癌症研究。作者手稿；可在PMC 2008年2月13日获得。
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PMCID公司：PMC2241750型
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院38348
树突状细胞强烈增强过继转移T细胞的抗肿瘤活性体内
,1 ,1 ,1 ,1 ,2 ,2 ,2和1
燕燕楼
1德克萨斯大学M.D.Anderson癌症中心黑色素瘤医学肿瘤学系，德克萨斯州休斯顿
王刚（Gang Wang）
1德克萨斯大学M.D.Anderson癌症中心黑色素瘤医学肿瘤学系，德克萨斯州休斯顿
格雷戈里·利泽
1德克萨斯大学M.D.Anderson癌症中心黑色素瘤医学肿瘤学系，德克萨斯州休斯顿
格雷斯·J·金
1德克萨斯大学M.D.Anderson癌症中心黑色素瘤医学肿瘤学系，德克萨斯州休斯顿
史蒂文·芬克尔斯坦
2马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究所
赤光峰
2马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究所
尼古拉斯·P·雷斯蒂福
2马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究所
帕特里克·胡
1德克萨斯大学M.D.Anderson癌症中心黑色素瘤医学肿瘤学系，德克萨斯州休斯顿
1德克萨斯大学M.D.Anderson癌症中心黑色素瘤医学肿瘤学系，德克萨斯州休斯顿
2马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究所
要求重印：Patrick Hwu，德克萨斯大学安德森癌症中心，德克萨斯州休斯顿霍尔科姆大道1515号430室，邮编77030。电话：713-792-2921；传真：713-745-1046；电子邮件：超高压下的gro.nosrednadm. 摘要
树突状细胞（DC）具有通过刺激原始T细胞启动细胞介导免疫反应的能力。然而，使用树突状细胞刺激抗原活化的T细胞体内尚未进行调查。在这项研究中，我们确定DC疫苗是否可以提高活化的过继转移T细胞的疗效，以诱导增强的抗肿瘤免疫反应。携带表达gp100肿瘤抗原的B16黑色素瘤小鼠接受培养的活化T细胞转基因治疗，以获得特异识别gp100的T细胞受体，同时接种或不接种肽脉冲DC疫苗。在这个模型中，抗原特异性DC疫苗接种诱导细胞因子产生，增强过继转移T细胞的增殖，并增加肿瘤浸润。此外，DC疫苗接种和过继性T细胞转移相结合比单独使用每种治疗方法都能产生更强的抗肿瘤反应。总之，这些发现揭示了DC在体内刺激过继转移的T细胞，可能是癌症免疫治疗的有用方法。
引言
树突状细胞（DC）是诱导初级免疫反应中最有效的抗原呈递细胞（APC）(1-三). 由于其在控制细胞介导免疫中的核心作用，树突状细胞有望成为治疗性癌症疫苗的细胞佐剂。据报道，DC疫苗在动物实验和选定的癌症患者临床试验中可诱导强烈的抗肿瘤免疫反应(4-6). 然而，尽管大多数使用DC疫苗的临床试验已成功地在癌症患者中产生肿瘤抗原反应性CTL，但仅偶尔诱导肿瘤退化(6-8). 一些机制可能解释了DC疫苗诱导的肿瘤免疫反应的有效性有限。一种可能性是CD8数量不足+CTL被认为是介导实体肿瘤排斥反应的最终效应细胞，可能仅通过DC疫苗接种而诱导(8,9). 或者，以这种方式产生的CTL可能具有次优的抗肿瘤功能体内，可能是因为活化不足、向肿瘤部位迁移不足或对宿主衍生的调节机制敏感(9).
为了克服这些局限性，过继细胞移植（ACT）治疗直接提供大量在体外选择性、高活性、肿瘤特异性T淋巴细胞可能是治疗癌症患者最有希望的免疫治疗方法之一(10). ACT治疗已被证明在淋巴瘤、转移性肾细胞癌和黑色素瘤患者中诱导T细胞介导的抗肿瘤免疫反应(10-14). 然而，尽管观察到了临床反应，但许多都是暂时的(15-17). 在这些患者中经常观察到过继转移细胞的迅速消失表明T细胞持续性不足体内可能是缺乏抗肿瘤疗效的主要原因(18,19).
根据上述临床观察结果，我们假设ACT治疗和DC疫苗联合接种可能是通过提供足够数量的活化肿瘤特异性细胞溶解细胞和有效的抗肿瘤免疫反应诱导患者抗肿瘤免疫应答的最佳方法体内刺激。虽然DC疫苗已被证明通过激活宿主原始T细胞有效启动免疫反应，但尚不清楚DC疫苗是否也能有效刺激过继转移，在体外-活化的T细胞，以及DC疫苗接种和ACT联合是否可以诱导增强的抗肿瘤反应(20).
