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BMC生物化学。2007; 8: 21.
在线发布2007年10月31日。 doi（操作界面）：10.1186/1471-2091-8-21
PMCID公司：PMC2241622型
PMID：17974014

氨基肽酶B，一种胰高血糖素加工酶：锌的定点突变2+-结合基序与分子建模

越来港,1 Marie-Sandrine学员,1 塞西尔·古兹·达蒙,1 香塔尔·汉克斯,1 玛格丽·贝恩菲尔德,2 皮埃尔·尼古拉斯,1 凯瑟琳·埃切贝斯特,三和蒂埃里·福隆通讯作者1
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摘要

背景

氨肽酶B（Ap-B；酶代码EC3.4.11.6）对肽N末端的碱性残基的裂解进行催化，并将胰高血糖素加工成微胰高血糖激素。酶显示，在体外，水解白三烯a的残留能力4进入促炎脂质介质白三烯B4Ap-B的潜在双功能性质得到了与LTA密切结构关系的支持4水解酶（LTA4H；酶代码EC3.3.2.6）。为了详细了解Ap-B的酶机制和设计抑制剂，有必要进行结构-功能分析，以确定完整的体内酶的功能。

结果

大鼠Ap-B cDNA表达于大肠杆菌并对纯化的重组酶进行了表征。18个突变体H（H）325E类XX个H（H）X（X）18E类348锌2+-构建并表达了结合基序。所有突变都被发现消除了氨肽酶的活性。对氨肽酶M1家族的500个序列进行多重比对，以鉴定3个外肽酶亚家族，并利用LTA的x射线结构建立Ap-B的结构模型4H作为模板。虽然这两种酶的3D结构彼此相似，但在某些细节上有所不同。讨论了划定Ap-B活性中心的环在区分基本底物中的作用，以及共有基序的功能，如RNP1和Armadillo结构域。静电电位和疏水斑的检查显示Ap-B和LTA之间存在重要差异4H，表明Ap-B参与蛋白质相互作用。

结论

M1家族成员一级结构的排列清楚地表明了不同亚家族的存在，并强调了整个家族酶活性中的关键残基。大肠杆菌重组酶和Ap-B结构模型是研究这些保守残基在Ap-B、LTA中的重要性和可能作用的有力工具4H和M1氨肽酶催化位点，并获得对其生理功能的新见解。对Ap-B结构模型的分析表明，Ap-B和蛋白质之间可以发生一些相互作用，并表明内肽酶可能在激素加工过程中与Ap-B形成复合物。

背景

氨肽酶B（Ap-B；酶代码EC3.4.11.6）活性最初被定义为能够从NH中去除碱性氨基酸残基的外肽酶2-肽底物末端[1]. 这种活性导致了这样一种假设，即酶参与前体加工的最后步骤，即神经肽和激素前体[2-4]. 在大多数情况下，肽前体的蛋白水解激活发生在精氨酸和赖氨酸残基处，涉及内蛋白酶和外肽酶的顺序作用[三]. 研究工作主要集中在碱性氨基酸双链的COOH末端的内肽酶裂解以及随后羧肽酶E或H的参与（酶代码EC3.4.17.10；综述于[5,6]).

然而，一些内蛋白酶已被证明能在其NH上产生碱性氨基酸双链的裂解2-终端侧[7-10]. 此外，NH2-已经描述了各种肽的末端延伸形式，这些肽含有一个额外的精氨酸或赖氨酸残基，这是由其相应前体的蛋白水解过程产生的[11-14]. 最近的几项研究表明，Ap-B活性与不同的蛋白酶（如NRD转化酶）结合发生[15]，组织蛋白酶L[16]和氨肽酶A[17]. 虽然澄清了Ap-B的生理相关性并鉴定了其所有成分体内底物不完整，其中一些底物最近被鉴定出来。事实上，Ap-B在朗格汉斯岛的α细胞中将胰高血糖素转化为微量胰高血糖激素[15]还可以处理大鼠心脏成纤维细胞中的血管紧张素肽[17]和各种组织中的脑啡肽[16]. Ap-B的酶学性质及其表达模式[4,18-22]导致这种酶可能参与炎症过程的假设[23]、肿瘤的发展[24]和II型糖尿病[15].

从大鼠睾丸分离的纯化酶的生化特性提供了重要信息。Ap-B是单体72kDa-Zn2+-依赖性外肽酶，选择性地从NH中去除Arg或Lys残基2-几种肽底物的末端[4]. 除了其外肽酶活性外，Ap-B还具有水解白三烯a的剩余能力4（陆路交通管理局4)进入致炎脂质介质白三烯B4（长期借款4),在体外[18]. Ap-B的双功能性得到了与LTA密切的系统发育关系的支持4水解酶（LTA4H；酶代码EC3.3.2.6；[18])，水解LTA4到LTB4,体内，并表现出氨肽酶活性，在体外[25]. 这两种酶都属于金属肽酶M1家族（共有锌2+-结合位点HEXHX18E；[18,21,25,26]).

LTA的高分辨率晶体结构4最近描述了H与抑制剂（即bestatin）的复合物[27,28]. 这是在金属外肽酶M1家族中确定的第一个3D结构，Ap-B也属于该家族。由于酶的溶解度低，使Ap-B结晶的各种尝试都失败了。然而，LTA之间的系统发育关系4H和Ap-B提供了使用LTA对Ap-B结构建模的机会4H作为模板，以获取结构数据，这些数据对于理解酶机制、潜在生理底物的结构以及设计Ap-B的有效抑制剂至关重要。

在本文中，我们描述了大鼠Ap-B（rAp-B）在大肠杆菌重组蛋白的表征及其催化性能。通过定点突变产生了18个不同的突变体，以确认属于M1共有基序的保守氨基酸的功能作用[H（H）325E类XX个H（H）X（X）18E类348]，它构成锌2+-结合位点。为了确定Ap-B催化机制和底物特异性控制的结构要求，对M1家族的500个序列进行了完全比对，以指出保守残基和进化差异。该比对的一部分用于根据人类LTA的晶体结构构建整个650氨基酸长rAp-B的3D模型4H（H）[27]与锌离子和bestatin络合物。

一些以前的结构相关性生物信息学还讨论了检测到的参与蛋白质-蛋白质相互作用的共有位点，如RNP1结合基序和Armadillo结构域。最后，Ap-B和LTA之间的结构表面差异4对H进行了检测，结果导致了这样的假设：根据其假定的生理功能，Ap-B表现出许多蛋白质相互作用特性。

结果

大肠杆菌重组大鼠Ap-B蛋白的表达和纯化

将含有大鼠Ap-B CDS的1965 bp长的DNA片段克隆到pIVEX2.4表达载体中（图。1-A型). 然后，用T7启动子驱动的质粒在BLi5中产生重组大鼠Ap-B蛋白（rAp-B）大肠杆菌应变。翻译产物包含NH处的组氨酸标签（His-tag）2-末端后接因子Xa限制性蛋白酶裂解位点和rAp-B序列，提供673个氨基酸蛋白质（His-rAp-B；图。1-A、-B). 融合的His-tag/Factor Xa位点尾部导致的长度差异（673对650氨基酸残基）导致电泳迁移率略有差异，这在Western blot分析中观察到（图。1-乙). 后者也表明His-rAp-B在原核表达系统中得到了正确表达。

