，原发性肿瘤的抗原谱可能与转移性疾病的抗原谱不同。在7%至20%的病例中观察到原发肿瘤和远处转移之间的差异[13-17]. 因此，在疾病进展时对HER2状态的重新评估可能有助于通过识别更多的患者来优化治疗，这些患者可以从曲妥珠单抗或其他针对HER2的治疗方法中获益。由于转移灶的位置，活检可能不是一种选择。

侵入性组织分析的替代方法是确定血清HER2状态。HER2受体的胞外结构域在ADAM（一种去整合素和金属蛋白酶）金属蛋白酶裂解后释放，并可使用ELISA在血清中测定[18]. 血清HER2水平升高与肿瘤组织中HER2过度表达和扩增高度相关[19]. 另一种可能性是通过免疫组织化学或FISH对循环肿瘤细胞（CTC）的HER2状态进行评估，CTC经常在转移性乳腺癌患者的血液中检测到（基于细胞的检测）[20]. 这些方法对HER2状态未知的复发性乳腺癌患者也有帮助。

直到20世纪90年代在许多中心将曲妥珠单抗引入乳腺癌患者的常规临床管理中，或者直到2005年有数据表明辅助曲妥珠单抗治疗有效果，在最初诊断时确定HER2状态才成为标准程序。因此，仍有相当一部分新诊断的转移性患者HER2状态未知。由于档案材料的储存有限（例如，在德国，10年），在许多情况下，原发肿瘤组织将无法用于HER2评估。因此，本研究的目的是确定最初HER2阴性或未知的转移性患者，这些患者可能因转移性疾病时HER2阳性而受益于HER2靶向治疗。我们的方法是测定血清和相应CTC中HER2的状态

材料和方法

患者

分析中包括了77名乳腺癌患者，他们在德国图宾根妇产科或美国德克萨斯大学西南医学院癌症免疫生物学系被诊断为转移性疾病。所有患者均表示知情同意。在开始治疗或改变治疗前采集血样。研究方案得到了当地伦理委员会的批准（A455/2004）。

纳入标准如下：首次诊断为转移性疾病或疾病进展的乳腺癌患者；或者是未知的(n个=33）或HER2状态为阴性(n个=44）。HER2状态未知的患者(n个=33），相应病理部门要求初级存档肿瘤组织进行HER2评估。

血清HER2的评估

血液被抽取到血清管中，并在1000℃下离心克在室温下保持10分钟。血清样本储存在-70°C下。根据制造商的说明，使用癌基因科学HER-2微量滴度ELISA（美国马萨诸塞州剑桥市癌基因科学）测量血清HER-2水平。根据之前使用相同试验的研究结果，选择了15 ng/ml的截止值[21]. 组内变异系数小于5%，组间变异系数为10%。所有血清样本均在德国图宾根妇产科实验室进行分析。

循环肿瘤细胞HER2状态的评价

使用磁流体分析法（方法A）分析癌症免疫生物学部（美国德克萨斯州达拉斯）的血样。使用AdnaTest乳腺癌测试（AdnaGen AG，Langenhagen，Germany；方法B）对妇产科（Tuebingen，German）的患者进行CTC分析。有10名患者未进行CTC分析，因为患者只同意进行血清HER2分析，或者医生没有按照肿瘤细胞分析的标准操作程序提供血样（例如，关于储存温度和使用适当的输血管）。

基于幻灯片的分析

使用与EpCAM（上皮粘附分子）抗体相关联的磁流体进行基于玻片的分析，分离和富集CTC，并使用抗全细胞角蛋白抗体（C11；Sigma，Natick，MA，USA）和HER2（她的81；由美国德克萨斯州达拉斯德克萨斯大学西南医学院J Uhr博士提供）进行表型鉴定。HER2过表达的CTC通过17号染色体着丝粒探针和HER2的局部特异探针进行杂交（美国伊利诺伊州唐纳斯·格罗夫市威西）。基于CTC的分析的细节以及随后的表型和基因分型在其他地方有详细描述[20].

基于RT-PCR的分析

或者，根据制造商的说明，使用基于RT-PCR的商业试剂盒（AdnaTest乳腺癌选择/检测；AdnaGen AG）检测CTC和评估HER2状态[22]. AdnaTest乳腺癌Select/Detect检测CTC的特异性超过90%，灵敏度高于任何一个扩增物0.15 ng/μl的截止值的50%（上皮粘附分子：GA733-2，肿瘤相关粘蛋白：MUC-1，HER2RT-PCR和FISH应产生可比的结果，因为HER2 mRNA的过度表达对应于基因扩增和HER2的过度表达，正如Walch及其同事所证明的那样[23].

