肺癌DNA高甲基化和低甲基化的高分辨率定位

摘要

DNA甲基化模式的改变是人类肿瘤中常见的事件(1). 20多年前首次发现癌症组织中的DNA低甲基化(2–6)可能与肿瘤发生有机械联系(7). 20世纪90年代，研究人员报道了几个已知和推测的肿瘤抑制基因和其他参与重要基因组防御途径（如DNA修复）的基因的CpG岛的超甲基化(1,8–12). 今天，有许多报告记录了CpG岛的甲基化与大量不同的基因有关，包括几乎所有类型的人类癌症。在肺癌中，几个已知甲基化的CpG岛包括与CDKN2A型,RASSF1A公司,风险调整资本回报率,MGMT公司,GSTP1标准,CDH13型,空气污染指数,DAPK（DAPK）,TIMP3公司，以及其他几个(13–17). 甲基化频率（即携带甲基化等位基因的所分析肿瘤的百分比）在<10%到≈80%之间，但这些数字因肿瘤组织学、研究人群和/或用于评估甲基化的方法而差异很大。在容易获得的生物材料（如血清或痰）中检测甲基化CpG岛可能有助于肺癌和其他恶性肿瘤的早期诊断(18–20).

重复的DNA元素，如短的和长的散布的核元素（分别是SINE和LINE）和简单的重复序列，通常在肿瘤中被发现是低甲基化的(21–26). 虽然似乎很清楚，甲基化诱导的抑癌基因沉默可能是肿瘤发生中的一个重要事件，但肿瘤相关DNA低甲基化的大小、确切的序列特异性和生物学意义却鲜为人知(21,26). 特别是，单拷贝基因和一般基因组低甲基化的程度和序列背景尚不清楚，通常认为所有基因组序列在肿瘤中都是低甲基化的。

目前的研究方法是针对癌症中DNA甲基化变化的全补体的特征。介绍了几种技术，包括使用限制性内切酶或用抗5-甲基胞嘧啶抗体沉淀来区分甲基化和非甲基化序列(27). 我们最近开发了一种甲基化检测方法，甲基化CpG岛恢复试验（MIRA），该方法不依赖于亚硫酸氢钠的使用，但具有与亚硫酸氢方法类似的灵敏度和特异性(28). MIRA方法基于MBD2b/MBD3L1蛋白复合物对甲基化CpG二核苷酸的高亲和力。甲基化双链DNA序列被富集，并用于制造用于微阵列的探针。为了通过这种方法有效地下拉甲基化DNA，在50个或更少碱基对的片段中需要两个或更多甲基化CpG位点(29). 在本研究中，我们使用MIRA方法结合CpG岛和基因组平铺阵列以高分辨率表征肺鳞癌基因组中发生的DNA甲基化变化。肿瘤特异性CpG岛DNA甲基化标记物以及重复性DNA元件甲基化的特定缺陷被鉴定。

结果

染色体DNA甲基化模式。

为了分析染色体水平上与肿瘤相关的DNA甲基化变化，我们将两个I期、一个II期和一个III期肺SCC与正常匹配肺组织进行了比较。我们使用了MIRA辅助微阵列方法(29)基因组拼接阵列用于高分辨率DNA甲基化分析。将富含MIRA和输入级分以100bp的分辨率与覆盖基因组区域的NimbleGen阵列共杂交(图1). 这些MIRA微阵列提供了染色体DNA甲基化模式的完整和高分辨率映射。我们使用的阵列覆盖了7号染色体的整个短臂[57兆碱基（Mb）]，8号染色体的全部短臂和部分长臂（65 Mb），以及6号染色体（5 Mb）和7号染色体（12.7 Mb）的长臂区域。比较不同患者正常肺和配对鳞状细胞癌样本的DNA甲基化谱。我们观察到整体染色体DNA甲基化模式的显著保守性[图1和支持信息（SI）图5]特别是在比较不同个体的正常肺组织时。