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大鼠Ap-B编码区的克隆、表达和纯化大肠杆菌重组大鼠Ap-B蛋白.（A）pIVEX2.4-Ap-B矢量的示意图。含有大鼠Ap-B CDS[18]的1965 bp-long DNA片段（氨肽酶B）被克隆到pIVEX2.4表达载体中。T7启动子、核糖体结合位点（RBS）、翻译起始密码子（ATG）、组氨酸标签（His tag）、因子Xa限制性蛋白酶裂解位点（Xa或因子Xa）、NcoI和BamHI限制性位点、终止密码子(***)和转录T7终止子（T7终止符）。（B）重组rAp-B基因在大肠杆菌中表达的Western blot分析大肠杆菌1号通道含有杆状病毒表达系统中产生的纯化重组rAp-B（[29]）。通道2含有来自pIVEX2.4-Ap-B转化细胞的粗蛋白提取物。每个样品（2μL）在20μL的1×Laemli缓冲液中稀释，以避免电泳期间的缓冲效应。箭头表示对应于杆状病毒产生的rAp-B（rAp-B；650个氨基酸残基；[29]）和大肠杆菌分别表达rAp-B（His-rAp-B；673个氨基酸残基）。（C）使用Ni-NTA柱纯化。所分析的不同蛋白提取物如下：从杆状病毒表达系统中纯化的C，rAp-B用作阳性对照；CE，pIVEX2.4-Ap-B转化BLi5细胞粗蛋白提取物（5μL）；FT，通过Ni-NTA柱传代后释放的蛋白质（20μL）；W1和W2，分别是Ni-NTA柱第一次和第二次洗涤后释放的蛋白质（20μL）；E1和E2，分别在第一和第二洗脱步骤后收集的蛋白质（20μL）。（D）用DEAE离子交换柱纯化重组大鼠Ap-B。对从离子交换柱收集的含有rAp-B活性的不同组分（43、45、47、49、51、53）进行分析（20μL/组分）。（C、D）样品在SDS-PAGE上运行，并用银盐染色（上图）或转移到硝化纤维膜上进行蛋白质印迹（下图）。箭头表示大肠杆菌表达rAp-B（rAp-B）。（B、C、D）相对分子质量以千道尔顿（MM，kDa）表示。

作为NH的rAp-B的克隆2-多组氨酸尾蛋白可以快速纯化。图1-C（1-C）表明在第一次清洗期间，所需的His-rAp-B有显著损失。在这一步骤中，任何增加组氨酸标签结合特异性的尝试都会导致洗脱步骤中特异性的降低。洗脱组分E1和E2（各1.5 mL）的凝胶电泳仅显示一条相对分子质量约为73 kDa的条带（图。1-C（1-C）). 将两种组分混合，并在pH 7.2的Tris-HCl 50 mM溶液中浓缩至1 mL。纯化的His-tag rAp-B的最终浓度约为160μg.mL-1因此，由于我们从50 mL细胞培养物中获得160μg纯化蛋白，因此通过此纯化程序可以获得足够数量的酶，纯化率为3.2 mg/L-1.

为了确定纯化过程中酶活性动力学参数的潜在差异，还使用DEAE Trisacryl Plus M离子交换柱用80 mM KCl洗脱半纯化His-tagged rAp-B（图。一维). 含有Ap-B活性的洗脱组分（每个5 mL）的凝胶电泳显示了几条相对分子质量在35至115 kDa之间的条带（图。一维). 将含有银染SDS-PAGE上4条主要可检测条带的组分43至47合并（25 mL；图。一维)并在50 mM pH 7.2的Tris-HCl中浓缩至5 mL。半纯化蛋白的最终浓度为~40μg.mL-1对80微克/毫升-1分数48到53。在视觉定量的范围内，该分析表明，His-tagged rAp-B的数量约占总蛋白质的30%，因此估计纯化率约为1 mg/L-1注意，随后的排阻色谱步骤不允许分离污染蛋白质，尽管它们的分子质量存在差异（数据未显示）。

Western blot分析完成了对这些纯化程序产生的蛋白质的鉴定（图。1-C，-D，下部面板），并表明未产生降解产物。

纯化His标记大鼠Ap-B活性的表征

根据Lineweaver-Burk 1/v对1/[S]的曲线图和Hanes-Woolf曲线图（[S]/v对[S]），在底物浓度1–35μM范围内，估算His-rAp-B与L-Arg和L-Lysβ-NA酶反应的动力学常数（表​（表11).

表1

L-Argβ-NA和L-Lysβ-NA水解的His-rAp-B动力学参数。

基底酶His-rAp-B（nM）（Ni-NTA净化）公里（μM）V最大值（nM.s-1)千卡（秒）-1)千卡/公里（M-1.秒-1)
L-精氨酸-β-NA4,66108 ± 13146 ± 1720 ± 31.85 × 105
L-赖氨酸-β-NA21.9135 ± 3065 ± 73±0.35秒-12.2 ± 0.2 × 104
基底酶His-rAp-B（nM）（DEAE半净化）公里（μM）V最大值（nM.s-1)
L-精氨酸-β-NA137 ± 0.11200 ± 0.18
L-赖氨酸-β-NA170 ± 0.3890 ± 0.18
基底酶His-rAp-B（nM）（来自昆虫细胞）公里（μM）V最大值（nM.s-1)千卡（秒）-1)千卡/公里（M-1.秒-1)
L-精氨酸-β-NA1465295213.2 × 105
基底酶rAp-B（nM）（大鼠睾丸DEAE半纯化）公里（μM）V最大值（nM.s-1)
L-精氨酸-β-NA2060
L-赖氨酸-β-NA3642

Km、Vm和kcat值是三个独立系列试验的平均值±标准误差，其中每个点一式三份。显示了用从杆状病毒感染的昆虫细胞[29]和大鼠睾丸Ap-B[4]纯化的His-r-Ap-B获得的比较值。

His-rAp-B的酶活性可能高于上述估计。事实上，之前曾描述过由于酶的高纯度而导致活性降低[4,29]. 同时，此纯化步骤需要计算动力学常数，如kcat和kcat/Km。使用DEAE半纯化His-rAp-B进行的等效测量表明，酶活性与Ni-NTA类似（表​（表1）。1). 因此，半纯化酶也可用于活性测定。杆状病毒重组Ap-B的动力学值比较[29]，大鼠睾丸酶[4]和大肠杆菌重组蛋白表明，后者是研究Ap-B酶促机制的可靠工具，避免了漫长的纯化过程（表​（表11).

将0.2 M NaCl与纯化的大鼠睾丸Ap-B蛋白或杆状病毒系统中表达的重组酶一起添加，可使活性增加3倍[4,29]. 因此，通过在pH 7.4的0.1 M硼酸盐缓冲液中存在0到2 M的不同浓度NaCl时检测细菌重组His-rAp-B活性来研究NaCl的影响（图。​（图2）。2). 在75–400 mM NaCl范围内观察到类似的活性增加（约3倍），在200 mM时最大增加，随后出现强烈抑制。

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NaCl浓度对His-rAp-B酶活性的影响使用材料和方法中所述的标准分析方法，在指定的NaCl浓度下测量活性。活性表示为在200 mM NaCl存在下获得的His-rAp-B酶的最大活性（100%）。条形图表示3个或更多单独分析的SEM。

以L-精氨酸-β-NA为底物研究His-rAp-B的抑制剂谱。如表所示​表2，2，重组酶具有金属肽酶的特性，在毫摩尔和微摩尔浓度下，EDTA和邻菲咯啉分别抑制其活性。rAp-B活性不受丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF的影响。如预期，氨肽酶抑制剂，如贝沙汀（Ki=50 nM对从昆虫细胞纯化的Ap-B为100 nM）或arphamenine A和B（Ki=20 nM对40 nM（从昆虫细胞中纯化的Ap-B）在微摩尔浓度下工作。因此，重组酶的酶学性质与睾丸蛋白相似。