为了研究这些问题，我们使用了一种由C57BL/6小鼠组成的动物模型，该小鼠携带表达黑色素瘤肿瘤抗原gp100的大的、已建立的皮下B16肿瘤。为了治疗肿瘤，我们采取了转移体外-表达T细胞受体（TCR）的培养的、激活的转基因T细胞（pmel-1细胞）特异识别H-2Db条-gp100限制性表位，结合gp100肽脉冲DC疫苗接种和白细胞介素2（IL-2）给药。尽管单独过继转移pmel-1 T细胞（含或不含IL-2）并不能诱导肿瘤退行性变，但加入gp100肽脉冲DC疫苗会导致细胞因子的产生、增殖，并增加转移的gp100特异性T细胞的肿瘤浸润体内并显著提高抗肿瘤反应。这些结果表明，树突状细胞在刺激活化的过继转移T细胞方面具有潜在的实用价值体内.
材料和方法
小鼠与肿瘤细胞
Pmel-1转基因小鼠表达对H-2D特异性的TCRb条–黑色素瘤肿瘤抗原gp100（gp100）的限制性表位25–33)如前所述，在C57BL/6背景上(21,22). 为了便于跟踪转移的T细胞，将pmel-1转基因小鼠与纯合Thy1.1小鼠（也是C57BL/6背景）杂交，以产生Thy1.1+pmel-1转基因小鼠。几乎所有CD8（>95%）+这些转基因小鼠的T细胞为Vβ13+胸腺1.1+流式细胞术证实。C57BL/6小鼠和pmel-1转基因小鼠被保存在NIH的无病设施中。所有方案均符合NIH实验室动物护理和使用指南。B16黑色素瘤从美国国家癌症研究所肿瘤库（马里兰州贝塞斯达）获得，并保存在完整的培养基中，该培养基由RPMI 1640组成，辅以10%的热灭活胎牛血清（马里兰州罗克维尔Biofuids），0.03%我-谷氨酰胺，100μg/mL链霉素，100μg/mL青霉素和50μg/mL硫酸庆大霉素。
Thy1.1的产生+Pmel-1转基因T细胞
Thy1.1的脾细胞+使用ACK裂解缓冲液（Cambrex，Walkersville，MD）去除pmel-1转基因小鼠的红细胞，并在含有30单位/mL重组人IL-2（来自加利福尼亚州埃默里维尔Chiron Corp.的礼物）的完整培养基中，在1μ摩尔/升hgp10025–33肽7天(22,23). 这种培养的pmel-1 T细胞产生活化的表型，这是由CD25、CD44和CD69的上调和CD62L的下调决定的(22,23). 在7天培养的脾细胞中，95%以上是CD8+V（V）β13+胸腺1.1+细胞，从而可以在过继转移到Thy1.2后有效跟踪gp100特异性T细胞+收件人。所有pmel-1 T细胞培养物的纯度通过使用抗V单克隆抗体（mAbs）的流式细胞术进行确认β第13条和第1.1条。
树突状细胞制备
如前所述产生骨髓来源的鼠DC(24,25). 简单地说，C57BL/6小鼠股骨和胫骨的骨髓细胞以1×10的初始浓度生长6RPMI 1640中的细胞/mL，并补充5%胎牛血清，我-谷氨酰胺（2 mmol/L）、青霉素/链霉素（50单位/mL）、10%非必需氨基酸、50 mmol/L2-巯基乙醇加上20 ng/mL重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和100 ng/mL IL-4（新泽西州洛基希尔Peprotech公司）。在第2天和第4天添加添加了粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和IL-4的新鲜培养基，并在第6天将所有松散粘附的细胞转移到培养皿中。第二天，收集、清洗非粘附细胞，并在37°C下用10μOpti-MEM介质中适当肽的摩尔/升（马里兰州罗克维尔市生命技术公司）。DC在用于小鼠注射之前用PBS清洗三次。使用前通过流式细胞术分析DC纯度和成熟度，以确保标记CD11c、I-A的染色b条DC上的CD80和CD86为阳性，CD3、B220和NK1.1染色为阴性(24,25).
