过度表达突变型和野生型Lamin A的人成纤维细胞端粒缩短和复制衰老的加速

摘要

介绍

这个LMNA公司该基因通过选择性剪接编码两种核中间丝蛋白，即层粘连蛋白A和层粘连蛋白质C。LMNA公司突变导致至少九类疾病；Emery-Dreifuss肌营养不良[1]1A型扩张型心肌病伴或不伴房室传导障碍[2]，肢带型肌营养不良1B型[三]，夏科特乳牙病2型[4]、Dunnigan型家族性部分性脂肪营养不良[5]下颌骨发育不良[6]，Hutchison-Gilford早衰综合征（HGPS）[7,8]限制性皮肤病（RD）[9]和非典型沃纳综合征（WS）[10]. 各种组合的重叠综合征也被广泛报道[11].

大多数的疾病突变LMNA公司是位于LMNA公司基因[12]. 还报告了单倍体不足或纯合子突变的病例[4,6]. 层次聚类分析揭示了有趣的基因型/表型相关性[13]. 字母区域的突变有导致肌营养不良的趋势，而球形区域的突变更有可能导致脂肪营养不良。类固醇综合征，报告为非典型HGPS或非典型WS，往往与层粘连蛋白A/C七肽区的氨基酸取代有关[8,10].

经典的HGPS和RD是由于点突变产生新的剪接位点，导致前层蛋白A的C末端在帧内缺失[7–9]. 删除的区域包括Zmpste24的内蛋白水解位点，这些位点是前层蛋白A转化为成熟层蛋白A所需的位点[14]. 剪接突变引起的疾病比错义突变引起的更严重。因此，有人假设前胺A的积累是HGPS中近端细胞毒性异常[15]. 还观察到帧内缺失长度与疾病严重程度之间的相关性。常见的HGPS突变导致50个氨基酸缺失；这些患者的平均寿命为13年。一名非典型HGPS患者，他活到5岁^第个10年，有35个氨基酸缺失[16].

核形态异常是LMNA公司突变细胞。从Lmna−/−小鼠分离的细胞表现出核变形、机械传递缺陷和机械应变后的生存能力受损[17]. 在HGPS细胞中，核膜在机械应力作用下重排的能力显著降低，细胞核的变形能力降低[18]. 这可能部分解释了原代HGPS成纤维细胞在培养过程中随着年龄增长而凋亡增加的原因[19].

全球基因表达在蛋白质[20]和mRNA水平[21]. 后者显示一种转录因子的表达增加，该转录因子是中胚层组织增殖的负调节因子，与反映间充质细胞谱系发育异常的临床表型一致。

我们对LMNA公司体细胞复制潜能的突变来自对HGPS患者成纤维细胞的研究。早期的研究结果喜忧参半[22,23]而且，尽管与大多数年龄匹配的对照组相比，来自单个HPGS患者的培养物显示出增殖受损，但与来自Werner综合征患者的培养物相比，没有表现出显著的复制性衰老[24]. 最近的报告记录了HGPS受试者原代成纤维细胞在通常的高氧环境下培养时，其复制寿命的显著限制[25]. HGPS成纤维细胞的累积群体倍增（CPD）范围为20-30，而年龄匹配的对照组的CPD达到约60个CPD[19]. HPGS患者皮肤成纤维细胞的端粒也比年龄匹配的对照组短[26]. 然而，这些测量仅在一个点进行。与其他基因相关的复制寿命和端粒丢失动力学LMNA公司突变，包括非典型沃纳综合征中发现的突变，尚未得到很好的研究。因此，我们研究了这些主要的细胞表型是如何受到一系列致病因素的影响的LMNA公司突变。

材料和方法

结果

过度表达突变型和野生型层粘连蛋白A的细胞系的建立

我们选择了两种在非典型WS中发现的疾病突变和两种在HGPS患者中发现的突变进行本研究，因为我们对此类进展综合征感兴趣。我们将R133L和L140R鉴定为“非典型”WS患者的杂合突变，这些患者参考了我们的Werner综合征国际注册中心（华盛顿大学病理学系：网址：www.wernersyndrome.org.），发现有野生型警告基因。[10]. HGPS患者的层粘连蛋白A中预期有50个氨基酸缺失（Δ50），这是之前在HGPS儿童中记录到的G608G和G608S突变所致[7,8]. 此前曾在一名45岁的HGPS患者中记录到T623S突变，导致层粘连蛋白A中35个氨基酸缺失（Δ35），且表型不太严重[16].