转移组织的HER2状态

转移组织HER2状态的重新评估不是研究的一部分，只有在临床医生要求时才进行。使用商用ABC试剂盒（Vectastain；Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）对3-5μm厚的转移组织切片进行免疫组织化学染色。初级抗体（HER2，克隆A0485；Dako，Glostrup，丹麦）在Tris-HCl（pH 7.5）中稀释，并按照制造商的说明应用。由认证病理学家按照DakoHercepTest™推荐的方法对染色程度进行评分。如果Hercep评分为2+，则进行FISH分析以确定HER2基因扩增。

统计分析

分类变量与临床病理因素之间的关系采用χ2测试。统计分析采用SPSS（11.5版；SPSS公司，美国伊利诺伊州芝加哥）。P（P）小于0.05的值被认为具有统计学意义。

结果

转移性乳腺癌患者的临床资料

77名转移性乳腺癌患者被纳入分析。25名患者有内脏转移，13名患者有骨转移，而39名患者有多发（内脏和骨）转移。临床数据总结见表​表1。1。44名患者的原发肿瘤为HER2阴性。33名患者的原发肿瘤HER2状态尚未初步确定。HER2状态未知的患者(n个=33），要求相应的病理学部门对原发性档案肿瘤组织进行HER2评估。由于在大多数HER2状态未知的乳腺癌患者中，首次诊断间隔超过10年，因此只有10名患者的组织可用于HER2分析。对四例局部复发的档案组织进行HER2状态分析。在HER2状态缺失的14例患者中，有5例（36%）发现原发肿瘤为HER2阳性。

表1

患者临床数据

编号%
年龄
 <50年1722
 ≥50年6078
原发性肿瘤大小
 第1页2532
 第T2-4页4052
 客运专线1216
节点状态
 N个o（o）2229
 N个13951
 Nx公司1621
分级
 I至II3545
 三2431
 未知1823
雌激素受体状态
 阴性2026
 积极的4558
 未知1216
孕酮受体状态
 阴性2533
 积极的3950
 未知1317
HER2状态一
 阴性4457
 未知3343
转移灶的定位
 内脏2533
 骨骼1317
 多个/其他3951

本研究共纳入77名患者。一纳入研究时人类表皮生长因子受体（HER）2的状态；在14名患者中，HER2状态可以从档案组织中确定（5名HER2阳性患者和9名HER2阴性患者）。

血清HER2水平

77例转移性疾病患者中有20例（26%）的血清HER2水平高于15 ng/ml。其中12例（45%）最初为HER2阴性。20名患者中有4名（20%）HER2状态未知。HER2水平升高与初始肿瘤大小、雌激素受体或孕激素受体状态以及转移灶的位置无关（数据未显示）。HER2状态未知组HER2阳性患者的百分比与HER2状态阴性组相同（21%对23%）。在首次诊断时，五名HER2阳性肿瘤患者中只有一人的血清HER2水平低于临界值。数据汇总见表​表22.

表2

通过血清HER2、CTC和转移组织重新评估HER2

初级组织
HER2评估总计HER2阴性HER2未知HER2阳性
血清HER2(n个= 77)7753195
 HER2阴性5741 (77)15 (79)1 (20)
 HER2阳性2012 (23)4 (21)4 (80)
CTC HER2公司(n个= 21)一21126三
 HER2阴性138 (67)3 (50)2 (67)
 HER2阳性84 (33)3 (50)1 (33)
转移组织(n个= 10)b条1082-
 HER2阴性86 (75)2 (100)-
 HER2阳性22 (25)0-

156例循环肿瘤细胞（CTC）阴性；10例患者未进行CTC评估。b条转移组织仅在10名患者中可用。HER，人表皮生长因子受体。

循环肿瘤细胞的HER2状态

67名患者的血样可以分析是否存在CTC。采用基于RT-PCR的分析方法对51份血样进行分析。对16例患者进行免疫磁珠分离，然后进行细胞离心（基于玻片的分析）。67例患者中有21例（31%）发现了CTC。CTC检测率与检测方法（基于细胞的检测与基于RT-PCR的检测）无关。使用RT-PCR评估CTC的HER2状态(n个=51）或双重免疫荧光，然后是FISH(n个= 16). 21例CTC患者中有8例出现HER2扩增（38%）。其中两名患者最初HER2阴性。在其中6例患者中，原发性肿瘤的HER2状态尚不清楚。

血清HER2与循环肿瘤细胞HER2状态的相关性

根据CTC的HER2状态或血清，77例患者中有23例（30%）HER2状态阳性。21例患者中有15例（71%）的CTC HER2状态与血清HER2一致。在6名患者中获得了相互矛盾的结果。三名血清HER2水平升高的患者的HER2阴性CTC，而三名HER2扩增CTC的患者的血清HER2浓度正常（表​（表3三).