多肽
在所有实验中，H-2Db条-限制性人类gp100（hgp10025–33，KVPRNQDWL），小鼠gp100（mgp100）的一种改变的肽配体25–33，EGSRNQDWL），如前所述用作免疫原(22,23). H-2Db条–流感核蛋白（NP）的限制性表位366–374，ASNENMETM）被用作无关的对照肽。所有肽均通过标准的9-芴甲氧羰基化学制备，并通过反相高效液相色谱纯化，质谱证实纯度>99%。
收养转移、疫苗接种和肿瘤治疗
8～10周龄C57BL/6小鼠皮下接种5×105B16黑色素瘤细胞。肿瘤注射后第7天或第8天，4~6×106 在体外-激活Thy1.1+将pmel-1 T细胞过继性转移到荷瘤小鼠体内(n个=每组5个），然后立即静脉接种1至4×106用hgp100脉冲的DC25–33或NP366–374肽。在一些实验中，小鼠每隔6天再接种一到两次DC疫苗。每次接种后直接腹腔注射重组人IL-2（6×105第一次接种后3天，每天两次单位，3×105第二次和第三次接种后，每天两次，连续3天）。通过测量肿瘤的垂直直径来监测B16肿瘤的生长。当肿瘤直径超过20 mm时，处死小鼠。所有实验均以盲法、随机方式进行，并至少进行两次，结果相似。
流式细胞术
Thy1.1的百分比+如前所述，对总外周血淋巴细胞（PBL）中的pmel-1 T细胞进行分析(22,23). 简言之，在接种疫苗后的指定日期，小鼠处于尾随状态。用ACK裂解缓冲液耗尽红细胞，用抗V单克隆抗体对剩余的PBL进行染色β13（克隆，MR12-3）和Thy1.1（克隆，OX-7），并使用淋巴细胞门进行流式细胞术分析。淋巴细胞总数通过自动全微分计数或带台盼蓝排除的血细胞术计数。Thy1.1的绝对数量+组织中的pmel-1 T细胞通过乘以Thy1.1的百分比来计算+淋巴细胞中的pmel-1细胞（由流式细胞术测定）由组织中存在的淋巴细胞总数决定。监测过继转移T细胞的增殖体内，Thy1.1+pmel-1 T细胞标记5μmol/L羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）（分子探针，尤金，OR）在37°C下保持10分钟并清洗，以及6×106将标记细胞过继转移到B16荷瘤小鼠体内。总计2×106在T细胞转移后，静脉注射肽脉冲DC，然后如前所述注射IL-2。在指定的日期，从外周淋巴结、肠系膜淋巴结、脾脏、外周血和上述肿瘤以及Thy1.1中分离出每组四只小鼠的淋巴细胞+V（V）β13+用流式细胞术分析淋巴细胞(26,27). 测定细胞内干扰素γ（干扰素-γ)如前所述，从不同组织中分离淋巴细胞，并在37°C的37°C温度下用Golgiplug（BD Biosciences，San Jose，CA）培养4小时，在不存在或存在1μ摩尔/升mgp10025–33肽(26,27). 对细胞进行清洗，并用针对Thy1.1和V的单克隆抗体染色β13，并根据制造商的建议用Cytofix/Cytoperm（BD Biosciences）进行渗透。与抗干扰素孵育后-γmAb，洗涤细胞并通过流式细胞术进行分析。为了分析细胞表面标记物CD44或CD62L在pmel-1 T细胞上的表达，用抗Thy1.1、Vβ13、CD44和CD62L（BD PharMinen，加利福尼亚州圣地亚哥）。使用FACSCalibur流式细胞仪和CELLquest软件（均来自BD Biosciences）对样品进行分析。
统计分析
使用Mann-Whitney非参数法确定统计分析，以比较治疗组和对照组之间的肿瘤大小和T细胞数量U型测试。用Kaplan-Meier检验确定比较治疗组和对照组小鼠存活率的统计分析。除非另有说明，否则数据以4-5只小鼠数据的平均值±SE表示。
结果
抗原特异性DC疫苗诱导过继转移T细胞产生细胞因子和增殖体内
我们首先试图确定抗原特异性DC疫苗接种是否会刺激活化的过继转移T细胞并使其增殖体内为了在人类癌症患者中使用与ACT治疗并行的小鼠模型，我们选择在大型肿瘤负担环境中解决这个问题。因此，小鼠在给药前先接种表达gp100的B16黑色素瘤7天体外-通过过继转移激活gp100特异性pmel-1 T细胞，然后给予IL-2，并同时静脉注射hgp100或NP肽（以下分别称为DC/hgp100和DC/NP）脉冲的DC。体内3天后通过测定干扰素分析血液、淋巴结和脾脏中pmel-1 T细胞的功能-γ没有进一步的生产在体外刺激。如所示，只有携带相关hgp100肽的DC才能诱导IFN-γ通过细胞内染色和流式细胞术测定过继转移T细胞的产量。这些细胞因子产生细胞主要位于脾脏，但在血液或淋巴结中未观察到。于在体外用mgp100肽（IFN）重新刺激-γ在DC/hgp100和DC/NP处理的小鼠的所有测试组织中都发现了产生pmel-1的T细胞（数据未显示），这表明转移的pmel-1 T细胞在用同源抗原刺激时保持其功能。
抗原特异性DC疫苗接种后pmel-1 T细胞产生细胞因子体内用黑色素瘤肽抗原hgp100脉冲的DC静脉免疫小鼠25–33或无关的流感核蛋白衍生肽NP366–374在过继转移培养的pmel-1 T淋巴细胞后立即给予IL-2。三天后，从指定的淋巴器官中分离出治疗小鼠（四只小鼠/组）的混合淋巴细胞，并评估pmel-1 T细胞的细胞内IFN生成-γ如果没有额外的在体外刺激。印尼国家电力公司，外周淋巴结；MLN、，肠系膜淋巴结。
体内DC接种后还分析了转移的pmel-1 T细胞的增殖情况。在这些实验中，pmel-1 T细胞在过继转移到荷瘤小鼠之前用CFSE标记。接种疫苗后5天，处死小鼠，并通过流式细胞术测定淋巴结、脾脏和血液中pmel-1 T细胞的增殖程度。结果表明，DC/hgp100可显著提高T细胞增殖体内与DC/NP相比，尤其是在脾脏和血液中().