为了比较LMNA公司在等基因细胞系的突变中，我们引入了一个全长的人类LMNA公司携带野生型、R133L、L140R、Δ50或Δ35突变的cDNA(图1A)进入已经用可切除的hTERT（82-6pBlox）永生化的人对照成纤维细胞。去除hTERT前的Western分析表明，转染的培养物表达引入的LMNA公司预期尺寸的(图1B). 在野生型、R133L和L140R突变株系中，层粘连蛋白A的水平增加了约90%。在Δ50和Δ35突变株系中，突变层粘连蛋白A的表达量分别为内源性层粘连蛋白质A的91%和92%，内源性层黏连蛋白A没有代偿性减少。在这些株系中用β肌动蛋白标准化后，层粘连素C也没有代偿减少。因此，已建立的株系表达的层粘连蛋白A，无论是野生型还是突变型，其水平相当于4拷贝的LMNA公司基因。

在单独的窗口中打开

图1

的示意图LMNA公司高表达层粘连蛋白A（A）的82-6pBlox株突变体和Western分析LMNA公司本研究中使用的突变显示在层粘连蛋白A的几个功能域内。箭头表示内蛋白水解位点（Δ50和Δ50突变体中缺失）。（B） 层粘连蛋白A/C的Western分析显示，在82-6pBloxTSH背景下，相应突变的引入层粘连蛋白A以及内源性层粘连蛋白A/C的蛋白质水平。β-actin显示为负载控制。

的标志LMNA公司突变细胞是一种典型的核形态异常，常被描述为“气泡”、“疝气”或“凹陷”。如前所述，当我们在去除hTERT之前检查这些细胞系的核形态时，我们观察到与对照pBlox细胞系相比几乎没有差异[28]. 然而，在通过Cre的重复感染和随后的1周选择去除hTERT后，我们发现在LMNA公司转染培养物(图2). 对照培养物82-6含有均匀的卵圆形细胞核，层粘连A/C主要表现为薄而光滑的核周衬里，偶尔有小的核病灶。大约6%过度表达野生型层粘连蛋白A的成纤维细胞出现畸形细胞核（含有两个或多个滤泡或疝气的细胞核），而2%的对照成纤维细胞有类似的变异。层粘连蛋白A/C染色显示野生型层粘连素A过度表达株的外周层粘连层不规则增厚。过度表达R133L和L140R突变层粘连蛋白A的成纤维细胞显示出不同程度的不规则细胞核。在R133L和L140R品系中，分别有22%和6%的细胞核变形不良，偶尔出现核质层粘连聚集和层加厚。DAPI染色显示Δ50和Δ35线中分别有23%和22%的细胞核变形。此外，层粘连蛋白A/C染色显示核边缘不规则，周围层粘连层不规则增厚，核质层粘连聚集。

在单独的窗口中打开

图2

核形态和层粘连蛋白A/C亚核在过度表达层粘连A的成纤维细胞内的定位。去除hTERT后，对细胞进行层粘连A/C染色，并用DAPI对细胞核进行反染色。显示了来自母线82-6（左上）和层粘连蛋白A过度表达线的典型共焦图像。标签对应于图1.

通过核轮廓比（NCR）量化核形态异常的程度（表1）。NCR计算为（2πr/周长）²[29]. 如前所述，除了Δ50层粘连蛋白A系外，几种突变层粘连蛋白A系的平均NCR没有显著差异（t检验P<0.001）。然而，有一种趋势，即含有更多畸形细胞核的细胞表现出较低的NCR。然而，NCR的方差在表达层粘连蛋白A突变的细胞系之间显示出显著差异（R133L、Δ50和Δ35的f检验P<0.0001；L140R的f检验P=0.047）。