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图1。

保存全球染色体DNA甲基化模式。对正常肺组织（N，绿色）和相应的SCC（T，红色）进行MIRA辅助微阵列。甲基化DNA序列的剖面显示为MIRA富集的DNA信号与输入DNA信号的比率。前两个肿瘤样本为I期SCC，第三个样本为II期，而底部样本为III期肿瘤。有代表性的平铺阵列数据显示，不同个体之间以及在此分辨率水平上正常组织和肿瘤组织之间的染色体甲基化谱普遍保持不变。图中显示了第7号染色体短臂的一段。

CpG岛肿瘤的超甲基化。

在正常和肿瘤样本中，着丝粒和端粒附近的区域比其他基因座更密集地甲基化(图2A类). 在对高分辨率甲基化数据进行更仔细的检查后，我们在一个I期SCC（肿瘤2）的8号染色体短臂上检测到16个癌症特异性高甲基化区域。它们都是CpG岛或富含CpG的区域，通常重叠或位于启动子区域附近(SI表3). 我们通过亚硫酸氢盐测序分析了16个超甲基化位点中11个的DNA甲基化状态（示例如所示图2B类)和联合亚硫酸氢盐限制性分析（COBRA）分析（数据未显示），发现该数据与阵列数据完全一致。在II期和III期肺肿瘤中，我们检测到类似数量的高甲基化区域(SI表3). 不同患者的高甲基化靶点部分重叠。重要的是，我们发现，除了CpG岛之外，没有发现其他序列在肿瘤中相对于正常组织发生过甲基化。

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图2。

沿着8号染色体短臂的DNA甲基化模式。(A类)正常肺组织和匹配的I期SCC肿瘤（肿瘤2）中8号染色体区域和甲基化信号的示意图显示（MIRA富集DNA与输入DNA）。(B类)超甲基化CpG岛示例。甲基化阵列剖面显示在顶部，通过亚硫酸氢盐测序确认肿瘤相关甲基化显示在底部附近。开环，非甲基化CpG位点；闭合圈，甲基化CpG位点。黑色条表示亚硫酸氢盐测序分析的区域。(C类)肺肿瘤中的低甲基化SINE序列示例。阵列信号显示在顶部。蓝色条表示正弦元素的位置。通过亚硫酸氢盐测序确认SINE甲基化状态如下图所示。

重复DNA序列肿瘤中的低甲基化。

除了高甲基化之外，平铺阵列还提供了关于DNA低甲基化程度和序列特异性的信息。SINE和LINE以及人类内源性逆转录病毒（HERV）占人类基因组的45%以上(30). 转座因子高度甲基化，在正常细胞中大多沉默(25,31). 虽然重复序列没有直接表示为平铺阵列上的探针，但我们通过MseI消化后侧翼单拷贝DNA与相邻探针的杂交，获得了SINE元件甲基化状态的信息。在MIRA技术中，高度甲基化的元素被MBD2b/MBD3L1蛋白复合物捕获(29). 在比较了正常肺组织和匹配的SCC样本的DNA甲基化谱后，我们检测到数千个携带SINE元件的基因组区域的肿瘤相关去甲基化事件（示例如下图2C类,图3、和SI图6). 几个任意选择的SINE元素的甲基化状态通过亚硫酸氢盐测序和COBRA分析进行了验证。亚硫酸氢盐测序的引物是对侧翼独特序列的补充，测序数据反映了重复元素本身的甲基化状态。测序数据证实了MIRA辅助的SINE元件平铺阵列甲基化谱及其在肿瘤中广泛的低甲基化。SINE元件的癌特异性低甲基化在单个肿瘤之间没有很好的保存；这反映了针对癌症中去甲基化的单个SINE序列的随机性程度。

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图3。

基因启动子高甲基化和基因内SINE低甲基化UNC5D公司基因。(A类)8号染色体上的该基因显示启动子相关CpG岛的高甲基化（蓝色圆圈）和多个基因内SINE元件的低甲基化（红色圆圈）。(B类)亚硫酸氢盐测序证实了启动子及其近端SINE元件的甲基化状态。紫色条表示亚硫酸氢盐测序分析的区域。黑框表示外显子，箭头表示转录起始位点。