表2

抑制剂对His-rAp-B活性的影响。

抑制百分比（L-Arg-β-NA底物）
抑制剂最终浓度睾丸酶*大肠杆菌酶
邻菲罗啉500微米7680
250微米5567
100微米276
50微米-0
乙二胺四乙酸10毫米9571
5毫摩尔8465
1百万3453
内姆1毫摩尔4571
PMSF公司500微米05
贝斯塔丁100微米-100
50微米10098
1微米6894
阿法美宁A1微米100100
500纳米-97
200毫微米-92
100毫微米-87
阿法美宁B1微米100100
500毫微米-100
200毫微米-99
100毫微米-95

通过参考无抑制剂情况下His-rAp-B的底物转化量计算抑制率（见材料和方法部分）。数值是三个独立系列试验的平均值，其中每一点重复进行三次。（*来自[4]）

HEXHX的定点突变18E rAp-B基序

为了探讨之前在M1家族其他成员中鉴定的几种氨基酸的功能作用（有关综述，请参阅[30])，对保守HEXHX的研究18E基序通过定点突变进行（表​（表3）。三). BLi5中表达突变大肠杆菌应变。然后分别通过Ni-NTA琼脂糖层析或DEAE离子交换柱纯化或半纯化相应的蛋白质，并在SDS-PAGE和Western blot上显示出与野生型酶类似的单一条带（数据未显示）。H325H、E326E、H329H和E348E等保守突变体构成阳性对照。

表3

野生型和突变型酶的活性。

突变位点突变体数量突变密码子突变体活动百分比
H（H）325CAC公司野生型100
三猫H（H）100
2周转时间Y（Y）0
5通用条款A类0
6TTC公司F类0
E类326阻塞野生型100
2公认会计准则E类100
2GCG公司A类0
4CAA公司问0
三关贸总协定D类0
7猫H（H）0
H（H）329CAC公司野生型100
三猫H（H）100
4通用条款A类0
三周转时间Y（Y）0
4TTC公司F类0
E类348公认会计准则野生型100
8GAG公司E类100
1CAG公司问0
2通用汽车公司D类0
4GCG公司A类0
三CAC公司H（H）0

分析了突变体的数量、突变密码子及其相应的氨基酸，以及酶活性的百分比。目标氨基酸在大鼠Ap-B序列中的位置已编号。以L-Argβ-NA为底物测定活性百分比。用两种纯化方法收集的酶进行三次活性测定。

三种锌结合配体中任何一种的突变H（H）EXX公司H（H）X（X）18E类保守基序（H325，H329，E348在大鼠Ap-B序列或肽酶反应E的关键通用碱基中326导致氨肽酶活性完全丧失（表​（表3）。三). 如E326Q/D和E348Q/D突变体所示，负电荷和侧链长度似乎对谷氨酸残基功能很重要。另一方面，H325Y/F和H329Y/F突变体的结果表明组氨酸的氮原子在螯合锌中起作用2+阳离子。

多序列比对

为了建立分子模型和进一步的定点突变研究的基础，我们对属于氨肽酶M1家族的蛋白质进行了多序列比对。使用大鼠Ap-B序列对Uniprot数据库进行BLASTP搜索，检索到512个蛋白质序列，其中500个最初被选择进行CLUSTALW比对。保留所选序列中的冗余以识别部分序列（NH2-和/或COOH终端截断；内部删除）、序列插入和排序错误。后一序列从多重比对中删除。因此，403个蛋白质的长度从407个不等(问题6L8I5,Kitasatospora刚毛)至1890年(问题22531,秀丽隐杆线虫)氨基酸残基对齐。

最长序列的检查(Q7PYD3年，1800个氨基酸，冈比亚按蚊;Q61J79号，1875个氨基酸，线虫;问题22531，1890个氨基酸，秀丽隐杆线虫)结果表明，这些蛋白质是从一个重复的基因翻译而来的，该基因串联编码M1家族中两种类似的氨肽酶。包含这3种蛋白质的第二个氨肽酶模块的COOH末端结构域从比对中删除。这些结构域与共识签名的后续比对显示出相同的保守氨基酸残基（数据未显示）。

另一方面，对最短序列的分析揭示了有趣的数据。事实上，这些蛋白质只显示了M1家族的两个共有基序中的一个，即Zn2+-结合位点HEXHX18E.第二个共有基序GXMEN通常位于锌上游约22至38个氨基酸2+-缺少绑定图案。仅谷氨酸似乎是保守的（图。​（图3三).

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氨肽酶O、大鼠氨肽酶B和放线菌氨肽酶序列的部分多重比对.序列使用Blosum62矩阵与ClustalW对齐。中心Zn的多重对齐2+褐家鼠（RnAp-O；AMPO_RAT）、小家鼠（MmAp-O）、智人（HsAp-O；Q5T9B3型)五倍子（GgAp-O；XP_425041.1型)和来自放线菌的氨肽酶(Q82MI5型,Q82JJ1型,第82页第16页,Q82GE5号机组,Q82KD2型,Q93H20型,Q82FV0型); 腔色链霉菌(问题9X7P2,Q9KXW8型,O69971号); Kitasatospora刚毛(问题6L8I5); 法氏诺卡氏菌(Q5Z264型,Q5Z2X1型); 棒状杆菌效率(问题8FSN0); 谷氨酸棒杆菌(问题8NTG8); 白喉棒状杆菌(Q6NJN5号机组)]如图所示。指出了褐家鼠Ap-B序列（RnAp-B；AMPB_RAT）的相应部分，以及Ap-B和Ap-O之间（RnAp-B序列之上）和放线菌氨肽酶序列之间（Rn Ap-B顺序之下）的保守氨基酸残基。Ap-O蛋白质之间或放线菌蛋白质之间的保守氨基酸残基分别显示在多重比对的上方（Ap-O线）和下方（放线）。在共有谱线中，所有序列中不变的氨基酸都用星号（H）表示，冒号（：）根据以下规则表示相似的残基：T:A:S；I： L：V：米；K： R：小时；D： E：问：否；F： 是；G；P；W；C.将GXMEN基序的位置装箱，并在相应的Ap-O和放线菌序列中突出显示保守氨基酸残基。六角头18E图案也突出显示。虚线代表空白。

这些蛋白质由放线菌门(阿维链霉菌:Q82MI5型497个氨基酸；Q82JJ1型463个氨基酸；问题82P16，454个氨基酸；Q82GE5号机组469个氨基酸；Q82KD2型489个氨基酸；Q93H20型483个氨基酸；Q82FV0型，532个氨基酸；腔色链霉菌：问题9X7P2，506个氨基酸；质量9k x重量8，473个氨基酸；O69971号，512个氨基酸；白喉棒状杆菌：Q6NJN5号机组，450个氨基酸；棒状杆菌效率：问题8FSN0466个氨基酸；谷氨酸棒杆菌：问题8NTG8、Q6M822、460氨基酸；法氏诺卡氏菌:Q5Z264型493个氨基酸；Q5Z2X1型461个氨基酸；Kitasatospora刚毛:问题6L8I5407个氨基酸；耐辐射球菌:Q9RVZ5型，472个氨基酸）。这18种密切相关的酶显然构成了M1氨肽酶家族的一个亚群（图。​（图3三).