抗原特异性DC疫苗接种后pmel-1 T细胞增殖增强体内.体外刺激的pmel-1 T细胞用CFSE标记，清洗，过继转移到B16荷瘤小鼠，然后立即用hgp100脉冲的DC免疫25–33或NP366–374多肽加IL-2给药。5天后，从指定的淋巴器官和(A类)通过流式细胞术或(B类)对每个淋巴腔中pmel-1细胞的绝对数量进行定量。印尼国家电力公司，外周淋巴结；MLN、，肠系膜淋巴结。
通过测定不同组织中pmel-1细胞的总数，进一步量化T细胞增殖。如所示与DC/NP疫苗相比，DC/hgp100疫苗导致血液和脾脏中pmel-1 T细胞数量显著增加。总的来说，与DC/NP疫苗接种相比，DC/hgp100疫苗接种导致pmel-1 T细胞总数增加了7-12倍，这是过继转移后5天测量的。明确诱导抗原特异性DC疫苗接种体内考虑到第5天恢复的pmel-1 T细胞绝对数量显著大于6×10，过继转移的pmel-1T细胞的扩增6最初传输的单元格(). 这些数据表明，除了有充分证据证明树突状细胞刺激原始T细胞的能力外，抗原脉冲树突状病毒还可以有效地刺激和扩张在体外培养、过继转移、抗原特异性T细胞体内.
抗原特异性树突状细胞疫苗与ACT联合治疗可增强抗肿瘤活性
我们观察到抗原特异性DC疫苗接种导致转移的pmel-1 T细胞产生细胞因子和增殖体内促使我们研究联合DC疫苗接种和ACT治疗的抗肿瘤治疗潜力。七天的B16荷瘤小鼠接受过继性pmel-1 T细胞转移，然后如前所述同时静脉接种DC和给予IL-2。与未经治疗的小鼠相比，单独接种DC/hgp100疫苗没有显著的抗肿瘤作用，而单独使用pmel-1 T细胞治疗仅能适度抑制肿瘤生长(). 相反，与单独使用pmel-1细胞或使用非相关肽脉冲DCs的pmel-1 T细胞治疗方案相比，DC/hgp100疫苗和pmel-1 T-细胞联合使用可显著延缓肿瘤生长(;P（P）= 0.006). 如图所示，与其他治疗组相比，DC/hgp100与pmel-1 T细胞的联合方案也导致生存期显著延长(P（P）= 0.003). 然而，值得注意的是，该方案只是暂时抑制肿瘤生长，所有小鼠最终都死于B16黑色素瘤。
通过将DC疫苗接种与过继转移pmel-1 T细胞和IL-2注射相结合来增强抗肿瘤活性。C57BL/6小鼠皮下接种5×105B16肿瘤细胞。7天后，给荷瘤小鼠静脉注射6×106培养的pmel-1 T细胞，然后立即静脉注射用hgp100脉冲的DC25–33或NP366–374肽。每天两次注射IL-2，共六次。(A类)肿瘤生长和(B类)在治疗后5周内监测小鼠存活率*P（P）= 0.006; **P（P）=0.003（对于DC/hgp100）与DC/NP。显示的结果是三个独立实验的代表。
由于特异性抗原脉冲DC的单次疫苗接种会显著延迟肿瘤生长和延长小鼠生存期，我们接下来探讨了连续DC疫苗接种是否可以增强先前在积极免疫治疗环境中报道的抗肿瘤效果(28). 在这些实验中，如前所述，用pmel-1 T细胞过继转移小鼠，然后每隔6天接种一次、两次或三次DC/hgp100或DC/NP加IL-2。如所示，DC/hgp100疫苗接种数量的增加与B16肿瘤生长的延迟有关体内也延长了小鼠的存活时间。与单独接种DC/hgp100疫苗相比，三次接种DC/hpp100疫苗显著抑制肿瘤生长并延长小鼠生存期(,P（P）= 0.014;,P（P）= 0.003). 重要的是，只有接受三次DC/hgp100疫苗接种的小鼠在治疗后长达6周的整个观察期内表现出100%的存活率。相反，DC/NP连续接种并没有显著抑制肿瘤生长，这表明多重DC疫苗诱导的抗肿瘤效果的改善是抗原特异性的。流式细胞术分析显示，外周血中的pmel-1 T细胞数量也与接种DC/hgp100疫苗的数量相关(). 在接受三次连续DC/hgp100疫苗接种的小鼠中，在细胞转移后第24天，pmel-1 T细胞占所有PBL的～13%，大约是接受单一DC/hgp1000疫苗接种的鼠的八倍(P（P）= 0.021). 这些结果表明，延长抗原特异性pmel-1 T细胞的持久性体内可能有助于增强抗肿瘤反应。