接下来，我们调查了肿瘤SCC2及其相应正常组织中8p染色体上的所有CpG岛。正如预期的那样，98%（159/162）的启动子相关CpG岛在正常肺中未甲基化。此外，还有78个未甲基化的基因内和基因间CpG岛。此外，我们在正常肺中发现159个主要短（<0.6 kb）甲基化的CpG岛。这些甲基化的CpG岛中有64个是基因内的，它们在肿瘤中通常不会发生低甲基化。然而，大多数甲基化岛（共95个）位于离染色体末端0到2Mb之间，与亚巨细胞区重叠，并且这些岛与已知基因无关。几乎所有的甲基化亚端粒CpG岛都由短的直接或间接重复序列组成。95个亚甲基化岛中的54个在肿瘤中经历了去甲基化。它们的去甲基化与癌症组织中重复DNA甲基化的特定缺陷相一致。即使在CpG岛之外，8号染色体的重复丰富的亚巨细胞区在肿瘤中也发生了实质性的低甲基化（如SI图7). 然而，重要的是，非亚端粒单序列基因和基因间区域在肿瘤中没有去甲基化。在分析的157 Mb DNA序列中，我们只能检测到一个独特序列的富含CpG的序列，该序列是癌症特异性去甲基化的。该低甲基化序列位于未标记基因C8orf72的3′端(SI图8).

一个特别有趣的例子是UNC5D公司基因，因为同一基因中发生了癌症特异性的高甲基化和低甲基化事件。其启动子是高甲基化的，而基因内区域下游的SINE序列都是低甲基化的(图3). 这个unc5天胃癌中的基因经常被删除(32)这表明SINE特异性低甲基化与导致该区域杂合性丢失的染色体不稳定性之间可能存在联系。然而，启动子的超甲基化并不总是与基因体中多种元素的去甲基化有关。促进剂甲基化ZNF703型和17号楼例如，基因的长度分别只有3.0和8.5 kb，并且不包含或只包含基因内SINE元件的单个拷贝。

为了更全面地了解其他重复序列中的DNA甲基化变化，我们接下来将我们的分析扩展到包含LINE和HERV的基因座。由于LINE、多拷贝SINE和含HERV的区域的大小以及阵列上缺乏特定探针，因此微阵列分析没有充分覆盖这些区域。因此，我们使用了一种改进的COBRA方法(33)探索LINE和HERV元件的甲基化变化。尽管这种方法与MIRA辅助的分幅阵列不同，不能提供关于定义区域的信息，但它可以估计这些元素甲基化状态的全球变化。我们分析了20个正常肺组织和匹配的SCC样本(SI图9). 我们在SCC样本中观察到LINEs的高度低甲基化。HERV启动子去甲基化不如LINE去甲基化明显，但仍然显著。

另一类重复序列是片段复制，其大小可达数千个碱基。染色体8p23包含一个直接基因组复制区域（30.5kb直接重复），该区域也存在于其他几条染色体上。虽然不可能区分哪一特定染色体片段与阵列上的探针杂交，但很明显，这些重复序列在肿瘤样本中经历了广泛的去甲基化(SI图10).

一套完整的高甲基化CpG岛和高灵敏度和特异性肺癌DNA甲基化生物标记物的发现。

除了染色体拼接阵列外，我们还使用覆盖人类基因组中大多数CpG岛的安捷伦CpG岛屿阵列来全面分析CpG岛国甲基化。在这些阵列上初步分析了五个一级SCC。五种肿瘤中甲基化CpG岛的数量从216个到848个不等(表1). 所有甲基化CpG岛列在SI表4。我们在5例鳞状细胞癌中的5例中发现57个CpG岛甲基化(SI表5). 这些甲基化的CpG岛中有很大一部分定位于同源异型盒基因。对15个最常见甲基化基因的CpG岛序列和侧翼1-kb区域进行了潜在共有DNA序列分析，但我们无法确定任何重要的共有基序。由于最常见的甲基化位点具有作为特异性和敏感性甲基化生物标记物的良好潜力，我们在20个较大的SCC系列中分析了其中12个标记物(图4). 甲基化频率范围为14/20（70%）到20/20（100%）(表2). 这个OTX1（OTX1）-和NR2E1型-相关的CpG岛在所有检测的SCC肿瘤中都被甲基化（100%）。其中一些标记物对肿瘤相关甲基化具有高度特异性，即在肿瘤邻近的正常肺组织中观察到很少或没有甲基化。这些标记包括OTX1型,巴勒2,中小企业1,OC2公司,PAX6,IRX2型,TFAP2A型、和电动汽车2基因(图4). 大多数这些常见的甲基化CpG岛在非癌肺或白细胞DNA中没有显著甲基化(SI图11). 这些基因的特异性和高甲基化频率使其成为未来肺癌早期检测诊断应用的理想候选基因。