人氨肽酶O（Ap-O）序列的最新发表[31])，一种与Ap-B和LTA相关的氨肽酶4H、 引导我们将该序列与M1家族其他成员的序列进行比较。注意，Uniprot数据库只包含人类Ap-O序列(第5季度第9季度,问题8WUL6,Q96M23型). 虽然Ap-O与Ap-B关系最为密切，但这两种酶之间的整体一致性很低（23.5%；LTA4H（H）对Ap-O，约20%）。由于长度差异很大（Ap-B，650个氨基酸；Ap-O，819个氨基酸），并且同源性和相似性百分比很低（32.8%），这两种蛋白质之间的进化关系尚不清楚。此外，M1共识签名的分析[GXMENX22–38六角X18E] 表明除了Ap-O人类序列中的Met残基外，GXMEN基序缺失（图。​（图3）。三). 通过分析从nr数据库中提取的不同序列（Genbank CDS翻译+RefSeq蛋白质+PDB+Swissprot+PIR+PRF），如AMPO_RAT，证实了这一观察结果(褐家鼠)，AMPO_老鼠(小家鼠),XP_425041.1号(五倍子),XP_541256.1号(家族犬)和CAG10896.1年(金娃娃)（未显示数据）。在M1家族中，Ap-O构成了第二个新兴亚群的唯一成员（图。​（图3三).

剩余的382个序列，包括Ap-B和LTA4H蛋白显示M1家族的两个一致模体，因此构成后者的第三个亚群。这382个序列的多重比对，长度从611（白三烯A4水解酶）到1025（促甲状腺素释放激素降解酶）氨基酸，可以鉴定出大约460个含有GXMEN基序和Zn的残基（包括间隙）的显著保守区域2+-结合位点（HEXXHX18E；图。​图4）。4). 该区域仅与Ap-B序列中的316个氨基酸残基重叠（来自Thr168到专业版389; 图。​图4）。4). 这一排列揭示了61个高度保守的位置。它们在几种不同的原核生物和真核生物肽酶中的保守性表明了它们在维持蛋白质结构完整性或与底物直接相互作用方面的潜在重要性。

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哺乳动物氨肽酶B和白三烯A的多重比对4水解酶序列和M1家族特征使用Blosum62矩阵与ClustalW进行序列比对。褐家鼠（RnAp-B；AMPB_RAT）、小家鼠（MmAp-B；NP_663392.1号)智人（HsAp-B；CAC14047.1号机组)和长期协议4H来自褐家鼠（RnLTA4H；S20444型)、小家鼠（MmLTA4H；JN0066）、智人（HsLTA4H；核电厂_000886.1)如图所示。间隙用破折号表示。整个M1家族多重比对产生的保守氨基酸位置（382个蛋白质）显示在比对下方。在这一共识中，98%以上的序列（>377/382）中不变的氨基酸以粗体和双下划线表示，90%以上一级结构（>343/382）的保守残基以粗体并下划线表示；85%以上的序列中保守残基（>324/382）在正常型中，80%以上的蛋白质序列（>305/382）中保守的氨基酸显示为粗体。星号表示根据以下规则的类似残留物：T:A:S；一： L:V:M；K： R:H；D： E：问：否；F： 是；G；P；W；C和根据上述百分比进行分类。垂直箭头指出在382个序列的多重比对中所示氨基酸残基之后存在一个或多个间隙（参见下面或箭头旁边的数字）。

随后使用PATTERN程序对Uniprot数据库进行搜索，使用多重比对中突出显示的保守残基获得共识氨基酸签名，结果显示HEXHX三G[密度]X6WX公司6E基序是M1家族特有的（检测到469个蛋白）。EX系列15–45六角X三G[密度]X6宽x6特异性检测到所有M1蛋白的E特征减Ap-O序列。使用其他保守氨基酸（如168-210或409-441区域）的不同特征的概念失败了。

Ap-B的分子模型

序列比对表明，大鼠Ap-B与LTA具有33%的同源性和48%的相似性4H.长期协议4H和Ap-B（分别为611和650个氨基酸）的大小相似。因此，LTA的晶体结构4H制作了一个合适的模板来模拟Ap-B 3D结构（参见附加文件1). 整体结构可以描述如下：Ap-B蛋白折叠成三种不同的NH2-末端（残基1–235）、催化（残基236–484）和COOH-末端（残基485–650）结构域以三角形排列，尺寸约为78×55×51º对LTA约为85×65×50º4H、催化中心位于三个区域之间形成的一条深深的裂缝上。NH2-末端结构域由一个由两个较小的β片包围的大的七品牌混合β片组成。这位NH2-终端域似乎形成了一个包络线，例如在LTA中4H、 向溶剂呈现一个大的凹面。

Ap-B和LTA的结构4H催化域非常相似。该结构域由两个叶组成，一个主要是α螺旋叶，另一个是混合α/β叶（图。5安培). 锌2+-结合位点（H325EXXHX公司18E类348)在Ap-B模型中，保持在两个叶之间，例如LTA4H（H）[27].

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Ap-B结构、共有基序和Zn的模型2+封闭残留物.（A）根据[27]，大鼠Ap-B的结构域结构。NH2-末端、催化和COOH末端域分别用绿色、红色和紫色表示。锌2+离子被描绘成一个球体，并被涂成灰色。（B）大鼠Ap-B结构域的表示由多序列比对和使用与上述相同颜色的保守氨基酸残基支持。（C）在整个Ap-B结构模型上表示Proline-rich环（位置47–57和485–499；表示为空格填充）和假定的RNP1共识基序（位置416–423；表示为球棒）。（D）催化中心的放大显示了锌之间的高度接近性2+离子（灰色球体），一方面是三种锌2+配体（His324，橙色；伊斯329，绿色；谷氨酸348，蓝色），另一方面，催化残留物Glu325（黄色）和催化反应中假定的质子供体（Tyr413，浅绿色）。结构的其余部分被描述为透明材料。该图是使用分子图形软件Visual molecular Dynamics（VMD 1.8.2；[60]）创建的。

Ap-B锌2+离子由他的协调325，他的329和Glu348H的残留325EXXHX公司18E类348图案（图5天). Zn之间的距离2+离子和他的325，他的328和Glu348分别为2.14欧、2.1欧和1.98欧。由于序列比对的贡献，可以对催化结构域进行更精确的定义。事实上，多重比对强调了316个保守氨基酸区域，这导致了对整个区域外肽酶活性的功能作用的假设。在这种情况下，LTA的催化域4H和Ap-B蛋白延伸到NH2-前面描述的终端结构域([27]; 残留物168–489用于Ap-B）采用马蹄形（图。5-B类). 正如预期的那样，由于这两种蛋白质在该区域的相似性很高，构成假定底物结合囊的疏水腔是保守的（数据未显示）。

COOH端域由排列成两层的α螺旋形成（图。5安培和​和5B）。5亿). 内层包含5个平行的α-螺旋。外层由四条反平行螺旋线组成，垂直环在顶部包含短螺旋段。这个螺旋线圈，也在LTA中发现4H结构，看起来像犰狳重复序列或HEAT（Hungtington-Elongation-A-子单元-TOR；供审查[32])适合蛋白质相互作用的基序[33-35]. LTA的超螺旋结构域4H一级结构从残基463开始，从Ap-B的位置496开始（图。5-A、-B; 图。​图6）6)它以蛋白质结束。

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大鼠Ap-B和人LTA一级和二级结构的比较4H（H）大鼠Ap-B（RnAp-B）和人类LTA的一级结构比对4H（HsLTA4H）与从Ap-B模型（上线）和LTA推导出的二级结构进行了比较4H晶体结构（下线；PDB登录号：1HS6系列; [27]）使用Procheck软件。使用Procheck软件计算的残留物可及性用颜色代码表示（见下文）。使用被子法在每个蛋白质中检测到的五个疏水性斑块也显示在每个酶的一级结构中。颜色代码（从大到小；另请参阅结果部分和图8）分别为：红色、绿色、洋红色、青色和黄色。虚线代表空白。二级结构方案中使用的符号显示在图的底部。