连续DC免疫可提高抗肿瘤反应、小鼠存活率和pmel-1 T细胞持续性。将第80天的B16荷瘤小鼠静脉注射4×106pmel-1 T细胞，然后接种以hgp100为脉冲的DC25–33或NP366–374肽。指示组小鼠每隔6天接受一次强化DC免疫，用肽脉冲DC进行一次、两次或三次总免疫。每次接种后立即腹腔注射IL-2。(A类)肿瘤生长和(B类)监测小鼠存活率，比较免疫方案。(C类)用流式细胞术分析外周血pmel-1细胞百分比（Vβ13+胸腺1.1+)在指定时间点的总PBL*P（P）= 0.014; **P（P）= 0.003; ***P（P）一个=0.021与连续接种三次DC/hgp100疫苗。数据是两个独立实验的代表，每组共有五只小鼠。（◆）不治疗；pmel-1+（■）DC/hgp100+IL-2(1)，（□）DC/NP+IL-2(1)，（▲）DC/hgp100+IL-2(2)，（△）DC/NP+IL-2(2)，（●）DC/hgp100+IL-2(三)，（○）DC/NP+IL-2(三).
总的来说，这些结果表明，抗原特异性肽脉冲DC疫苗与ACT治疗相结合，可以诱导比单独治疗更强烈的抗肿瘤效果。此外，这些实验表明，ACT后使用多肽脉冲DC疫苗可增加T细胞的持久性并增强抗肿瘤反应体内重要的是，单独接种hgp100多肽或hgp100肽脉冲脾细胞都无法增强过继转移的pmel-1细胞的抗肿瘤活性（数据未显示），这意味着使用树突状细胞是这种治疗的重要组成部分。
先前的淋巴建模进一步提高了联合免疫治疗的疗效
为了验证上述抗肿瘤反应是由过继转移的pmel-1 T细胞而非内源性宿主免疫细胞引起的，在转移pmel-1 T细胞和DC疫苗接种前1天，对荷瘤小鼠进行500 rad全身照射。这种亚致死剂量的辐射会导致小鼠淋巴耗竭，并且只会轻微影响B16肿瘤的生长。有趣的是，在联合免疫治疗环境中，ACT前亚致死剂量照射导致抗肿瘤反应的显著改善(;P（P）= 0.009). 同样，我们发现DC/hgp100疫苗接种和pmel-1 T细胞转移联合在Rag-1中诱导了更有效的抗肿瘤活性−/−敲除小鼠比野生型C57BL/6小鼠（数据未显示）。这些数据表明，观察到的抗肿瘤反应是由过继转移的pmel-1 T细胞引起的，而不是由内源性宿主免疫细胞引起的。这些结果还表明，ACT对缺乏内源性T和B淋巴细胞的小鼠的抗肿瘤效果显著增强。
过继性pmel-1 T细胞转移和DC免疫前的辐射增强抗肿瘤反应。用500拉德照射7天皮下B16荷瘤小鼠，1天后过继转移pmel-1 T细胞，并用携带hgp100的DC免疫25–33或NP366–374多肽加IL-2给药。对肿瘤生长进行监测，并与未经照射的小鼠进行比较*P（P）=0.009（辐照）与接受DC/hgp100免疫接种的非辐射宿主。数据是两个独立实验的代表，每组共有五只小鼠。非辐射：（◆）不治疗，（■）DC/NP+IL-2，（●）DC/hgp100+IL-2。辐射：（◇）不治疗，（□）DC/NP+IL-2，（○）DC/hgp100+IL-2。
此小鼠肿瘤模型中最有效的ACT方案发生在淋巴衰竭环境中，并连续接种三次DC/hgp100疫苗(). 在这些条件下，在该治疗组的大多数小鼠中观察到肿瘤完全退化。此外，与只接受单一DC/hgp100疫苗接种的小鼠相比，其余小鼠在治疗后30天的肿瘤要小得多(P（P）= 0.013). 在淋巴衰竭环境中也观察到转移的T细胞持续性增加，在接受三次连续DC/hgp100疫苗接种的小鼠中，pmel-1 T细胞在第9天占所有PBL的～75%，在第20天占所有pbL的～25%()，与仅接种一次DC/hgp100疫苗相比有显著改善(P（P）= 0.021).
