N型和L型钙通道参与去极化诱导的大鼠海马CA1细胞抑制抑制

解决

镀液中含有以下物质（m米)：120氯化钠，25氯化钠_三，3氯化钾，2.5氯化钙₂，2 MgSO₄，1个NaHPO₄和10葡萄糖。6-氰基-7-硝基喹啉-2,3-二酮（CNQX，20μ米)和2-氨基-5-磷酸（APV，50μ米)在所有实验中，均存在于盐水中，以阻断离子型谷氨酸受体介导的反应。在检测DSI对细胞外Ca依赖性的实验中²⁺浓度（[Ca²⁺]_o个)，除了Ca浓度²⁺被提升至5米米和MgSO₄省略了。

全细胞贴片电极的电阻为3–6 MΩ，并填充了两种溶液中的一种（M米)：（A）100 CsCH_三SO公司_三，50–60 CsCl，10 Hepes，2 BAPTA，0.2 CaCl₂，2 MgATP，1 MgCl₂，0.3 Tris-GTP，5 QX-314，pH 7.25；（B） 150–160立方厘米_三SO公司_三，10 Hepes，2 BAPTA，0.2 CaCl₂，2 MgATP，1 KCl，1 MgCl₂pH值7.25。QX-314块Na⁺-依赖动作电位与某些K⁺通道(安德拉德，1991年). 我们发现，解决方案A通常会产生更稳定的录音；然而，除了图6，使用两种解决方案的结果没有差异，并且数据已经合并。以下实验图6分别讨论。

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图6

在某些条件下L型钙²⁺渠道可以在DSI中发挥作用

A类硝苯地平（10μ米)，阻止L型钙²⁺通道，不会阻止大电压阶跃引起的DSI，也不会影响IPSC振幅。左侧面板的校准值也适用于右侧面板。B类，一项实验的典型时间进程表明硝苯地平对DSI没有影响。符号与图3C类。C类，组数据(n个=8）表明硝苯地平的DSI与对照条件下的DSI没有差异(P（P）>0.2）使用我们的标准DSI诱导协议。D类，通过一个小电压阶跃（至−25或−20 mV）诱发DSI并用缺乏QX-314的电极记录的细胞组数据表明，DSI显著降低了10μ米硝苯地平(*P（P）=0.03时，n个=4），而在相同细胞中由大电压阶跃（至−5或0 mV）引发的DSI未受到硝苯地平的显著影响(P（P）> 0.4,n个= 4).

CNQX和QX-314购自Research Biochemicals International，BAPTA购自Molecular Probes。ω-琼脂毒素TK，P型和Q型钙的选择性阻断剂²⁺通道(寺本等。1995)从Alomone Labs（以色列耶路撒冷）购买。所有其他药物和化学品均来自Sigma。

DSI依赖于[Ca²⁺]_o个

首先，我们确认DSI依赖于细胞外钙²⁺通过增加[Ca²⁺]_o个.在2.5 m处米钙²⁺和2.0米米镁²⁺，对突触后细胞施加1s的去极化步骤至−10 mV，导致IPSC振幅（DSI）在电压阶跃后的一个瞬态周期内降低(图1A类，左轨迹）。提高细胞外钙²⁺浓度至5米米（高钙²⁺)，同时降低Mg²⁺标称浓度为0 m米导致同一小区DSI的幅度和持续时间急剧增加(图1A类，中间轨迹）。高[Ca的影响²⁺]_o个IPSC振幅和DSI在清洗后可逆(图1A类，右轨迹）。增加[Ca²⁺]_o个(图1B类，中间记录道）增加DSI，与对照Ca中的DSI量无关²⁺条件。即使降低刺激强度以诱发高[Ca的IPSC，DSI的增加仍保持不变²⁺]_o个(图1B类，右迹线）的振幅与低[Ca记录的振幅相似²⁺]_o个条件(图1B类，左轨迹）。存在5m时，DSI百分比也有类似增加（见方法）米钙²⁺在所有测试的五个细胞中都能看到。DSI从对照条件下的23.0±5.9%显著增加到高[Ca存在时的41.9±7.8%²⁺]_o个这些结果表明DSI依赖于细胞外钙²⁺，并表明1s电压步进协议引起的DSI程度可以调制。因此，该协议适用于所提出的实验。