结构分析

两种结构的详细比较突出了Ap-B结构模型和LTA之间的差异4H蛋白结构。不同二级结构的总百分比不同（Ap-B:α-螺旋，42%；β-片，14%；环，44%对长期协议4H： α-螺旋，46%；β-片，23%；回路，31%）。在从第一个30 NH中删除的模型中2-与LTA非同源的末端残基4由于这两种蛋白质的长度不同，这些百分比可以估计为Ap-B到：α-螺旋，44%；β-片材，15%；回路，41%。如图所示​图6，6β-片百分比的差异主要是由于排列中存在间隙以及NH中两种蛋白质之间的弱相似性2-末端区域（Ap-B序列中的残基1–133）。结构的进一步细化可能会略微改变环/β相对百分比，但将保持以下所述的主要特征。

二级结构线形的其余部分显示出高度同源性（图​（图6）。6). 一种由三种氨基酸组成的非常小的平行双链β-片（LTA4H、 V（V）307TN公司309和K418硅420; Ap-B、V336TN公司338和Q448硅450)α螺旋正好位于β片的上游（LTA4H、 位置291–300；Ap-B，位置320–329）在LTA之间保守4H和Ap-B模型（图。​（图6）。6). 这种螺旋结构携带锌的第一部分2+-装订图案（HEXH）。在这两种结构中，一个大的α-螺旋（LTA4H、 位置315–334；Ap-B，位置344–363），其中含有第三个锌2+配体（E319)位于这个小β片的两股之间。这个α螺旋后面是一个环（LTA4H、 位置365–374；Ap-B，位置394–404），形成并限制基板结合囊的一侧。

然后，在这两种蛋白质中，另一个α-螺旋（LTA4H、 位置382–397；Ap-B，位置412–428），垂直于包含HEXH基序的α-螺旋，携带LTA4H Tyr公司384残留物（Ap-B、Tyr414距锌3.25º2+Ap-B模型中的离子；图5天)被认为是催化反应中的质子供体[36]. 最后，第四个α-螺旋（LTA4H、 位置401–415；Ap-B，位置431–445）将一级结构带回第一股，形成第二股和小β板。应该注意的是，在Ap-B和LTA中发现的三种氨基酸的小平行双品牌β-片4H在F3和ePepN结构中也保守（数据未显示）。这种小β-片结构可能很重要，因为它似乎连接并维持了两个重要的二级结构，这两个结构包含催化和锌中涉及的保守残基，而不考虑其大小而具有太大的刚性2+结合。

如LTA所述4H型结构[27]，在Ap-B模型中也发现了一个位于环中的SH3样基序（P-XX-P基序；位置449–462）（位置485–499；图。5-丙，图。​图6）。6). 然而，Ap-B结构模型也在位置47-57处显示出第二个富含脯氨酸的环（图。5摄氏度，图。​图6）。6). 这些图案由相当容易获得的残留物组成（图​（图6）6)可以构成假定的蛋白质相互作用结构域。

Ap-B一级结构分析显示存在高度保守的RNA结合RNP1基序（K416GYCFVSY公司423; 图。​图6；6; 核糖核蛋白1；[37])通常见于真核生物hnRNP和snRNP中。整个RNP基序通常由两个基序（RNP2，6个氨基酸；RNP1，8个氨基酸）组成，由大约30个氨基酸残基隔开。

Ap-B RNP1基序（K416GYCFVSY公司423)发现于富含脯氨酸环上游的α-螺旋中（位置485-499）。RNP1序列被这个环所掩盖，后一个结构的摆动可能会使假定的RNA-结合位点可以到达其底物（图5摄氏度; 图​图6）。6). 泰尔413残基（质子供体）也属于这种α-螺旋。在Ap-B一级结构中未发现RNP2一致序列。

为了在Ap-B模型和LTA之间进行更精确的比较4H、 计算了两种蛋白质分子表面的静电势。图​图77表示LTA分子表面上显示的静电势图4H（PDB加入编号，1HS6系列; 左栏）与Ap-B模型（rAp-B；右栏）进行比较。四种不同的取向及其对应的3D带状结构显示了两种蛋白质的四个不同侧面。电位标度范围为-7 kT/e至7 kT/e（从红色到蓝色）。两种酶之间的静电势分布存在显著差异。rAp-B显示出较高的负电位（图​（图7，7方向1、2和3），尤其是在催化领域。总之，Ap-B的α-螺旋结构域和β-片状结构域似乎分别表现出一般的负电位和中性/正电位。相反，LTA的α-螺旋和β-片结构域4H分别表现出一般的中性/正负电位。有趣的是，图中的方向1​图77显示了在对应于活性位点（底物结合位点）的Ap-B分子中心，LTA的负电位与中性/正电位4H。

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LTA的静电势分布4H和Ap-B蛋白用DELPHI计算了这两种蛋白质具有静电势的分子表面。电位标度范围为-7 kT/e（红色）至7 kT/e（蓝色）。左栏，LTA分子表面显示静电势图4H（PDB加入编号，1HS6系列). 右栏，静电势图显示在Ap-B模型（rAp-B）的分子表面。代表了四个不同的方向（1到4；每个方向代表大约90°的旋转）。还显示了每个蛋白质的相应三维结构和方向。该图形是使用分子图形软件PyMol（PyMolv0.99；[61]）创建的。

据预测，疏水性斑块与蛋白质相互作用有关。在Ap-B和LTA上对这些斑块进行了研究，这些斑块被定义为在给定表面上可接近的相邻非极性原子簇4H结构。总数（Ap-B，264512; 长期协议4H、 23460奥2)，疏水（Ap-B，17550º2; 长期协议4H、 13629奥2)和水生植物（Ap-B，88932; 长期协议4H、 9831欧2)这两种蛋白质的可接触表面都是用被子法测定的。Ap-B的疏水表面（占总表面的66%）略高于LTA4H（总表面的58%）。关于LTA4H蛋白，检测到约120个小的疏水斑块。它们的表面范围从18到298.2Å2团簇包含1到12个残基的原子。LTA的五个较大的疏水斑块4H（298.201Å2，11个残基；289.193 Å2，12个残留物；282.972 Å2，10个残留物；280.027 Å2，11个残留物；262.926 Å2，7个残基）如图所示​图66和​和8。8。其中一些补丁似乎与分子表面有关，可能构成更大的疏水表面。陆路交通管理局4H较大的疏水斑块主要位于α-螺旋结构域。

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长期协议4H和Ap-B疏水贴片。使用被子方法确定疏水性贴片。A-B：LTA的两种不同观点4H型结构（1HS6）。LTA的五个较大的疏水斑块4H（298.2001年2，11个残留物，红色；289.193 Å2，12个残留物，绿色；282.972 Å2，10个残留物，洋红；280.027 Å2，11个残留物，以青色表示；262.926 Å2，7个残留物，黄色）。C、 D、E、F：Ap-B模型（rAp-B）的四种不同视图。Ap-B的五个较大的疏水性斑块（1000.0702，30个残留物，红色；795.016 Å2，31个残留物，呈绿色；645.299 Å2，21个残基，洋红；522.096 Å2，15个残留物，以青色表示；519.139 Å2，11个残基，以黄色表示）。该图形是使用分子图形软件PyMol（PyMolv0.99；[61]）创建的。