序贯DC疫苗接种加照射结合过继转移pmel-1 T细胞可提供最佳抗肿瘤反应。用500rad照射7天的皮下B16荷瘤小鼠，1天后过继转移pmel-1 T细胞并用携带hgp100的DC免疫25–33或NP366–374多肽加IL-2给药。此后，指示小鼠每隔6天接受一次或两次DC强化疫苗接种。(A类)治疗后监测小鼠肿瘤生长。(B类)用流式细胞术分析外周血pmel-1细胞百分比（Vβ13+胸腺1.1+)在所指示的时间点的总PBL中*P（P）= 0.013; **P（P）一个=0.021与连续接种三次DC/hgp100疫苗。数据是两个独立实验的代表，每组共有五只小鼠。（◆）不治疗；pmel-1+（■）DC/hgp100+IL-2(1)，（□）DC/NP+IL-2(1)，（▲）DC/hgp100+IL-2(2)，（△）DC/NP+IL-2(2)，（●）DC/hgp100+IL-2(三)，（○）DC/NP+IL-2(三).
虽然导致辐射环境中增强抗肿瘤反应的机制尚待确定，但我们小组使用Rag1的类似发现−/−肿瘤模型（数据未显示）表明，淋巴滤过可能在决定ACT治疗结果中起主要作用。因为pmel-1 T细胞的扩张体内与之前的照射相似（数据未显示），肿瘤特异性pmel-1 T细胞的稳态扩增不太可能解释辐射诱导淋巴滤过增强的抗肿瘤作用。为了更准确地确定这一观察的性质，还需要进行其他实验。
抗原特异性DC疫苗导致Pmel-1 T细胞向肿瘤浸润增加
为了研究联合免疫治疗方案诱导肿瘤消退的可能机制，我们接下来分析了浸润B16肿瘤的淋巴细胞。在接种ACT和DC疫苗5天后，从小鼠身上切除肿瘤，并用流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞群中pmel-1 T细胞的百分比。如所示与接受DC/NP的小鼠相比，接受DC/hgp100疫苗接种的小鼠在其肿瘤中的pmel-1 T细胞百分比高得多（32%与2.1%). 尽管接种DC/hgp100的小鼠每毫克肿瘤的淋巴细胞总数仅略高于接种DC/NP的小鼠，但与接种DC/NP-的小鼠相比，每毫克肿瘤组织中发现的gp100特异性pmel-1 T细胞总数是接种DC/hgp100的鼠的约20倍().