表3

CTC血清HER2状态与HER2状态的相关性

CTC HER2阴性CTC HER2阳性总计
血清HER2阳性三58
血清HER2阴性10三13
总计13821一

一一致性为71%。CTC，循环肿瘤细胞；HER，人表皮生长因子受体。

血清和转移组织测定HER2状态

表​表44总结了结果。10例患者的HER2状态可以通过转移组织进行重新评估。根据组织免疫分析，两名患者从HER2阴性原发肿瘤转移到HER2阳性转移部位。这两名患者中只有一名患者的血清水平和HER2阳性CTC升高。相反，一名血清和细胞检测HER2阳性的患者，组织分析HER2阴性。

表4

血清、CTC和组织HER2状态

患者ID血清HER2HER2反恐中心HER2组织
#25阴性ND（无损检测）阴性
#93阴性ND（无损检测）阴性
#94阴性ND（无损检测）阴性
#21阴性ND（无损检测）阴性
#92阴性ND（无损检测）阴性
#29阴性ND（无损检测）阴性
#30阴性ND（无损检测）阴性
#91积极的积极的阴性
#12阴性阴性积极的
#17积极的积极的积极的

CTC，循环肿瘤细胞；人表皮生长因子受体；ND，未检测到。

讨论

转移性疾病的发展是一个高度选择性的过程。原发肿瘤中只有一小部分肿瘤细胞能够在不同的器官部位开始转移生长。伴随肿瘤进展的其他基因改变可能在检测到复发之前发生。因此，转移性疾病的表型可能与原发性肿瘤的表型有很大不同。因此，确定复发肿瘤的HER2状态非常重要。然而，从转移部位进行活检以重新评估表型并不是常规方法。此外，转移性疾病不同部位的表型可能不同。基于这些原因，通过CTC或脱落可溶性蛋白对表型进行无创性重新评估是有吸引力的替代方案，可能更准确地反映“肿瘤总负荷的表型”。此外，血清HER2和CTC检测都具有监测治疗效果的额外潜力。

使用这些方法评估HER2状态对于HER2状态未知的复发性乳腺癌患者也很重要。如上所述，有一组新诊断的转移性疾病患者，由于缺乏原发肿瘤组织档案，HER2状态未知。

因此，在这项前瞻性研究中，通过评估77例HER2初始阴性或未知HER2状态的转移性乳腺癌患者的血清HER2，在确定转移性疾病时重新评估HER2状态。可以对67名患者的血液样本进行HER2阳性CTC分析。在10例患者中，可以从转移部位进行活检，以重新评估HER2。据我们所知，这是第一项比较使用不同方法重新评估HER2状态的研究。

用HER2脱落抗原重新评估HER2状态

HER2受体的胞外结构域通过蛋白水解而脱落，可以在乳腺癌患者的血清中检测到。对于美国食品和药物管理局批准的ELISA，最常用的截止水平是15 ng/ml。基于此截断值，正常对照个体的血清HER2为阴性[20]. 首次诊断转移性疾病时，约20%至50%的患者血清HER2阳性[24,25]. 血清HER2水平与HER2组织表达相关，表明HER2阳性转移的频率高于原发性肿瘤中HER2阳性的报道频率，范围为15%至30%[16,23].

转移性疾病时血清HER2阳性与预后不良有关[26-28]. 此外，一些研究表明，血清HER2阳性状态可以预测赫赛汀的治疗反应[29-31]. 此外，血清HER2水平的变化与HER2靶向治疗的临床反应相关，最近对一线曲妥珠单抗治疗的七个试验的汇总分析证明了这一点[32]. 升高的水平表明疾病进展，而降低的水平与治疗反应或稳定的疾病有关[32,33]. 目前，血清HER2检测只有美国食品和药物管理局批准用于监测转移性乳腺癌患者血清HER2水平的变化。

在我们的研究中，测定血清HER2，以重新评估77例HER2阴性转移性乳腺癌患者的HER2状态(n个=53），HER2阳性(n个=5），未知HER2状态(n个=19）。这些患者中，21%在发生转移性疾病时血清HER2阳性。Anderson及其同事观察到，HER2阴性乳腺癌患者转移时的阳性率稍高（34%）[34]Fehm及其同事（34%）[35]使用血清测试。目前，这些患者不适合接受HER2靶向治疗，但根据最近的研究，这些患者很可能对赫赛汀有反应[29].