Ap-B分子的表面表现出约110个疏水斑块。其表面范围为4.8至1000.070º2这些团簇含有5到30个残基的原子。Ap-B的五个较大的疏水性斑块（1000.0702，30个残留物；795.016 Å2，31个残基；645.299 Å2，21个残基；522.096 Å2，15个残留物；519.139 Å2，11个残基）也表示在图中​图66和​和8。8.其他七个补丁，大于300°2（344.229至517.249欧2，9到20个残基）。对于LTA4H、 其中几个补丁似乎是相关的（图。​（图66和​和8）。8). 补丁1的关联（1000.0702，30个残留物，图中为红色。​图66和​和8）8)和补丁5（517.249º2，图中为11个残留物，黄色。​图66和​和8）8)构成约1500º的疏水表面2如果丢弃位于indel区域且尚未细化的第一个最大补丁，则第二个补丁位于Ap-B结构的β片域中，其中第二个富含脯氨酸的环（位置47-57；图。5摄氏度)也找到了。其他三个团簇位于α-螺旋结构域中。

讨论

在本研究中，我们首先将大鼠Ap-B CDS克隆到大肠杆菌表达式向量。重组rAp-B由NH产生2-末端组氨酸标记并进行了表征。结果表明，表达的蛋白质在免疫反应性、动力学参数、底物特异性、NaCl依赖性和抑制剂敏感性方面与大鼠对应物具有相同的生化特性。因此，这种重组酶完全可以用于酶的研究。

为了证实保守的HEXHX的功能作用18先前在M1家族其他几种酶中研究的E基序（有关综述，请参阅[30])采用定点突变方法进行了研究。正如预期的那样H（H）325EXX公司H（H）329X（X）18E类348rAp-B序列或肽酶反应E的关键通用碱基的基序326导致氨肽酶活性完全缺乏。

同时，对氨肽酶M1家族进行多重比对，以研究与外肽酶活性有关的残基的保守性，这些残基构成了进一步定点突变研究的最终目标。我们的结果清楚地表明，3个亚群或亚家族构成了当前的M1氨肽酶家族。这些亚组之间的主要区别在于Zn上游GXMEN基序的存在或部分缺失2+-结合位点。第一个子家族仅限于放线菌门（Gly、Met、Asn的损失和Glu的保存）。第二个亚家族（缺乏Gly、Glu、Asn和Met守恒）仅由脊椎动物中表达的一个成员组成（Ap-O[31]). 有趣的是，对M1家族（氨肽酶A、Ap-A、[38]; 氨肽酶N，Ap-N[39]; 促甲状腺素释放激素降解酶，TRH-DE[40]; 长期协议4H、[41])提示谷氨酸和天冬酰胺残基与过渡态稳定有关。此外，这些残留物可能与NH相互作用2-底物的末端也被怀疑与氨肽酶的特异性有关。甘氨酸残基（TRH-DE、Ala除外对Gly）似乎对活性至关重要，因为用较大或极性残基取代它会消除活性[40]. 最后，蛋氨酸的突变同时影响Km和Vm，但未提出该残基的确切作用[42]. 同时，伊藤和合作者[43]证明这种Met残基与不同底物的识别有关，解释了酶的广泛特异性。蛋白质的酶活性数据放线菌门子系列尚不可用。Diaz-Perales和合作者展示在体外Ap-O是一种对Arg和Asn残基具有特异性的氨基肽酶[31]. 进一步研究这些蛋白质之间的进化关系，特别是它们的酶特性，是掌握这些氨基肽酶在细胞代谢基本过程中的生理作用的主要目标。

为了研究Ap-B的催化机理，我们使用了分子模型。在目前的工作中，我们根据人类LTA的晶体结构生成了一个大鼠Ap-B结构的分子模型4H（H）[27]. Tricorn相互作用因子F3（F3）的晶体结构[44])氨肽酶N的大肠杆菌（ePepN[43,45])，M1家族的另外两名成员与LTA的认同度低于25%4H和Ap-B被认为与Ap-B没有密切关系。此外，F3中存在4个结构域[44]和ePepN[43,45]. 有趣的是，第四个结构域正好插入多重比对中突出显示的保守氨基酸区域的上游（图。​（图4，4，位置490）。Ap-B模型与LTA相当相似4H结构，尤其是在其催化域水平上。检查两个结构中Zn之间的距离2+离子和螯合残基His325，他的328和Glu348，以及基底结合囊的形状和大小显示出完美的同源性。

Ap-B结构模型也用于检验生物信息学预测域。Ap-B一级结构包含一个高度一致的RNA结合RNP1基序[37]. 整个一致的RNP基序由两个基序RNP2和RNP1组成，它们都高度保守，通常以简单或多拷贝（1到4）的形式存在。RNP结构域折叠成一个紧密且疏水的αβ结构（βαβ拓扑，由两个α螺旋相互垂直构成的四个反平行β片）。RNP1和RNP2位于两条中央（带下划线）链β4中-β1–β3-β2.在Ap-B中，RNP2基序的缺失以及RNP1不包含在β-表中的事实可能会阻止RNA结合中的功能作用。事实上，这种RNP1基序的存在可以归因于基因重复和进化过程中核功能丧失导致的残留持续性。相反，在Ap-B结构中存在不同的RNP结构域可能导致这样的假设，即该蛋白通过新结构域和新结构获得了新的相互作用。RNP1可能具有功能性，并与RNP2以外的其他基序形成特定结构。事实上，Ap-B一级结构包含假定的核定位序列，一些数据支持这种外肽酶可以迁移到核隔室的假设（未发表的结果）。进一步研究应证明Ap-B是否也是核蛋白。在这种情况下，RNP1基序的作用仍有待阐明。

LTA的COOH终端域4H和Ap-B显示出类似于犰狳重复序列或HEAT域的结构区域。这些褶皱通常由3到36对反平行α螺旋组成，它们一起形成超螺旋。α-螺旋在热区通常有37至47个氨基酸长，在armadillo重复序列中约有40个氨基酸长。含有这些基序的已知蛋白质在蛋白质-蛋白质相互作用/识别中具有共同的功能[33-35]. 虽然Ap-B和LTA中的假定域4H表现出较短的α-螺旋（最多15个残基），两种结构中的超螺旋折叠可能导致相互作用强度的变化和/或不同的相互作用蛋白。

除了潜在的HEAT结构域外，Ap-B还表现出其他一些特征，例如假定的SH3结构域、负静电势、大的疏水斑块，从而导致该酶可能与不同功能的不同伙伴相互作用的假设。这些字符通常与LTA的字符不同4H和已被提议的结构模型突出显示。Ap-B和LTA之间静电势分布的差异4H可能反映了假定的（或不同的）蛋白质-蛋白质相互作用。Ap-B与细胞外细胞质膜相互作用，这种相互作用可能通过蛋白质相互作用发生[4,19]. Ap-B可能与不同的内肽酶一起参与神经肽和原激素的初始成熟过程，这可能涉及内肽酶/氨肽酶复合物[4,15-18]. 类似的作用可归因于疏水性斑块，它描绘了假定的相互作用表面。Ap-B的疏水斑块比LTA大4H.另一方面，催化位点水平的负静电势可能解释酶特异性的差异以及它们各自底物之间的差异：LTA为负4H、 确实，在这两种酶（Ap-B，K395轻轨车辆KIEPGVDPDTY410; 长期协议4H、 K（K）364LVVDLTDIDPDVAY公司378; 图。​图4），4)，从蛋白质表面划定并分离活性中心。如定点突变研究（LTA）所示，这个含有小α-螺旋的环似乎与底物特异性有关4H、[46]; TRH-DE[47]; Ap-B、[48])和结构数据（LTA4H、[27]). 对相应序列的详细检查表明，LTA4H序列比Ap-B序列更疏水，后者显示出大量的碱性氨基酸。此外，酸性残基在两个回路中的分布也有显著差异。它们定期在陆路交通管理局分发4H环结构，而是聚集在Ap-B环的一端，最后一个天冬氨酸残基属于指向活性位点的小α螺旋。