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图1

DSI对[Ca的变化敏感²⁺]_o个

A类，从−70 mV到−10 mV的保持电位进行1s的去极化步骤（此处和随后的图中显示为向上偏转），导致DSI（41%）为2.5 m米钙²⁺和2.0米米镁²⁺在细胞外溶液中（左图）。用高钙溶液灌注²⁺（5米米)名义上为0 m米镁²⁺在同一个单元（中间记录道）中，DSI（到70%）和IPSC振幅大大增加。高钙的影响²⁺DSI和IPSC振幅在清洗后可逆（右迹线；43%DSI）。B类另一种细胞，在对照条件下DSI很小（左图），但通过提高细胞外[Ca²⁺]（中间轨迹）。在降低高[Ca刺激强度后，DSI仍然增强²⁺]_o个以获得与控制条件下（右轨迹）振幅相似的IPSC。

DSI依赖于Ca²⁺通过VDCC流入

如果Ca²⁺通过VDCC从细胞外间隙进入细胞有助于[Ca升高²⁺]_我则DSI应显示与Ca的电压依赖性密切平行的电压依赖关系²⁺通道激活。为了验证这一预测，我们将突触后锥体细胞去极化至−40至+50 mV的不同电压，并量化每一步诱导的DSI量。如所示图2A类，去极化电压阶跃至−30 mV几乎不会产生DSI，而阶跃至–10或0 mV则会抑制IPSC数秒。有趣的是，Ca向接近零电流电位的电压迈出了一大步去极化²⁺没有导致任何DSI。同一电池中钙电流（开环）的电流-电压关系和DSI（充满环）的电压依赖性叠加在一起图2B类在其他五个电池中也观察到类似的结果，六个电池DSI的归一化电压依赖性如所示图2C类Ca的类似电压依赖性²⁺通道激活和DSI支持钙离子²⁺DSI需要通过VDCC进入突触后细胞。

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图2

DSI的电压依赖性与Ca的相似²⁺通道激活

A类，CA1锥体细胞被电压钳制在−70 mV，并阶跃1s至所示电压。电压阶跃至−30 mV不会导致DSI，而阶跃至–10和0 mV会导致标记DSI。有趣的是，大电压阶跃（+30 mV）接近Ca²⁺平衡电位没有引起任何DSI。痕迹在A类来自同一个单元格。B类，Ca峰值图²⁺电流(我_钙) (○)与。电压和%IPSC振幅与。来自同一电池的感应电压阶跃（•）被叠加。电压依赖性我_钙和DSI非常相似，表明DSI的量与突触后Ca有关²⁺电压阶跃期间的流入。因为在非常大的电压阶跃下（Ca很少或没有²⁺流入），DSI不能是由于电压阶跃按本身C，显示了6个电池平均DSI的电压依赖性。这里和后面的图中，符号和误差条表示方法和s.e.m.公司。分别是。

ω-琼脂毒素TK降低IPSC，但不降低DSI

CA1锥体细胞上存在几种类型的VDCC(克里斯蒂等。1995;卡瓦利里等。1997). P型钙²⁺通道存在于锥体神经元以及某些抑制性突触对这些细胞的输入上(山本等。1994). 在图中所示的单元格中图3A类，去极化步骤至0 mV可靠地导致每一步之后出现DSI。在完全阻断P型通道（200 n）的浓度下应用P型通道阻断剂ω-琼脂毒素TK米) (明茨等。1992;寺本等。1995)，降低了IPSC振幅，但没有降低DSI。实验的时间进程(图3C类)揭示了毒素对IPSC振幅和DSI的不可逆影响。填充的圆圈表示每个DSI诱导步骤前八个IPSC的平均值，而开平方是每个步骤后五个IPSC中的平均值。阻止P型钙²⁺在ω-琼脂毒素TK存在的情况下，通道实际将计算的平均%DSI从对照条件下的33.2±4.3%增加到50.0±5.0%(n个=8个单元格，P（P）=0.001，图3D类).

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图3

P型和Q型钙的活化²⁺DSI需要通道

A类，选择性P型Ca²⁺通道阻滞剂ω-琼脂毒素TK（200 n米)大大降低了IPSC振幅，但没有阻止DSI。左侧面板中的校准值A类也适用于右侧面板和B.B类，切片预孵育1μ米ω-琼脂毒素TK完全阻断P型和Q型钙²⁺通道未阻止DSI。用CsCH记录预孵育切片中的细胞_三SO公司_三-填充电极（见方法），因此在本实验中IPSC向外。为了显示的一致性，此轨迹被反转，因此电流看起来向下。C类，ω-无毒素代表性实验的时间进程，其中•表示DSI步骤之前8IPSC的平均振幅，□DSI步骤之后5 IPSC的均值振幅（符号为图3C类).D类，组数据(n个=8）表明控制条件下的%DSI显著降低(*P（P）=0.001）。E类，DSI期间IPSC振幅的绝对降低在控制条件和ω-琼脂毒素TK存在下相似(P（P）> 0.05).