HER2阳性循环肿瘤细胞的临床意义

肿瘤，包括转移性病变，会将大量肿瘤细胞转移到血液循环中[36]CTC的存在与转移情况具有生物学相关性。基于CTC表型可能反映转移性疾病表型的假设，CTC的特征可能有助于重新评估HER2状态和其他治疗标记物[20]. 然而，这种选择仅限于那些具有可检测CTC的患者。转移性乳腺癌患者报告的CTC阳性率从20%到60%不等[37,38].

在我们的前瞻性研究中，包括67名患者，其中21名患者检测到CTC（31%）。在这21名患者中，有8名患者HER2过度表达（38%）。孟和同事[20]对31例CTC转移患者的HER2状态进行了重新评估。24例HER2阴性肿瘤患者中有9例HER2阳性细胞；这一比率（38%）低于我们观察到的阳性率。这9名患者中有4名接受了含Herceptin的化疗方案。其中两名患者出现部分或完全缓解[20].

Hayes和同事[39]通过流式细胞术评估了19名转移性乳腺癌患者在治疗过程中HER2阳性CTC的数量。在疾病进展过程中，所有病例中CTC的HER2状态从阴性变为阳性(n个= 3). 相反，对曲妥珠单抗治疗有反应的患者失去了HER2阳性细胞分数。孟和同事[40]分析转移性乳腺癌患者单个乳腺癌细胞中尿激酶型纤溶酶原激活物受体和HER2基因的状态。52例原HER2阴性病例中有5例获得HER2阳性。有趣的是，在两名最初HER2阳性的疾病进展患者中，经曲妥珠单抗治疗后，CTC对HER2呈阴性。

所有这些观察性研究（包括本研究）的主要警告是纳入的患者数量较少。因此，必须启动大型临床试验，以进一步评估HER2阳性CTC的获得是否预示着转移性乳腺癌亚组患者对HER2靶向治疗的临床反应。

血清HER2与HER2阳性循环肿瘤细胞的相关性

血清HER2水平升高与乳腺癌组织中HER2过度表达和扩增相关。然而，在一小部分患者中，血清和组织之间的结果不一致。特定组织HER2表达水平的血清HER2浓度差异可能是由参与HER2裂解的不同水平的激活剂引起的，例如金属蛋白酶[41]. 莫利纳及其同事[42]证明细胞外结构域的裂解导致细胞内酪氨酸激酶的磷酸化增加，导致受体活化增加。然而，血清HER2和HER2过度表达都可以预测对赫赛汀治疗的反应。预测治疗反应的最佳方法尚未确定。在本研究中，我们比较了CTC和舍弃HER2的HER2状态。在比较原发性乳腺癌患者血清和组织HER2水平的研究中，也报告了类似的不一致率[34,35]. 这些结果支持HER2脱落可能反映HER2脱落机制活性的假设，因此不一定与组织或CTC中HER2扩增和/或过度表达完全相关。在本研究中的一小部分患者中，可以检测转移组织是否存在HER2过度表达。8名患者的血清HER2和组织HER2分析均为阴性。10名患者中有2名（20%）出现HER2阳性转移。通过血清分析和细胞检测，两名患者中只有一名HER2阳性。然而，对于单个肿瘤中HER2状态的异质性观察却很少受到关注，这可能导致不同HER2状态测量方法之间的不一致，以及它们与传统病理分析的相关性。

结论

我们的研究表明，在HER2初始阴性或未知状态的患者中，在确定转移性疾病时可以检测到血清HER2水平升高和/或HER2阳性CTC。然而，28%使用血清和CTC进行HER2再评估的患者获得了不一致的结果。原发性乳腺癌中HER2水平也存在类似的不一致性，但CTC的HER2状态可能不会出现这种不一致性。因此，我们假设不同的机制可能是HER2脱落而不是其表达的原因。应进一步研究HER2靶向治疗的临床反应与每种方法的结果之间的相关性，以帮助确定何时应进行此类治疗。

缩写

CTC=循环肿瘤细胞；ELISA=酶联免疫吸附试验；FISH=荧光就地杂交；HER=人表皮生长因子受体；RT-PCR=逆转录聚合酶链反应。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

TF、NL、JU、SDS、KS和ES对研究的概念和设计、数据采集、数据分析和解释做出了重大贡献。TF、SB、DW、JU和VM参与了手稿的起草或重要知识内容的批判性修订。所有作者阅读并批准了最终手稿。

鸣谢

作者感谢卡巴希博士提供了出色的技术援助。

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文章来自乳腺癌研究：BCR由以下人员提供BMC公司