这可能解释了Ap-B底物的亲和力和定位。碱性肽底物可能被负静电势吸引到蛋白质表面和活性部位。然后，底物可以通过疏水残基和碱性残基的存在而被引导到活性中心，直到与带负电的天冬氨酸发生更强的相互作用。α-螺旋的存在可能会给底物结合机制带来一定的精度和稳定性，从而平衡环的灵活性。

结论

提出的结构模型是在原子尺度上更好地理解Ap-B蛋白的首次尝试。基于LTA折叠的Ap-B 3D模型4H、 产生了重要的附加信息，为设计新的实验开辟了道路。例如，这里计算的静电势本质上是只能从3D结构计算的特征，它们是由给定点中原子所有电荷贡献的叠加而成。因此，简单的序列分析无法预测静电值。我们在这里描述的结果清楚地说明，为了检测蛋白质的精细表面特性，有必要进一步描述主要折叠特征。与LTA相比，这些功能的重要差异4H毫不含糊地表明，合作伙伴与Ap-B（环境影响）互动的性质或方式将不同于LTA4H.尽管Ap-B的完整生理功能尚待发现，但之前的数据支持这样的假设，即Ap-B涉及广泛的相关生理现象。Ap-B的特异性外肽酶活性参与神经肽和激素加工的最后步骤（综述见[15-17,49]). 此外，这种酶与炎症和/或肿瘤生长有关[23,24]. 后面这些角色可能是由于在体外Ap-B水解LTA的剩余容量4成为炎症的脂质介质，LTB4[18]. 在缺乏高分辨率晶体结构的情况下，如氨肽酶A所示[50,51]以及许多其他蛋白质，该模型构成了一个强大的工具，用于研究Ap-B和M1氨基肽酶催化位点中保守残基的重要性和可能的作用，并对其生理功能有新的了解。

方法

原核重组rAp-B表达载体的构建

大鼠Ap-B cDNA最初被克隆到SrfI-消化的pPCR-Script载体（美国拉荷亚州斯特拉赫纳）中，以获得prAp-B质粒[29]. prAp-B和pIVEX2.4表达载体（法国梅兰罗氏诊断公司）均用NcoI和BamHI限制酶消化。将得到的Ap-B cDNA片段分离、纯化（QIAquick gel extraction kit，Qiagen，Hilden，Germany），并将（T4 DNA连接酶，New England Biolabs，Hertfordshire，England）连接到消化后的pIVEX2.4质粒中，以获得pIVEX2.4-Ap-B重组质粒，并通过测序进行检查（Genome Express facilities，Meylan，France）。

大肠杆菌中大鼠Ap-B的产生

为了生产rAp-B，我们使用了T7启动子驱动系统和BLi5大肠杆菌菌株[52]. 将添加20μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄西林的10毫升LB培养基接种到含有pIVEX2.4-Ap-B重组质粒的Bli5细胞，并在37°C下搅拌培养过夜。然后用50 mL含有100μg.mL的新鲜LB培养基将过夜培养物稀释至1:50-1氨苄西林，在37°C的剧烈摇晃下生长，直至OD600达到0.6。将异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG；Sigma-Aldrich，Saint Quentin Fallavier，France）添加到1 mM的最终浓度，并在37°C下搅拌培养2小时。然后通过4000×g离心5分钟收集细胞，并在-80°C下保存，直至使用或立即按照下文所述进行处理，以进行Western印迹、纯化和酶活性分析。

重组His-tagged大鼠Ap-B的纯化

Ni-NTA琼脂糖纯化将来自表达培养物（见上文）的pIVEX2.4-Ap-B转化细胞颗粒重新悬浮在5 mL裂解缓冲液（5 mM咪唑，0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl，pH 8）中，并在40 Mccycles下超声处理，在4°C下1 min内3次。将提取物以10000×g的速度在4°C下离心5 min，以使细胞碎片颗粒化。收集上清液并与Ni-NTA琼脂糖（v/v；德国希尔顿基亚根）混合，并使用裂解缓冲液进行预平衡。将混合物在4°C下轻轻混合培养1小时，并应用于重力流色谱的微型柱。用3至5 mL洗涤缓冲液（40 mM咪唑，2 M氯化钠，20 mM Tris-Hcl，pH 8）洗涤柱3次。最后，使用100 mM咪唑、200 mM NaCl和20 mM Tris-HCl组成的缓冲液，在pH值为8的条件下，通过4次连续洗脱来洗脱His-tagged纯化蛋白。DEAE离子交换柱净化.将回收的上清液（5 mL，见上文）在50 mM Tris-HCl（pH 7.2）和1 mMβ-巯基乙醇中稀释至30 mL。然后将溶液应用于DEAE Trisacryl Plus M离子交换柱（100 mL床体积；法国维伦纽夫拉加伦内BioSepra），在50 mM Tris-HCl pH 7.2中进行预平衡。使用0至100 mM KCl的连续梯度洗脱蛋白质。使用搅拌超滤池（Amicon，型号8050；超滤膜YM 30；Millipore Corporation，Bedford，MA，USA），将所得活性组分（5mL）浓缩并在50mM Tris-HCl pH 7.2，1mMβ-巯基乙醇中平衡。

使用Bradford方法进行纯化程序的不同步骤中的蛋白质浓度的测定。使用其摩尔吸光度系数（105.530，280 nm）计算纯化的Ap-B的浓度。

蛋白质印迹

将BLi5或pIVEX2.4-Ap-B转化的细胞重新悬浮在添加2 mg/mL溶菌酶的PBS中。通过25号针头的15个通道和4°C下40 Mccycles的3个1分钟超声步骤完成裂解。蛋白质提取物在4°C下以4000×g离心5 min。保留含有可溶性细胞内蛋白的上清液。在变性条件下，在8%聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上对蛋白质提取物或纯化蛋白质的等分样品进行处理。然后，使用半干印迹设备（Hoefer scientific instruments，San Francisco，USA）将它们转移到硝化纤维膜（0.45μm，Schleicher&Schuell，Dassel，Germany）上。用特异性抗Ap-B多克隆血清检测大鼠Ap-B[4]稀释度为1:2000。使用山羊碱性磷酸酶偶联二级抗体（法国圣昆廷·法拉维的Sigma-Aldrich）和NBT-BCIP混合物（法国圣奎廷·法拉维耶的Sigma-Aldric）观察抗原-抗体复合物。SDS-PAGE凝胶用银盐染色[53]可视化蛋白质。

定点突变

pIVEX2.4-Ap-B重组表达载体用于定点突变，并使用QuickChange生成突变体®符合制造商规范的多点定向突变试剂盒（Stratagene Europe，Amsterdam，Netherlands）。该系统允许使用含有简并密码子的寡核苷酸随机化目标氨基酸（见下文）。所有用于诱变的引物都是5’-磷酸化的。每个实验中每个位点使用一个寡核苷酸。目标氨基酸及其相应的诱变引物如下：H325，5'-TGTGGAGATCTC自动标签阅读器H325Y和H325H突变体的GATGAGATCGG-3'，5'-TGTGGAGATCTC公认会计准则H325F突变体GATGAGATCGG-3'，5'-TGTGGAGATCTCGGC公司H325A突变体的GATGAGACGTCGG-3’；E326，5’-ACTGTGAGAGATSTT公司E326Q和E326E突变体的GTGGATGACGTC-3'，5'-ACTGTGGGAGATCKC公司E326A和E326E突变体的GTGGATGACGTC-3'，5'-ACTGTGGGAGAT世界贸易委员会E326D和E326E突变体的GTGGATGACGTC-3'，5'-ACTGTGGGAGAT通用技术协议E326H突变体的GTGGATGACGTC-3'；H329，5'-TTCCCCAAACCT公司自动标签阅读器H329Y和H329H突变体的GGAGATCTCGTGG-3'，5'-TTCCCAACCT公认会计准则H329F突变体的GGAGATCTCGTGG-3'，5'-TTCCCAACAACAACTGGC公司H329A突变体的GGAGATCTCGTGG-3'；E348，5'-CATGGTGAAGCC多媒体电话通信E348D和E348E突变体的ATTGGCCAGAATTC-3'，5'-CATGGTGAAGCCCKC公司E348A和E348E突变体的ATTGGCCAGAATTC-3'，5'-CATGGTGAAGCCCTS公司E348Q和E348E突变体的ATTGGCCAGAATTC-3'，5'-CATGGTGAAGCCGTG公司E348H突变体的ATTGAGCAGAATTC-3’。突变体如H325H、E326E、H329H和E348E是保守突变体。在寡核苷酸序列中突出了诱变密码子。简并密码子编码为：R=A，G；S=C，G；K=G，T；W=A，T；M=A，C。通过使用双脱氧链终止程序对两条链进行直接测序，鉴定产生的突变体（Genome Express设施，法国梅兰）。