检查数据后(图3A类)在DSI诱导步骤之后，IPSC振幅的绝对降低似乎在对照条件下和在200n的存在下是相同的米ω-agatoxin TK。因此ω-agatoxin诱导的%DSI增加可能是由于用于计算%DSI的方法，而不是DSI机制的实际增加就其本身而言。如果ω-无毒素抑制了对DSI同样敏感的中间神经元群体的GABA释放，那么ω-无毒素应降低IPSC振幅，而不影响%DSI。另一方面，一些中间神经元可能对DSI不敏感。如果ω-琼脂毒素仅阻断不易受DSI影响的细胞的输出，则诱发的IPSC将减少，%DSI将增加，DSI期间IPSC振幅的绝对减少不会改变。为了验证这一观点，我们测定了DSI诱导的IPSC在对照条件下以及在存在琼脂毒素的情况下的绝对减少量（pA）。正如预期的那样，DSI引起的IPSC振幅绝对降低在对照组和ω-无毒素组之间没有显著差异(图3E类,n个= 8). 因此，ω-琼脂毒素中DSI百分比的计算增加可能是由于DSI诱导的IPSC绝对振幅的恒定减少，除以琼脂毒素产生的较小的控制IPSC振幅。我们得出结论，琼脂毒素不影响DSI机制就其本身而言。

因为200 n米ω-琼脂毒素TK阻断这些CA1神经元上约50%的Q型通道(萨瑟等。1993)，Q型VDCC似乎不参与DSI。然而，根据这些数据，我们不能排除Q型通道对DSI的贡献。Q型通道的贡献实际上可以消除1μ米ω-琼脂毒素。因此，我们在1μ米ω-琼脂毒素TK持续数小时，以确保P型和Q型通道完全阻断(萨瑟等。1993;惠勒等。1994). 在来自三个琼脂毒素预处理切片的三个细胞中的三个细胞中，存在显著的DSI(图3B类)在数量上与200 n米浴敷ω-琼脂毒素TK（60.5±5.6%，1μ米ω-琼脂毒素TK与。200n时为50.0±5.0%米ω-琼脂毒素TK，差异不显著）。

因为切片是在1μ米ω-无毒素在开始记录之前，我们没有直接观察毒素的发作对IPSC振幅的影响。然而，我们确信ω-琼脂毒素的活性有两个原因：（1）刺激强度能有效诱发对照切片中典型的IPSC（335±7 pA，n个=6）在用1μ米ω-琼脂毒素（197±31 pA，n个=3）和（2），尽管200 n米当我们在正常记录过程中使用同一储备溶液中的ω-琼脂毒素时，总是会显著降低IPSC(n个= 8,图3A类和C类)，当200 n米用1μ米它对IPSC没有进一步的影响。因此，用1μ米琼脂毒素已经产生了最大的IPSC抑制，因此具有活性。这些数据强烈反对P型或Q型通道参与DSI。

DSI需要N型通道激活

N型钙²⁺CA1锥体细胞体和树突上存在通道(克里斯蒂等。1995;卡瓦利利等。1997)和参与突触前海马GABA释放的控制(Horne&Kemp，1991年;Ohno-Shosaku公司等。1994). 我们发现特异性N型通道阻滞剂ω-芋螺毒素GVIA（250 N米)，IPSC振幅显著降低(图4A类)与ω-无毒素不同，和大大降低了%DSI。洗净30分钟后，芋螺毒素的作用无法逆转。来自7个细胞的分组数据显示，ω-芋螺毒素GVIA显著降低了平均DSI，从50.5±8.7%降至9.0±4.4%(P（P）= 0.005). 无论是测量DSI期间的%DSI还是IPSC的绝对减少量（pA），都可以看到这种影响(图4D类和E类). 增加刺激强度可以部分恢复IPSC振幅，但不能恢复DSI。在以这种方式测试的四个细胞中，ω-芋螺毒素引起的IPSC振幅的平均降低为83.5±5.1%（即对照值的16.5%），并且增加ω-芋螺毒素的刺激强度使IPSC恢复到对照的58.5±10.1%，而没有恢复DSI。实验的时间进程显示在图4C类并证明ω-芋螺毒素作用的快速性。

