Flow (shear stress)-induced endothelium-dependent dilation is altered in mice lacking the gene encoding for dystrophin

Laurent Loufrani; Khalid Matrougui; Diane Gorny; Micheline Duriez; Isabelle Blanc; Bernard I. Lévy; Daniel Henrion

doi:10.1161/01.cir.103.6.864

循环。作者手稿；PMC 2008年2月28日提供。

以最终编辑形式发布为：

循环。2001年2月；103(6): 864–870.

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哈尔姆斯：哈尔姆斯135482

PMID：11171796

在缺乏肌营养不良蛋白基因编码的小鼠中，血流（剪切应力）诱导的内皮依赖性舒张发生改变

劳伦特·劳弗兰,¹ 哈立德·马特鲁居伊,¹ 戴安·戈尼,¹ 米歇琳·杜利兹,¹ 伊莎贝尔·布朗,² 伯纳德·列维,^三和丹尼尔·亨利安^1,^*

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摘要

背景

肌萎缩蛋白在横纹肌体力的机械传递中起着关键作用。虽然细胞骨架元件在血管细胞内压力和流量的机械传递中起着主要作用，但肌营养不良蛋白在血管功能中的作用尚未被研究。因此，我们研究了从缺乏肌营养不良蛋白（mdx）的小鼠中分离的动脉的内皮和肌肉反应。

方法和结果

颈动脉和肠系膜阻力动脉（120μm直径）分离并安装在体外动脉造影仪中，以控制腔内压力和流量。缺乏肌营养不良蛋白不会影响血压。压力（肌源性）、苯肾上腺素和KCl诱导的张力没有变化。流（剪切应力）诱导的mdx小鼠动脉扩张减少了50%至60%，而乙酰胆碱或硝普钠的扩张不受影响。mdx小鼠动脉中对L-NAME敏感的血流直径也降低。因此，肌营养不良蛋白的缺失与剪切应力信号转导的缺陷有关。如免疫定位所示，肌营养不良蛋白存在于血管内皮细胞和平滑肌细胞中，并定位于质膜水平，如灌注的分离动脉的共焦显微镜所示。

讨论

这是首次对缺乏肌营养不良蛋白基因的动脉进行功能研究。血管反应性正常，但流致扩张除外。因此，肌营养不良蛋白可能在动脉内皮细胞的剪切应力-机械传递中发挥特殊作用。Duchenne氏营养不良等疾病的器官损伤可能会因动脉对血流的不良反应而加重。

简短摘要

肌营养不良蛋白在横纹肌机械力的传递中起着积极的作用。我们发现，缺乏肌营养不良蛋白（dystrophin，mdx）基因的小鼠分离出的动脉内皮流导致的剪切应力的机械传递发生了特异性改变，而其他形式的血管张力、扩张剂或收缩剂则不受影响。

因此，肌营养不良蛋白在动脉内皮细胞的剪切应力-机械传递中起着特殊作用。最后，血管对血流变化的缺陷性反应可能会加剧杜氏肌营养不良等疾病中的器官损伤。

关键词：乙酰胆碱、药理学、方差分析、动物、血流速度、血压、钙、药理学，颈动脉、药物作用、新陈代谢、肌萎缩蛋白、分析、缺乏、遗传学、内皮、血管、药物作用，生理学，人类，肠系膜动脉，药物作用，新陈代谢，小鼠，小鼠，近交mdx，显微镜检查，共焦、肌肉、骨骼、血液供应、药物作用、生理学、硝普钠、药理学、苯肾上腺素、药理学，氯化钾，药理学、信号转导、血管舒张、药物作用