酶活性测定

使用L-精氨酸和L-赖氨酸-β-萘胺（L-Arg-β-NA，L-Lys-β-NA；Sigma-Aldrich；Saint Quentin Fallavier，法国）底物和一种特殊抑制剂arphamenine B（Sigma-Aldrich；法国Saint Quetin Fallavir）测定大鼠Ap-B活性，如前所述[4]. 简言之，蛋白质提取物在37°C的分析缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4）中预先与1μM arphamenine B孵育15分钟，然后在37°C的含有0.2 mM L-Arg-β-NA的分析缓冲溶液中孵育60分钟。通过添加0.3 mL新制备的显色剂（快速石榴石GBC盐；Sigma-Aldrich；法国圣昆廷·法拉维）。使用分光光度计在535 nm处读取吸光度。rAp-B活性的百分比（相当于抑制百分比）是通过与未使用抑制剂的值进行比较来测量的。尽管在纯化或半纯化蛋白质中未检测到其他肽酶活性，但如上所述使用野生型His-rAp-B酶进行活性测定。

序列分析

BLASTP程序2.2.10版[54]使用默认参数（BLOSUM62矩阵）识别金属外肽酶M1家族成员。使用大鼠Ap-B蛋白序列查询Uniprot数据库（版本29.0）（登录号U61696号机组; [18])共观察到512次点击。在这些点击中，500个氨基酸序列的E值在0到1.E之间-8已选定。使用CLUSTALW 1.0版对这500个蛋白质序列进行比对；[55]. 手动调整对齐以最小化间隙数。从比对中删除了因测序错误而出现明显误译的序列。序列描述和初始和最终多重比对的完整列表可根据要求提供。PATTERNp程序[56]用于定义M1家族的共有氨基酸特征。

分子建模

同调模型的构造如[57,58]. 简单地说，模型是用Modeller软件包6.2版本构建的，使用白三烯A4水解酶与锌离子和bestatin复合物的3D结构作为模板[27]. 在模板结构中，bestatin分子位于隧道状空腔中。在该模型中，我们没有考虑bestatin分子，原因有二：i）优化整个复杂结构需要进一步的理论参数，ii）使空腔自由，可以比较两种结构中隧道的物理化学特征的差异或相似性。

使用的对齐方式如图所示​图44和​和6。6在构建的100个主要不同于独立区域的模型中，选择了具有最佳目标函数的3D模型（“初始模型”）。然后使用Scwrl3.0软件重新定位侧链。锌离子被放置在LTA晶体结构中观察到的等效位置4H.以能量最小化的方式进行结构优化在真空中NAMD包使用Charmm力场参数。库仑相互作用的12º截止值与8º开关距离结合使用。最小化过程分两步进行：i）蛋白质的所有原子都固定，而锌离子可以自由移动，然后ii）所有侧链和锌离子都可以自由重新定向，但主链保持固定。执行最小化程序，直到梯度公差为10-6达到或更少。我们没有进行任何进一步的最小化，释放所有原子，因为没有适当的显式环境，也没有最好地保持最佳口袋的大小。使用Procheck评估结构的几何质量。使用meta-serverbioserv上的3D-evaluation工具测试了模型的质量[59]. 该模型被认为与Verify3D、ProsaII和Eval23D配合良好，尽管最后两种方法的平均得分较低。

结构分析

Ap-B模型的结构分析如所述[57,58]. 使用CastP服务器探索最小化结构中的凹腔。

用Delphi计算静电势。电介质内部和外部分别固定为4和80。计算是在零盐浓度下进行的。选择的探针半径等于1.4°。电荷和半径与PARSE参数相对应。在使用MSMS软件计算的表面上绘制电位。对LTA的等效域进行了类似的计算4H结构，对应于两个序列之间的对齐区域。

根据被子方法计算表面上的疏水斑块。结果取决于可以指定的不同参数：原子半径、探针半径、极性膨胀和每个原子的点密度。按照原始出版物中的建议，计算极性原子半径（与探针半径相同）的膨胀值为1.4º。每个原子的点密度等于252。根据作者提出的随机化过程评估贴片的统计相关性。我们为评估选择了10次迭代。

缩写

Ap-B公司：氨肽酶B；rAp-B：大鼠氨肽酶B；His-rAp-B：His标记的大鼠氨肽酶B；长期协议4高：白三烯A4水解酶；长期协议4:白三烯A4;长期借款4:白三烯B4;His-tag公司：组氨酸标签；PMSF公司：苯基甲基磺酰基氟化物；国家电力公司：N-乙基马来酰亚胺；Ap-O：氨肽酶O；TRH-日期：促甲状腺激素释放激素降解酶，HEAT域：Hungtington-Elongation-A-子单元-TOR；注册护士：核糖核蛋白；第3层：Tricorn相互作用因子F3；电子产品采购编号：氨肽酶N来自大肠杆菌.

作者的贡献

VLP、MSC、CGD、MCB和TF参与了Ap-B表达载体的构建。VLP、MSC、CGD和CH进行了重组酶的生产，参与了酶的纯化及其生化表征。VLP和TF进行了多次比对，所有作者都为其最终版本提供了帮助。VLP、MSC、CGD、CH和TF参与定点突变和核苷酸序列分析。CE进行了分子建模。VLP、MSC、PN和CE参与了结构分析。MSC、PN和TF构思了该研究，并与VLP一起负责研究设计和协调。TF是进行本研究的ARC 5868项目的项目经理。VLP、MSC、CE和TF起草了手稿，MCB和PN批判性地阅读了手稿。所有作者都阅读并参与了文本和图表的修订，并批准了最终提交的版本。

补充材料

附加文件1：

rAp-B的结构模型。提供的数据允许可视化rAp-B的3D结构模型。

单击此处获取文件（790K，pdb）

致谢

这项工作得到了癌症研究协会（TF ARC 5868）、皮埃尔和玛丽·居里大学（UPMC，FRE2852）、丹尼斯·狄德罗大学（UMR S 726）、国立圣特医学研究所（INSERM，UMR S 726）的部分资金支持和国家科学研究中心（CNRS，FRE2852）。我们感谢J.M.Betton博士（巴斯德研究所）和C.Piesse博士（UPMC，IFR83）的有益讨论和对这项工作的持续关注，并感谢J.M.Betton医生对BLi5大肠杆菌菌株的厚礼。我们特别感谢UPMC的UFR des Sciences de la Vie（UFR927）及其董事R.Lafont教授的宝贵帮助和考虑。

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