表1。

I期肺鳞癌中甲基化CpG岛的数量

样品	甲基化CpG岛
SCC1	632
标准立方厘米2	248
SCC3系列	848
SCC4公司	743
SCC5系列	216

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图4。

肺SCC中经常甲基化的CpG岛。通过基于亚硫酸氢盐的COBRA分析验证正常肺组织和匹配的I期SCC样本中的CpG岛DNA甲基化标记。SCCs（T）和匹配正常组织（N）之间的甲基化差异通过COBRA分析所示基因靶点进行分析，无BstUI的控制消化；+，BstUI消化样品。BstUI的消化表明被测试序列的甲基化。

表2。

20例肺SCC中12种DNA甲基化生物标记物的甲基化频率

SCC编号。	阶段	MSX1系列	OTX1（OTX1）	巴勒2	PAX6	中小企业1	OC2公司	TFAP2A型	OSR1号机组	ZNF577型	电动汽车2	红外线2	NR2E1型
1	我	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
2	我	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
三	我	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
4	我	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
5	我	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
6	我	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
7	我	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
8	我	+	+	−	−	+	−	+	+	+	+	+	+
9	我	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
10	我	+	+	+	+	+	−	+	+	+	+	+	+
11	我	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
12	二	+	+	+	+	−	+	+	+	+	+	+	+
13	二	+	+	+	−	+	+	+	+	−	−	+	+
14	二	−	+	−	−	−	−	+	+	+	−	−	+
15	二	+	+	+	+	+	−	+	+	+	+	+	+
16	二	+	+	+	+	−	−	−	+	+	−	+	+
17	三	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
18	三	+	+	−	+	+	+	+	+	−	−	+	+
19	三	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
20	三	+	+	+	+	+	−	+	+	+	+	+	+
频率		19/20	20/20	17/20	17/20	17/20	14/20	19/20	20/20	18/20	16/20	19/20	20/20

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+，甲基化CpG岛；−，COBRA分析测定的非甲基化CpG岛。

讨论

我们使用MIRA方法结合基因组拼接阵列对肺癌基因组中的DNA甲基化模式进行了全面分析。与基于抗体的沉淀方法相比，MIRA的优势在于其更高的灵敏度（未公开的数据）和对双链甲基化CpG靶的高亲和力。它倾向于在≈50个碱基对内与至少两个甲基化CpG结合，从而防止对甲基化DNA分子的高估。对于NimbleGen平铺阵列，当特定区域中50-60%的CpG甲基化时，CpG岛的超甲基化很容易通过亚硫酸氢盐测序检测和验证(图2和​和3）。三). 考虑到肿瘤中峰值的强度，很可能很容易检测到低得多的甲基化频率（20%），但我们还没有发现这样的区域。对于平铺阵列上的低甲基化，我们可以很容易地检测到一个地区60-90%的CpG位点的去甲基化（例如图2,​,3,三、和SI图8). 峰值强度差异表明，我们应该能够检测到更温和的差异，可能≥30%的低甲基化，但该方法不太可能轻易检测到少量的低甲基化度，即5–25%，因为这样的区域仍然高度甲基化，并将在MIRA程序中被删除。对于安捷伦CpG岛阵列，当多个紧密间隔探针的折叠差异因子>2时，我们能够通过基于亚硫酸氢盐的方法在肿瘤中普遍证实高甲基化CpG岛屿。我们还确认了已知的SCC超甲基化CpG岛，如CDKN2型和TCF21型然而，一些甲基化基因可能无法用这种方法检测到，因为相关的MseI片段可能太大，可能无法扩增。