介绍

流动（剪切应力）引起的扩张是控制血管张力的基本机制。剪切应力是血管内皮细胞的主要生理刺激，触发血管活性物质的释放¹^–⁷.它在控制器官的血流供应方面的作用是基本的⁷流诱导扩张使供血动脉适应每个器官的代谢需要⁷^,⁸剪切应力的机械传递涉及细胞外基质和细胞结构蛋白⁸^–¹⁸在剪切应力刺激下，F-actin快速解聚为G-actin¹²^,¹⁹中间丝波形蛋白基因的缺失大大降低了血管对剪切应力的反应²⁰肌营养不良蛋白是一种主要的细胞骨架结构蛋白²¹^–²⁸参与骨骼肌和心肌细胞的机械传导²¹^,²⁸^–³⁰虽然肌营养不良蛋白存在于血管平滑肌细胞中²⁵^,³¹^–³³目前还没有对血管进行功能性研究，尤其是对压力和流量等机械刺激的反应，压力和流量是血管张力和血液供应的主要影响因素¹^–⁸虽然可能会加速组织损伤，尤其是心肌和骨骼肌损伤，但在与肌营养不良蛋白相关的疾病（如杜氏肌营养不良症）中，从未研究过特定血管功能障碍的可能性，例如终末器官局部血流供应减少。因此，我们测试了以下假设：血管持续承受的两种主要物理力（压力和流量）的血管机械传递可能涉及肌营养不良蛋白，其缺失可能导致血管疾病。事实上，肌营养不良蛋白在膜结构蛋白和肌动蛋白细胞骨架之间具有关键地位，尽管在血管细胞中从未被准确描述过，肌动蛋白丝的断裂已被证明专门影响血管对血流的反应¹²我们使用了代表两种主要动脉类型的颈动脉和肠系膜阻力动脉，即大电导（或顺应性）动脉利用其弹性特性来阻尼心脏在每次收缩期和阻力动脉的血液喷射所产生的能量，利用其肌肉张力和内皮舒张能力来调节器官的血液供应。

方法

孤立动脉

Mdx小鼠及其对照（C57-Bl10）从Iffa Credo（L'Arbresle，France）获得。他们被麻醉，通过左颈动脉中的导管测量血压²⁰然后，在视频监控灌注系统中分离右颈动脉和肠系膜动脉，并在两端插管⁴⁴（LSI、Burlington、VT）如前所述²⁰^,³⁴^,⁴⁵^,⁴⁶简单地说，动脉浸泡在生理盐水中（pH 7.4，pO₂160毫米汞柱，pCO₂37毫米汞柱）。压力由伺服灌注系统控制，流量由蠕动泵产生。当腔内压力从10毫米汞柱增加到125毫米汞柱时，测量直径变化。然后，我们将压力设定为75毫米汞柱，并逐步增加流量。在每个实验结束时，对动脉进行灌注，并过量灌注钙²⁺-含有EGTA（2 mM）和硝普钠（10μM）重复压力步骤，以确定动脉被动直径²⁰^,³⁴^,⁴⁵^,⁴⁶.对苯肾上腺素的收缩（1nM至10μM）分别测试了KCl（80 mM）和钙（0.1至1 mM，无钙培养基+80 mM KCl）。在用苯肾上腺素（最大收缩的50%）预狭窄动脉后，测试乙酰胆碱和硝普钠的扩张情况²⁰^,³⁴.

组织形态计量分析

动脉的组织形态计量学如前所述在动脉造影仪上预先安装的动脉段上进行。将压力设置为75 mmHg，将血管固定在10%甲醛的盐水溶液中（30分钟），并切片（10μm厚截面）。使用自动图像处理器进行形态分析⁴⁵^–⁴⁷.

肌营养不良蛋白的免疫定位和原位共焦显微镜

动脉段安装在包埋介质中（Miles，Inc.，Elkhart，USA），在异戊烷中冷冻⁴⁵^,⁴⁶然后在横截面上进行免疫染色（5μm薄）与抗肌营养不良蛋白抗体（抗dys2，1:20，Novacastra）在4°C下孵育过夜，然后与结合过氧化酶的抗兔抗体（Amersham）在37°C下培养30分钟。样本为mdx和对照小鼠的肠系膜阻力或颈动脉、股薄肌和心脏，以及人类内乳和肠系膜动脉。阳性染色用视频显微镜显示为棕橙色染色⁴⁵^,⁴⁶.

在另一组实验中，在压力为75毫米汞柱、流量为50毫米汞柱的条件下，对来自对照组和mdx小鼠的分离肠系膜动脉进行肌营养不良蛋白免疫染色μl/min，使血管细胞处于生理状态。用β-七叶皂苷（90 mg/ml，10 min）渗透细胞膜，使抗体达到肌营养不良蛋白。使用与链霉亲和素和德克萨斯红结合的二级抗体（抗IgG）标记抗肌营养不良蛋白抗体⁴⁵^,⁴⁶。使用Axiopot倒置显微镜（日本东京尼康）和配备Odyssey XL共焦扫描系统（美国威斯康星州米德尔顿诺兰仪器公司）的Axiophot倒置显微镜对荧光染色进行可视化，以便对灌注动脉管腔侧的内皮细胞进行可视化染色。