抗原特异性DC疫苗可增强pmel-1 T细胞对肿瘤的浸润。七天的B16荷瘤小鼠静脉输注pmel-1 T细胞，然后用hgp100脉冲的DC免疫25–33或NP366–374肽加IL-2给药。五天后，采集血液、脾脏和肿瘤，分离淋巴细胞并用流式细胞仪进行分析。(A类)pmel-1（V）的肿瘤浸润淋巴细胞总数百分比β13+胸腺1.1+)T细胞。(B类)淋巴细胞总数和每毫克肿瘤中pmel-1细胞的数量。对于(B类)每个数据点代表每组四只老鼠中的一只。(C类和D类)过继转移的pmel-1 T细胞上活化/归巢标记物CD62L和CD44的表达。细胞用抗Thy1.1和V单克隆抗体染色β13鉴定过继转移的pmel-1细胞，然后分别用CD62L和CD44单克隆抗体染色。在pmel-1细胞上选通直方图（Vβ13+胸腺1.1+). 特定染色被描述为填充直方图，同型控制被描述为开放直方图。
为了进一步阐明抗原特异性DC疫苗接种导致肿瘤浸润改善的机制，我们分析了CD62L和CD44的pmel-1 T细胞表面表达，这两者都与细胞迁移到抗原沉积部位有关(29,30). 细胞移植后第5天，血液和脾脏中的pmel-1 T细胞显示出显著下调CD62L()和上调CD44()与DC/NP疫苗相比，DC/hgp100疫苗激活时的表达。这些变化与通过淋巴组织的T细胞贩运水平降低相一致，从而增加了向外围抗原沉积部位（如肿瘤部位）迁移的机会。为了支持这一点，CD62L低的细胞明显表现出更强的迁移到肿瘤部位的能力，无论它们是来自DC/NP-还是DC/hgp100免疫小鼠(). 总之，这些数据表明，正是抗原特异性DC疫苗诱导的pmel-1 T细胞数量的增加和肿瘤归巢质量的提高导致了观察到的肿瘤浸润增强和抗肿瘤反应增强。
讨论
CTL作为介导实体肿瘤排斥反应的关键效应细胞的鉴定促进了多种基于T细胞的癌症治疗方法的发展(31). 基于ACT的免疫治疗，其中大量在体外将培养的、高度活化的、肿瘤特异性T细胞注入患者体内，是最有希望的癌症治疗方法之一。尽管ACT在临床上取得了一些成功，但在大多数报告的病例中，它都导致了有限和短暂的抗肿瘤反应。这种缺乏临床疗效的潜在原因包括过继转移的T细胞缺乏持久性体内这可能是由于抗原刺激不足导致这些细胞无法存活或增殖所致体内激活诱导的细胞死亡或对免疫调节细胞的敏感性(10). 或者，由于肿瘤中经常观察到的免疫抑制机制，转移的持续存在的细胞毒性T细胞可能无法在肿瘤部位浸润或发挥最佳功能(32-34). 设计合理的策略来克服这些限制可能会提高ACT的疗效。
许多疫苗接种方法已被用于刺激抗肿瘤宿主T细胞体内包括使用抗原肽或重组病毒载体来传递肿瘤抗原体内(35,36). 虽然肽免疫经常被证明会导致循环抗原特异性T细胞的数量增加（尤其是在经过数月的长系列免疫接种后），但它们很少导致大型既定肿瘤的客观回归(37,38). 病毒载体免疫在诱导抗肿瘤反应方面显示出一些前景，这可能是因为先天免疫系统的激活和炎症的诱导(39).
我们之前已经证明，在我们的过继转移模型中，用编码鸡痘病毒的重组gp100免疫小鼠也可以增强T细胞的持久性和抗肿瘤活性(22). 然而，这些方法在临床上受到安全问题的限制，此外，宿主对病毒载体本身的潜在免疫发展，或已知由许多病毒蛋白诱导的免疫抑制(40). 相比之下，将自体树突状细胞作为疫苗来激活内源性肿瘤特异性T细胞已被广泛证明对临床应用是安全的(41). 虽然以前已经证明病毒载体的重复免疫受到中和抗体发展的限制(42)在本研究中，我们表明重复DC免疫似乎没有这种局限性，在多次免疫后效果增强。
目前正在进行几项使用抗原负载DC免疫癌症患者的临床试验。尽管许多试验已经产生了令人鼓舞的肿瘤抗原特异性T细胞反应性，但关于单独使用DC疫苗在人类中已建立的肿瘤完全消退的报道在很大程度上仍然是传闻。
本研究旨在确定树突状细胞是否能够增强过继转移T细胞的抗肿瘤活性体内我们的结果表明，肿瘤抗原DC/hgp100疫苗接种可以诱导细胞因子的产生、增殖，并增加先前激活的过继转移的gp100特异性T细胞的肿瘤迁移体内此外，肽脉冲DC疫苗接种和ACT治疗相结合，与单独使用两种治疗方法相比，产生了更强的抗肿瘤反应，导致皮下表达gp100的B16大肿瘤显著消退，并延长了荷瘤小鼠的生存期。DC显然是提高ACT抗肿瘤活性的关键，因为与单独接种肽或肽脉冲脾细胞相比，肽脉冲DC免疫可大大提高肿瘤治疗效果。三目前正在进行实验以确定DC的哪些特定属性(例如MHC表达水平、共刺激分子和细胞因子分泌）有助于此功能以及DC在这一能力上是否独特。
有效的免疫治疗需要细胞毒性T细胞不仅持续存在体内而且还迁移到肿瘤部位并在肿瘤部位最佳地发挥作用。在本研究中，我们表明，通过抗原特异性DC疫苗激活过继转移的T细胞，导致转移的T淋巴细胞显著增殖、持续存在并选择性迁移至肿瘤，血液、脾脏和肿瘤组织中转移细胞的绝对数量显著增加就是明证。gp100肽脉冲DC诱导pmel-1 T细胞CD62L显著下调和CD44上调可能在增加T细胞向肿瘤归巢中起作用。CD62L被认为主要负责淋巴细胞进入淋巴结。有人建议CD62L低的由于淋巴结再循环能力降低，细胞将更有效地迁移到抗原沉积部位(30,43). CD44可以介导T细胞滚动，最终导致内皮细胞粘附和外渗到周围组织和潜在的肿瘤部位(29,44).