本研究最重要的发现之一是，癌症特异性去甲基化染色体区域几乎完全映射到含有重复DNA的序列（LINE、SINE、LTR元件和片段重复）和粒下区域。亚端粒DNA由亚端粒重复序列和片段复制组成，并被高度甲基化(34,35). 肿瘤中染色体8p的末端2Mb显著低甲基化。然而，我们对7号和8号染色体的分析表明，单拷贝、非端粒DNA序列的去甲基化是非常罕见的事件。当单拷贝基因发生去甲基化时，它可能与附近重复DNA的去甲基化有关（尽管这在形式上尚待测试）。该研究的局限性在于样本数量和所分析的染色体数量。例如，肿瘤中可能还有其他单拷贝基因甲基化程度低，例如MAGE基因（位于第15和X染色体上）(36)和maspin基因（位于18号染色体上）(37,38).

重复元件低甲基化的特异性与维持重复DNA甲基化的分子机制的缺陷一致。该缺陷的性质目前尚不清楚。一种可能性是，重复的DNA在癌细胞中被主动去甲基化，可能是通过DNA去甲基化酶基因的重新激活，该基因通常只在早期发育中表达。迄今为止，哺乳动物DNA去甲基化酶的性质仍不清楚(39). 或者，癌细胞中重复DNA甲基化的维持过程可能有缺陷。DNA甲基转移酶DNMT1负责可靠复制现有DNA甲基化模式，但没有证据表明DNMT1功能改变在癌症相关DNA低甲基化中的作用。DNMT3A和DNMT3B为从头开始DNA甲基转移酶。DNMT3L本身缺乏甲基转移酶活性，能够刺激DNMT3A和DNMT3B的活性(40). DNMT3L显示正调控小鼠生殖细胞印迹序列和重复序列的DNA甲基化(41). 然而，这些蛋白质在维持体细胞重复序列甲基化中的作用尚不清楚。除了引发DNA甲基转移酶自身的缺陷外，另一种可能性是，它们对癌细胞中重复DNA的获取可能会受到阻碍。两种染色质相关DNA解旋酶LSH和ATRX的缺陷与基因靶向小鼠的DNA低甲基化有关(42,43). 虽然最初认为LSH是总基因组DNA甲基化所必需的(43)，这种缺陷可能对重复DNA最为重要(44). 人类肿瘤中ATRX或LSH（也称为PASG、SMARCA6或HELLS）缺乏的报道很少(45,46). 通过异染色质形成引导重复DNA甲基化的双链RNA机制也是一种形式上的可能性，值得进一步研究。

本文的第二个重要方面是利用微阵列对人类肺癌中的CpG岛进行综合分析。我们能够测量>27000个CpG岛的甲基化水平，并发现在我们的肺SCC样本中，这些岛中有216到848个被甲基化。这些数字与癌症中甲基化的CpG岛子集分析得出的早期估计相符(47). 我们发现不同CpG密度的CpG岛可以在肿瘤中发生高甲基化(SI表3). 很明显，并非所有这些甲基化基因都可以成为肿瘤抑制基因。例如，与先前的观察结果一致，甲基化基因的一个重要亚群（20-40%，取决于肿瘤）是同源异型盒基因(48). 同源框基因相关的CpG岛是本研究确定的最佳I期疾病DNA甲基化标记物之一。我们发现OTX1（OTX1）,PAX6,红外线2,OC2公司,TFAP2A型、和电动汽车2这些基因是肿瘤特异性甲基化的，在正常肺组织或血液DNA中很少发现甲基化。甲基化OTX1（OTX1）,IRX2型,OC2公司、和电动汽车2人类癌症中的基因尚未报道。此外，重要的是，这些标记物的甲基化频率（检测的12个标记物中有11个标记物的80-100%的肿瘤甲基化；OC2标记物的70%；表2)远远高于先前报道的其他肺癌DNA甲基化标记物的甲基化频率。例如，我们发现OTX1（OTX1）20例肿瘤中有20例（100%）肿瘤特异性甲基化。这些标记物非常适合用于临床或诊断应用，目的是检测血液或痰等体液中的早期疾病，或通过分子诊断测试进行疾病管理和随访。

材料和方法

补充材料

致谢。

脚注

工具书类