有人建议，在可比较的突变类型（错义或帧内缺失）中，与更严重的临床表型相关的突变的NCR方差更高。R133L突变的病例在青少年晚期被诊断，而L140R受试者的诊断是在20多岁时作出的[10]. 据报道，典型Δ50突变病例的平均死亡年龄为13岁，而Δ35突变的单个病例存活至40多岁[16]. 然而，鉴于案件数量较少，无法得出确切结论。

层粘连蛋白A过表达株系的加速复制衰老

然后我们比较了复制衰老和端粒缩短的速率。在Cre感染和1周的选择后，建立了零人口倍增的基线。在随后的系列文章中[^三H] 测定胸腺嘧啶核苷掺入量，直至培养物的标记指数（分割分数）降至10%。图3说明了培养寿命作为48小时标记指数的函数。表达HGPS缺失突变的层粘连蛋白A的成纤维细胞培养物和非典型WS中发现的错义突变的培养物的复制寿命缩短。R133L和L140R的总CPD在22到24之间，Δ35和Δ50突变株系的CPD在25之间。这与之前报道的亲本成纤维细胞培养物82-6的结果形成了对比，后者继续分裂，直到CPD超过45[27]. 引入的持久性LMNA公司在培养研究结束时，通过核苷酸测序确认了构建物。

在单独的窗口中打开

图3

过度表达层粘连蛋白A的成纤维细胞的复制寿命。成纤维细胞培养与图1和​和2。2X轴表示累积的群体倍增，Y轴表示标记指数（划分培养细胞的分数）。

有趣的是，一个过度表达野生型层粘连蛋白a（82-6+wt）的成纤维细胞系也表现出复制寿命的缩短，与那些表达突变型层粘着蛋白a的细胞系相比(图3). 然而，复制潜能下降的动力学似乎有所不同。过度表达野生型层粘连蛋白A的培养物从CPD3开始早期稳定下降。

层粘连蛋白A过度表达株的加速端粒缩短

为了评估复制性衰老过程中端粒丢失的速率，用定量PCR测定端粒的平均长度。与父母对照组相比，过度表达层粘连蛋白A（野生型或突变型）的成纤维细胞端粒缩短速度加快，为82-6(图4A). 线性回归分析对R133L、Δ50和Δ35突变体（P<0.01）和过度表达wt系（P<0.05）具有统计学意义。对于L140R，该测试不显著（P=0.18），可能是因为在复制寿命结束时数据点不足。在该分析中，不同突变成纤维细胞系之间的端粒缩短率没有显著差异。

在单独的窗口中打开

图4

过度表达层粘连蛋白A的成纤维细胞在复制衰老过程中的平均端粒长度图3左三个面板显示端粒平均长度随CPD的下降。所有3个面板均显示82-6的回归。右侧面板显示它们作为标记索引的函数。所有3个面板中均显示了82-6+重量的回归。

然而，当根据标记指数绘制端粒丢失率时，过度表达wt层粘连蛋白A的成纤维细胞显示出最快的端粒丢失速率(图4B). 这与以下数据一致图3表明83-2+wt系标记指数的下降开始得很早。过表达wt lamin A的品系的线性回归斜率与L140R、Δ35和Δ50突变品系的直线回归斜率存在统计学差异（R140L和Δ50P<0.01；Δ35突变品系P<0.05）。过表达wt系斜率与R133L和亲本对照系斜率之间的差异没有达到统计学意义（R133L为P=0.13，对照为P=0.09）。

复制性衰老发生时的相对端粒长度似乎因菌株而异。过度表达wt层粘连蛋白A的细胞衰老，平均端粒长度与对照细胞相似。然而，表达突变层粘连蛋白A的细胞似乎随着端粒的长度而衰老，端粒比对照细胞短得多。由于这些观察结果反映了培养物中细胞的平均端粒长度，因此还需要在细胞水平上检查单个染色体的端粒长度。在这两种细胞中，最短的端粒子集可能具有相同的长度，因为最短的端粒被认为限制了衰老[35,36].