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图4

N型Ca²⁺通道激活对于DSI是必要的

A类，浓度可选择性阻断N型钙²⁺通道，ω-芋螺毒素GVIA（250 n米)大大降低了IPSC振幅，实际上取消了DSI。增加刺激幅度以部分恢复IPSC幅度并不能恢复DSI。ω-芋螺毒素将平均IPSC降低至210 pA，随着刺激强度的增加，平均IPSC为358pA。B类，ω-芋螺毒素可在降低IPSC振幅之前导致DSI进行性阻滞。ω-芋螺毒素的应用速度较慢，使DSI从第一步去极化后的38%逐渐降低到第三步后的26%。IPSC振幅在此期间没有改变。继续将ω-芋螺毒素应用于该细胞，导致DSI完全阻断，IPSC振幅大幅降低（未显示）。C类ω-芋螺毒素典型实验的时间进程表明，该毒素迅速降低了IPSC振幅和DSI。符号与图3C类。D类ω-芋螺毒素的对照DSI显著大于DSI(*P（P）= 0.005,n个= 7).E类在对照条件下DSI期间，IPSC振幅的绝对减少量远远大于ω-芋螺毒素的存在。

ω-芋螺毒素GVIA对DSI的近完全阻断表明，突触后N型通道激活对DSI是必要的。然而，从这个实验中，很难排除ω-芋螺毒素阻断DSI的作用是通过其有效减少IPSCs在突触前介导的。ω-芋螺毒素可以通过阻止易受DSI影响的GABA神经元的输出而阻断DSI。然而，如果ω-芋螺毒素的作用是严格意义上的突触前效应，那么ω-汕螺毒素存在下的IPSC不应大于最大DSI期间发生的IPSC。为了计算“最大DSI”，我们只使用了DSI效应峰值时出现的两个IPSC（跨度为6秒），而不是通常使用的五个IPSC，因为在五个响应中，DSI的恢复总是很明显的，因此最大DSI会被低估。在七个单元格中的三个（参见图4A类例如），我们在ω-芋螺毒素应用期间观察到的IPSC明显大于相同细胞最大DSI期间发生的IPSC。在这三个细胞中，ω-芋螺毒素（267 pA）的平均IPSC振幅比最大DSI（186 pA）期间测得的IPSC振幅大44%。ω-芋螺毒素具有严格的突触前作用位点的进一步证据是，偶尔观察到ω-汕螺毒素可以在减少IPSC之前降低DSI。示例如所示图4B类其中ω-芋螺毒素逐渐阻断DSI（从第一步去极化的38%，到第二步的32%，再到第三步的26%），然后降低了IPSC振幅（在本例的第三次DSI试验结束时，该振幅是记录道开始时振幅的102%）。在这三个细胞中，ω-芋螺毒素中的平均IPSC为对照振幅的98%，而DSI仅为对照值的76%。因此，ω-芋螺毒素可能通过阻断钙而部分降低DSI²⁺突触后流入，尽管这些数据不能排除更复杂的突触前机制。

镍²⁺减少IPSC，但不减少DSI

有人建议T型和R型钙²⁺海马CA1神经元上存在通道(克里斯蒂等。1995;卡瓦利等。1997). 低浓度氯化镍₂(50–100 μ米)阻断T型和R型通道，同时不会严重影响其他电压依赖型Ca²⁺通道(高桥和秋叶，1991年;埃利诺等。1993;Randall&Tsien，1995年). 确定这些通道是否有助于[Ca的突触后升高²⁺]_我启动DSI，我们测试了100μ米氯化镍₂，但发现它对DSI没有影响(图5A类和C类). 氯化镍₂将诱发IPSC振幅平均降低至对照组的70.8±8.7%(n个= 15,P（P）=0.04），这种影响在冲刷后完全可逆(图5A类和B类). NiCl未显著改变平均%DSI₂（对照组DSI:43.9±2.7%；氯化镍₂DSI：41.9±2.6%；n个= 6,P（P）=0.2），尽管DSI诱导的IPSC绝对值降低。

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图5

R型和T型钙的活化²⁺DSI需要通道

A类，氯化镍₂(100 μ米)，阻止R型和T型Ca²⁺通道，不影响DSI，但确实降低了IPSC振幅。这表明R型或T型Ca²⁺通道参与GABA释放到CA1锥体细胞。左侧面板中的校准值也适用于中间和右侧面板。B类，氯化镍作用的典型时间过程₂IPSC振幅和DSI缺乏影响。氯化镍的影响₂洗后可反转。符号与图3C类。C类，组数据(n个=6）表明控制条件下的DSI与存在NiCl时的DSI没有差异₂(P（P）> 0.1).D类，在存在NiCl的DSI期间，IPSC振幅绝对降低₂小于对照条件下的值，可能是因为NiCl₂降低了IPSC振幅。

硝苯地平在某些条件下会影响DSI

L型钙²⁺CA1锥体细胞上存在通道(韦斯坦布鲁克等。1990)对体细胞总钙有显著贡献²⁺在这些电池中测得的电流。L型钙²⁺通道拮抗剂硝苯地平（10μ米)未阻断诱发IPSC的DSI(图6A类)与之前的发现一致，即硝苯地平没有阻断自发IPSC的DSI(Pitler&Alger，1992年). 在所测试的八个细胞中，对照条件下的平均%DSI（41.0±4.8%）与硝苯地平存在下的%DSI没有显著差异（43.4±5.8%，P（P）= 0.2).