最后，我们还使用人类乳腺和网膜动脉对内皮细胞和平滑肌细胞中的肌营养不良蛋白进行免疫定位，如上所述。这些人体动脉与手术后通常丢弃的多余材料隔离开来。

统计分析

结果表示为平均值±标准误差（s.e.mean）。欧盟委员会₅₀或IC₅₀（诱导一半最大反应所需的激动剂浓度）和E_最大值计算每个动脉的（最大反应）²⁰组间差异的显著性通过方差分析（单因素或双因素方差分析，或在适当时用于连续测量的方差分析）来确定。采用配对t检验或Bonferroni检验对平均值进行多组比较。P值小于0.05被认为是显著的。

结果

动物

体重不受肌营养不良蛋白缺乏的影响（33±3 vs 35±3g，mdx vs对照小鼠，n=12/组）。同样，mdx小鼠的血压正常（平均动脉压：mdx小鼠为86±5 mmHg，对照组为88±6 mmHg）。

孤立动脉

在隔离的颈动脉和肠系膜阻力动脉中，在生理水平的腔内压力下，会形成基础（肌源性）张力，而这种张力会被血流（剪切应力）诱导的扩张所拮抗。因此，逐步增加流量会导致渐进性扩张(图1). 在mdx小鼠中，颈动脉和肠系膜阻力动脉的血流（剪切应力）诱导的扩张均被强烈减弱(图1). 压力（拉伸应力）诱导的张力（阻力动脉中的肌源性张力）不受两种血管中肌营养不良蛋白（mdx小鼠）缺失的影响(图2). 在mdx小鼠的颈动脉和阻力动脉中，其他内皮依赖性（乙酰胆碱）或非依赖性（硝普钠）形式的扩张没有改变(表1). 类似地，对钙、KCl或苯肾上腺素的收缩(表1)，由于压力，除了基调(图2)没有受到肌营养不良蛋白缺乏的影响。

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图1

血管对血流的反应。典型记录显示，与对照组分离的肠系膜阻力动脉中的流量阶跃增加导致直径变化(一)或mdx小鼠(b条)在压力下安装在动脉造影仪上(P（P），顶部记录）75 mmHg。肠系膜流动性扩张(c（c）)和颈动脉(d日)mdx小鼠的动脉明显减弱。n=14/组。

*P<0.001；双因素方差分析，对照组vs mdx。

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图2

肠系膜阻力（肌源性张力，上部面板）和颈动脉（基音，下部面板）从mdx和对照小鼠分离的动脉。n=14/组。

无显著差异；双因素方差分析，对照组vs mdx。

表1

小鼠动脉的药理学特征。对苯肾上腺素（PE）、KCl（80mM）和钙（Ca）的收缩²⁺)从缺乏肌营养不良蛋白（mdx）基因的小鼠及其对照组分离的肠系膜阻力动脉和颈动脉中获得乙酰胆碱（ACh）和硝普钠（SNP）扩张。

肠系膜动脉：		中密度纤维板	控制
SNP公司：	集成电路₅₀	43±7	32±8	纳米
	我_最大值	100±1	100±1	%
ACh公司：	集成电路₅₀	78±9	87±8	纳米
	我_最大值	99±2	96±3	%
体育课：	欧盟委员会₅₀	28±4	40±5	纳米
	E类_最大值	86±8	93±8	μ米
钙²⁺	欧盟委员会₅₀	0.2±0.04	0.16±0.03	毫米
	E类_最大值	105±11	128±20	μ米
颈动脉：		中密度纤维板	控制
SNP公司：	集成电路₅₀	61±17	90±30	纳米
	我_最大值	78±5	85±6	%
ACh公司：	集成电路₅₀	621±134	585±78	纳米
	我_最大值	68±5	74±3	%
体育课：	欧盟委员会₅₀	497±106	406±82	纳米
	E类_最大值	85±6	96±6	μ米
钙²⁺	欧盟委员会₅₀	0.34±0.06	0.31±0.07	毫米
	E类_最大值	74±7	72±6	μ米
KCl收缩：		中密度纤维板	控制
颈动脉：		93±8	100±12	μ米
肠系膜动脉：		112±8	118±6	μ米

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欧盟委员会₅₀和IC₅₀表示达到最大效应50%所需的浓度；E类_最大值和我_最大值给予药物最大的效果（每组n=8）。

在mdx小鼠和对照小鼠之间没有发现显著差异。

L-NAME阻断NO合成可减少两种类型动脉中的血流诱导扩张(图3，顶部）。L-NAME在流刺激的mdx小鼠动脉中的效率低于对照小鼠(图3，底部图表）。用硝普钠直接刺激mdx小鼠的cGMP依赖性舒张（非内皮依赖性）不受影响(表1).