我们对过度表达野生型的研究结果LMNA公司提出该位点的基因重复可能是进展综合征的原因之一的可能性。在一项检验这一假设的初步研究中，我们评估了LMNA公司在我们的Werner综合征国际登记处的一小部分非典型Werner综合症病例中（N=23）。的突变LMNA公司和警告之前在这些案件中被排除在外。基因剂量LMNA公司以RnaseP为内标，通过定量PCR测定[34]. 我们没有发现证据表明LMNA公司这23例中的拷贝数（数据未显示）。

讨论

在我们之前的研究中，我们检测了HGPS细胞中众所周知的复制衰老参数，以证明当RNA干扰抑制突变等位基因的表达时，衰老会延迟[28]. 然而，由于遗传背景的差异，我们无法与对照系进行比较，这可能独立影响复制衰老的差异率。在目前的研究中，我们建立了一系列的等基因成纤维细胞系来避免这个问题。LMNA公司cDNA被导入一个标准对照亲本成纤维细胞系，该成纤维细胞已通过可切除的hTERT构建物“永生化”。去除hTERT后，评估其复制寿命、端粒缩短率和核形态。因此，我们能够在代表正常二倍体体细胞的培养物中观察到这些表型，这些细胞缺乏端粒酶，总是经历复制性衰老。

CPD 30后不久，对照菌株的标记指数出现大幅波动。一个似是而非的解释是，这反映了一种称为克隆演替的现象，如Salk等人[37]. 在本报告中，对沃纳综合征患者皮肤成纤维细胞的大规模培养在其整个复制寿命内进行细胞遗传学检查。这些受试者的原代成纤维细胞携带多个稳定的结构染色体重排（“杂色易位嵌合体”），用于在大规模培养中鉴定细胞遗传学标记的克隆。他们观察到，在大规模培养物的连续传代过程中，有明显的证据表明单独标记的克隆扩增和减弱。这与其他已发表的证据一致，这些证据表明来自此类培养物的克隆的复制潜力具有异质性[38,39]. 因此，我们研究中标记指数增加的峰值可能反映了克隆衰减和扩展的阶段。

过度表达层粘连蛋白A的成纤维细胞和对照亲代成纤维细胞端粒长度缩短的动力学在两个方面不同。首先，与对照组相比，层粘连蛋白A过度表达的细胞每增加一倍就会失去更多的端粒。第二，过度表达突变型层粘连蛋白A而非wt-lamin-A的细胞，其端粒似乎比对照细胞短得多，从而衰老。

在我们的层粘连A过度表达的成纤维细胞中，加速端粒丢失的机制可能是什么？在哺乳动物细胞中，端粒被包裹在与核基质相连的端粒特异染色质域中[40,41]. 层粘连蛋白相关肽（LAP）2α与核质层粘连蛋白A相互作用，并在细胞周期中与染色体的端粒区域表现出动态关联[42]. LAP2agr；也显示与端粒结合蛋白TRF2部分共定位[43]，一种在端粒末端保护中起关键作用的蛋白质[42]. 端粒丢失速度加快的可能解释LMNA公司突变的成纤维细胞可能是核膜和相关染色质结构的组装和分布发生改变。这种结构的改变也可能是由于野生型层粘连蛋白A的过度表达，通过多聚体蛋白的扰动，可以推测多聚体蛋白部分起到保护端粒DNA的作用。人们可以推测，这种减少的“屏蔽”可能导致端粒丢失速度加快，从而导致过早的复制衰老。

为什么过度表达突变型层粘连蛋白A而非wt-laminA的细胞出现端粒比对照细胞短得多的衰老？可以想象，异常的层粘连蛋白可以抑制端粒缩短的信号，从而使突变细胞增殖，端粒长度比正常细胞衰老的信号短。Campisi对端粒缩短触发复制性衰老的机制进行了综述[44]. 连续传代中成纤维细胞的端粒最终达到临界长度[45]在这种情况下，它们引发的DNA损伤反应类似于涉及p53抑癌蛋白的细胞DNA反应。视网膜母细胞瘤抑癌蛋白（pRB）的激活也为细胞增殖提供了一个屏障，这是p53缺失无法克服的[44]. 据报道，端粒缩短通过p53而不是p16触发衰老^INK4a公司积极调节某些成纤维细胞株中的pRB[46]. 然而，这些作者警告说，细胞对来自p53和p16的信号的依赖程度^INK4a公司-pRB途径可能因菌株而异，甚至在同一菌株内的克隆之间也可能不同。