虽然肽脉冲树突状细胞的静脉免疫先前已被证明可诱导显著的抗原特异性T细胞反应并可控制肺转移，但很少有证据表明会导致皮下肿瘤消退(45). 研究表明，静脉注射的树突状细胞定位于脾脏，导致脾脏中的效应和记忆性T细胞，但在主要淋巴结隔室中不存在(45,46). 此外，这些数据表明，最初在脾脏激活的T细胞可能无法浸润皮下肿瘤(45). 与此一致，我们发现大多数过继转移的pmel-1 T细胞在脾脏中进一步激活，但在淋巴结中没有激活。令人惊讶的是，我们发现静脉注射DC免疫比通过脚垫注射DC更有效地控制皮肤下B16肿瘤的生长。1这种差异可能源于这样一个事实，即与其他研究不同，我们的研究结果是在ACT环境下使用先前激活的T细胞观察到的在体外在我们的模型中，我们通过相同的静脉途径注射抗原特异性T细胞和肽脉冲DC，增加了两种细胞类型之间相互作用的可能性。由于我们的结果显示，在肽脉冲DC刺激后，大量肿瘤抗原特异性T细胞浸润B16肿瘤，这表明过继转移的T细胞确实具有在抗原特异性刺激后浸润皮下肿瘤的能力体内.
已有研究表明，重复的连续DC疫苗接种可导致反应性T细胞的克隆耗竭，并增强活化诱导的细胞死亡(46,47). 与此相一致，我们还发现，在缺乏IL-2的情况下，每周仅接种肽脉冲DC，会导致我们模型中的抗肿瘤活性降低。1然而，与单独使用IL-2治疗相比，每次DC疫苗同时使用IL-2会导致血液中转移的T细胞水平升高，并显著增强抗肿瘤反应。这些结果强烈表明，DC疫苗接种和IL-2协同增强过继转移T细胞的功能。虽然IL-2在主动免疫环境中可以提高DC免疫的效力，但我们的结果表明，同样的原则也适用于过继免疫治疗的环境(48). 我们的发现是，DC疫苗接种数量的增加导致抗肿瘤免疫力的增强，这也与其他组的数据一致，表明CD8+加强型DC疫苗的T细胞反应比第一次DC疫苗的反应更快、更强(49). 这些原则可能对合理设计未来人类癌症患者ACT试验的免疫时间表至关重要。
最近研究表明，ACT之前的淋巴建模方案可以增强过继转移T细胞的持久性和抗肿瘤活性(50,51). 据推测，这种抗肿瘤疗效的提高可能是由于T细胞的稳态增殖增加和/或宿主衍生调节性免疫细胞的去除。我们的结果证实，在输注pmel-1 T细胞之前通过照射淋巴滤过增加了抗肿瘤反应，这一结论得到了使用未照射Rag-1的类似实验的支持−/−缺乏内源性B和T淋巴细胞的敲除小鼠。然而，对pmel-1 T细胞的仔细定量显示体内ACT后小鼠的增殖在之前有或没有照射的小鼠中几乎相同。因此，稳态增殖可能不是淋巴滤过促进ACT有效性的主要手段。在该模型中，导致抗肿瘤反应增强的确切机制需要进一步研究。
以ACT为基础的免疫治疗对人类癌症患者具有很大的前景，但临床疗效的实质性限制仍有待克服。我们的实验模型包括用低至中等亲和力的ACT治疗一个免疫原性较差的大B16肿瘤，体外-激活的pmel-1 T细胞，旨在尽可能模拟人类过继转移研究。尽管我们使用具有单克隆特异性的TCR转基因T细胞并不能模拟过继转移的多克隆T细胞群体的行为，但该系统仍可能提供一种有价值的方法，以揭示DC疫苗接种的一般原则，这可能对未来的免疫方法的形成具有重要意义。我们的发现是抗原特异性DC疫苗可以诱导大量体内先前激活的T细胞的增殖、肿瘤迁移和增强的抗肿瘤活性可能具有重要的临床应用。因此，使用树突状细胞增强过继转移的T细胞可能是一种有希望的癌症治疗新方法。
致谢
我们感谢Y.J.Liu博士对这份手稿的批评性阅读，以及M.Detry和B.Brown博士的统计咨询。
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