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图3

L-NAME（0.1 mM）抑制NO合成对流动诱导膨胀的影响(上部面板)肠系膜阻力(左边)和颈动脉(正确的)从mdx和对照小鼠分离的动脉。在下部面板中，L-NAME的抑制作用显示为抑制流致扩张的百分比。（每组9至14人）。

*P<0.01；双因素方差分析，对照组vs mdx。

血管紧张素II或内皮素-1受体的抑制不影响mdx小鼠动脉中的流动诱导扩张（每组6例，数据未显示）。

血管壁的组织形态计量学和被动特性

尽管动脉壁厚度没有明显变化(图4)或被动直径(图5肠系膜动脉和图6，颈动脉），动脉壁结构受到缺乏肌营养不良蛋白的影响，如较大的壁腔比所示(图4)颈动脉顺应性和扩张性降低(图6).

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图4

动脉壁厚度(左侧面板)和壁腔比(右侧面板)从mdx和对照小鼠分离的肠系膜阻力和颈动脉。（每组6至8人）。

P<0.01；双因素方差分析，对照组vs mdx。

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图5

根据从mdx和对照小鼠分离的肠系膜阻力动脉中压力水平的增加，测定被动直径。（n分别为10和14）。无显著差异；双因素方差分析，对照组vs mdx。

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图6

被动动脉直径(上部面板)、横截面符合性(中间面板)和膨胀性(下部面板)在从mdx和对照小鼠分离的颈动脉中。（每组8至10人）*P<0.01；单因素方差分析，对照组vs mdx。

肌营养不良蛋白的免疫定位

蛋白dystrophin存在于对照小鼠的血管平滑肌和内皮细胞中（mdx小鼠中不存在），也存在于人类内乳和肠系膜阻力动脉中(图7). 对动脉造影仪上安装的隔离动脉进行共焦扫描，以维持动脉腔内压力和流量的生理水平，结果显示内皮细胞和平滑肌细胞中都存在肌营养不良蛋白。在这些细胞中，肌营养不良蛋白位于质膜水平(图8).

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图7

肌营养不良蛋白在不同类型动脉中的免疫定位（过氧化物酶染色：阳性时为橙色至棕色）。肌营养不良蛋白存在于肠系膜的中膜和内皮中(a、 b条)和颈动脉(e（电子）). mdx小鼠无染色（颈动脉：d日). 在人类肠系膜中也发现了类似的模式(c（c）)和乳腺动脉(（f）).

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图8

肌营养不良蛋白在动脉造影仪上灌注阻力动脉中的免疫定位（Texas-Red染色）（压力=75 mmHg，流量=30μl/min）显示肌营养不良蛋白在平滑肌中的原位定位(一)和内皮细胞(b条). 由于在压力下灌注期间血管壁的运动，以高速（每秒30个图像）进行共聚焦扫描。

讨论

这是首次研究与肌营养不良蛋白基因缺陷相关的血管功能。有趣的是，在缺乏肌营养不良蛋白基因的小鼠中，血管反应性（内皮和肌肉）是正常的，但血流（剪切应力）诱导的扩张作用减弱。

尽管肌营养不良蛋白已明确显示在横纹肌的力机械传导中起关键作用，但其在压力和流量机械传导中的可能作用从未被研究过。流量和压力是控制血管张力和血流供应的两个主要因素，了解它们的转导途径至关重要。令人惊讶的是，在孤立的颈动脉和肠系膜阻力动脉中，压力（拉伸应力）诱导的张力（阻力动脉中的肌源性张力）不受肌营养不良蛋白缺乏的影响，而流（剪切应力）诱发的扩张在mdx小鼠中显著减弱。因此，只减弱了内皮细胞表面剪切应力的机械传递，而不是对整个血管壁施加压力的机械传递。此外，在这种流致扩张减弱强烈的小鼠模型中，血压正常。这和我们之前在缺乏波形蛋白基因编码的小鼠中的观察结果²⁰以及在慢性输注内皮素导致高血压的大鼠中³⁴强化了这样一个假设，即血流扩散在局部血流控制中起着关键作用，但不一定和/或与系统血压的基础水平直接相关。