我们有点惊讶于阻断L型钙²⁺通道对DSI没有影响，特别是在这些细胞的胞体和顶端树突密度较高的情况下(韦斯坦布鲁克等。1990)以及它们对全细胞钙的巨大贡献²⁺电流。为了确定L型VDCC是否在任何条件下都能在DSI中发挥作用，我们改变了记录条件，试图最大化其对Ca的相对贡献²⁺通过降低电压阶跃直接去极化树枝状区域的能力来注入。我们通过从记录电极溶液中省略QX-314（除了阻断Na之外⁺通道，QX-314阻止特定K⁺通道并促进电压向树枝晶扩散），并使用产生未捕获Na的小电压阶跃（至−25或−20 mV⁺-和钙²⁺-依赖性峰值。有趣的是，在这些条件下，硝苯地平部分阻断了由小电压阶跃引起的DSI（平均对照DSI:22.5±2.0%；平均硝苯地平DSI:10.9±1.0%；P（P）= 0.03,n个=4）同时不影响同一细胞内大电压阶跃（至−5或0 mV）诱导的DSI（平均对照DSI:31.3±8.3%；硝苯地平DSI:27.9±2.6%；P（P）> 0.4,n个= 4,图6D类). 这些结果表明，在某些电压协议下，L型钙²⁺通道电流会对DSI产生影响。

同样的推理可能意味着，在没有QX-314的情况下，R型或T型通道电流可能在次最大电压阶跃引起的DSI中发挥作用。为了测试这种可能性，我们用氯化镍重复了同样的实验₂.在NiCl存在下，通过小电压阶跃诱发DSI₂（24±3%）与对照组DSI（26±4%，n个= 4,P（P）> 0.1). 这些数据反对T型或R型钙的贡献作用²⁺DSI中的通道，与电压协议无关。

VDCC拮抗剂对突触后电压依赖性钙离子的影响²⁺电流，电流(我_钙)

我们测量了每种通道阻滞剂对我_钙在标准条件下激发，即记录电极中存在QX-314。尽管我_钙不能理想地固定在具有延伸过程的细胞中，可以对各种拮抗剂的作用效果进行一些比较。在控制槽溶液中，在每个通道阻滞剂存在的情况下，通过500 ms电压阶跃至−10或0 mV来激发电流。样本电流显示在图7A类，峰值电流的组数据如所示图7B类与之前的研究基本一致(克里斯蒂等。1995;卡瓦利里等。1997)，我们发现硝苯地平在我_钙导致峰值电流为对照的59±13%。阻止N型通道减少我_钙至对照的76±8%，而200 n米ω-琼脂毒素TK使其降至对照组的73±8%。氯化镍₂对我_钙将其降至对照的93±3%。

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图7

钙的作用²⁺通道阻断器打开我_钙

A类，电压阶跃至−10或0 mV，持续500 ms，引发Cd内向电流²⁺或减去泄漏。镉²⁺在实验结束时使用，有时在使用前细胞会丢失。在这些细胞中，只有渗漏减法是可能的。在对照条件下和给药后测量细胞的峰值电流。左上方面板中的校准值适用于中的所有其他面板A类。B类，每个通道阻滞剂的平均数据以控制Ca的百分比显示在直方图中²⁺电流。氯化镍₂, 93.2 ± 3.3 %,n个= 6; ω-芋螺毒素GVIA，76.2±8.0%，n个= 7; ω-琼脂毒素TK，73.3±8.0%，n个= 5; 硝苯地平58.9±13.4%，n个= 7.

我们要感谢F.E.N.Le Beau、S.E.Mason和W.Morishita对这份手稿草稿的评论。这项工作得到了美国公共卫生服务拨款NS30219和NS22010（B.E.A.）的支持。R.A.L.由美国国立卫生研究院神经科学培训基金NS07375资助。这份手稿将构成为部分满足R.a.L.博士学位要求而提交的论文的一部分。我们感谢E.Elizabeth提供的专业文字处理和编辑帮助。