约翰逊等人[47]据报道，层粘连蛋白A共同定位pRB，层粘着蛋白A的消失导致pRB显著减少，其余pRB定位错误。将突变的层粘连蛋白A导入HeLa细胞后，可形成含有pRB的核内聚集物[48]. 突变的层粘连蛋白A如何影响pRB抑制DNA合成起始的功能尚不完全清楚。可以想象，异常的层粘连蛋白可能无法维持pRB的抑制作用，从而使细胞继续增殖，导致端粒更短。

端粒缩短会导致永久性生长停滞（复制性衰老）或细胞死亡[44,49]. 端粒严重缩短可导致最终融合[45]. 由于后期随机DNA断裂，染色体末端的共价融合可能导致基因组不稳定[50]. 最近有人提出，复制相关的端粒丢失和由此产生的染色体融合可能是由WRN解旋酶基因突变引起的经典沃纳综合征中基因组不稳定的原因[51]. 可以想象，细胞凋亡的增加[19]和DNA积累[52]在HGPS中看到的可能是，至少部分地，继发于端粒丢失的加速。然而，DNA损伤积累和异常核形态可能是独立的表型[52].

异常核形态被广泛用于评估突变层粘连蛋白的毒性。它们通常与携带相同药物的患者并发症的严重程度相关LMNA公司突变[53,54]. 例如，我们报告了两名女性患者，一名非洲裔美国人和一名白种人，她们具有相同的R133L突变，但体内脂肪分布却大不相同。脂肪营养不良的程度似乎与代谢并发症的严重程度以及核形态异常的程度有关[53]. 一项针对R527H突变和相同临床表型的三个纯合子的研究表明，细胞核和异染色质的不规则程度与层粘连前蛋白A的积累有关，有趣的是，与患者年龄有关[54]. 我们的结果也与这些发现一致。在同一类突变、C末端的框内缺失或七肽重复区的氨基酸替换中，核形态异常的程度与疾病的严重程度相关。然而，我们研究中检测到的突变数量是相当多的模式；为了得出更明确的结论，还需要检查其他疾病突变。。

我们的研究中出现了一个有趣的发现，野生型层粘连蛋白A的过度表达也会导致成纤维细胞的端粒丢失加快和复制寿命缩短，尽管其动力学与突变层粘连抗原A的观察结果略有不同。改变任何叶片组件的相对数量可能会影响核叶片的组装和完整性[55]. 过量的层粘连蛋白A可能导致层粘连蛋白和染色质结构的改变以及端粒末端的不稳定。过度表达的野生型层粘连蛋白A被合成为前层粘连肽A，需要进行顺序加工并转化为成熟层粘连素A[14]. 引入的野生型层粘连蛋白A对端粒的不利影响可能归因于前层粘连肽A和/或成熟层粘连素A数量的增加。为了解决这个问题，必须产生内源性层粘连蛋白酶A减少而引入的层粘连酶A表达水平相当的细胞系。

我们对过表达层粘连蛋白A的病理生理学影响的观察具有潜在的临床意义。由基因组重排导致基因拷贝数变异而导致的遗传疾病的报告越来越多[56–59]. 这些现在包括最近一份关于LMNB1型常染色体显性白质营养不良患者[34]. 串联基因组复制LMNB1型产生了3份LMNB1型每个细胞和层粘连蛋白B1蛋白水平显著升高。先前的研究也表明，野生型lamin A的过度表达会导致核形态异常[55]. 因此，保持适当的层流蛋白质组分的化学计量量对于正常的层流组装可能至关重要。虽然在1q21.1-21.3中没有已知的染色体区域片段复制，但跨越LMNA公司轨迹[59] (http://humanparalogy.gs.washington.edu)侧翼重复序列的存在可能导致不相等的交叉和拷贝数变异。因此LMNA公司拷贝数可能是节段性孕激素综合征的多种原因之一[61]. 已经证实，单倍体不足会导致这种综合征[62]. 例如，在一名Emery-Dreifuss肌营养不良患者身上发现了氨基酸第6密码子的杂合终止密码子突变，导致功能性单倍体不足[1]. 然而，鉴于本文报道的结果，我们将继续筛选其他此类病例，以了解LMNA公司.

致谢

脚注

工具书类