流扩散在mdx小鼠中被特异性减弱。其他内皮依赖性（乙酰胆碱）和独立性（硝普钠）舒张功能在mdx小鼠中没有改变。类似地，除了由于压力引起的肌源性张力外，对钙、KCl或苯肾上腺素的收缩也不受肌营养不良蛋白缺乏的影响，结果表明，mdx小鼠动脉扩张至剪切应力的降低可能与无内皮功能障碍、平滑肌收缩力或血管舒张剂特性无缺陷有关。

虽然未发现动脉壁厚度或被动直径有明显变化，但动脉壁结构受肌营养不良蛋白缺乏的影响，如壁腔比增大、顺应性和扩张性降低所示(图2). 然而，这些变化不能仅解释内皮细胞对血流的反应，而不影响其他形式的音调。事实上，在mdx和对照小鼠中，诱导流动扩散之前的动脉张力是相似的。

一氧化氮（NO）是血流刺激后内皮释放的主要舒张剂⁵^,⁷^,³⁵^–³⁸在流刺激的mdx小鼠动脉中阻断其合成的效率较低，而在mdx小鼠中直接用硝普钠刺激cGMP依赖性舒张作用不受影响。因此，mdx小鼠的动脉在剪切应力作用下产生NO的能力较低。此外，mdx小鼠的动脉在受到血流刺激时不会产生更多内皮衍生的血管收缩剂，因为血管紧张素II或内皮素-1受体的抑制不会影响mdx小鼠动脉的血流诱导扩张。因此，肌营养不良蛋白的缺乏导致内皮细胞通过NO-cGMP途径将剪应力转化为扩张的一种特殊缺陷，而内皮细胞能够正常扩张为其他舒张刺激物。当代谢需要需要更高的血流量供应时，血流诱导的扩张减弱可能导致器官对血流量增加的适应能力减弱。此外，流动（内皮细胞表面的剪切应力）是血管细胞生长和血管生成的主要刺激因素⁸^,³⁸^–⁴⁰由于缺乏肌营养不良蛋白而导致的血流机械传导缺陷可能对血管生成过程有害，因此，当运动等情况下需要增加血流时，器官的血流供应可能会受到影响。支持这一说法的是，骨骼肌收缩导致NOS-I依赖的小动脉扩张，而在mdx小鼠中，这种扩张有所减少。这种较低的扩张被归因于骨骼肌产生NO的能力较低⁴¹但鉴于目前的研究，我们也可以假设，在mdx小鼠中，收缩所需的血流量增加可能不够高，从而导致血管中NO的生成也较少。也支持我们的假设，肌营养不良蛋白缺乏患者的骨骼肌和心肌出现缺血⁴²^,⁴³.

最后，蛋白dystrophin存在于对照小鼠的血管平滑肌和内皮细胞中（mdx小鼠中没有），也存在于人类内乳和肠系膜阻力动脉中。这个位置与骨骼肌和心肌细胞的研究一致²⁹并增强了血管内皮细胞中肌营养不良蛋白在机械传递中起主要作用的可能性。流-机械传导也涉及整合素⁴⁸虽然很容易将这两种蛋白质连接在同一途径中，但这种可能性还需要进一步研究。此外，用RGD肽阻断整合素可以完全抑制流诱导的扩张⁴⁸而在mdx小鼠中缺乏dystrophin使其反应降低到对照小鼠的40-50%。这可能反映了内皮细胞对长期缺乏肌营养不良蛋白的适应性，而其他蛋白质，如肌营养不良素相关蛋白，可能参与mdx小鼠的流-机械转导。最后，肌营养不良蛋白之外导致NO合成激活的转导途径，尤其是所涉及的激酶类型，也有待阐明

总之，我们发现肌营养不良蛋白在大动脉和阻力动脉血管内皮的剪切应力机械传递中起着关键作用。目前的研究结果支持这样一个概念，即细胞骨架的某些元素对肌营养不良蛋白起着核心作用，可以将剪切应力的信号特异性地传递给血管内皮细胞中的酶促扩张机制。这一观察可能对更好地了解营养不良蛋白相关疾病的发展以及可能改进其治疗具有重要意义。

致谢

这在一定程度上得到了法国巴黎法兰西肌病协会（AFM：法国肌病协会）的资助。

Laurent Loufrani是法国巴黎医学研究基金会的研究员。

缩写

考克斯: 环氧合酶
不: 一氧化氮
L名称，10μM（M）: N个^G公司-硝基-L-精氨酸甲酯
EGTA公司: 乙烯双（氧乙烯三醇）四乙酸
中密度纤维板: 肌营养不良蛋白缺乏小鼠

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