RPEL基序通过肌动蛋白结合将血清反应因子辅因子MAL而非肌卡蛋白与Rho信号联系起来^{▿ §}

免疫荧光显微镜。

如前所述进行免疫荧光显微镜检查(23). 在六孔培养皿中，每孔150000个细胞转染100 ng C末端血凝素（HA）标记的MAL、MC或衍生物；50 ng FLAG-MAL；10 ng FLAG-MAL（2-204）-丙酮酸激酶（PK）；或FLAG-MC（2-150）-PK和50 ng MYC-β-actin R62D。主要抗体如下：抗FLAG（F7425；Sigma）、抗HA（12CA5；Roche）和抗MYC（gE10；CR-UK）。刺激前，细胞在转染后保存在含有0.5%血清的培养基中20小时。除非另有说明，否则用15%胎牛血清、2μM CD、0.1μM茉莉酸内酯、0.3μM latrunculin B（LatB）或20 nM钩端霉素B（LMB）处理细胞30分钟。在150至200个细胞中，MAL定位被评分为主要为细胞核、泛细胞或主要为细胞质。图中显示了三个独立实验的数据以及平均值标准误差（SEM）。

荧光素酶报告分析。

在24孔培养皿（30000个细胞/孔）中的细胞转染SRF报告子p3DA.luc（8 ng）、参考报告子ptk-RL（20 ng）和SRF-VP16（40 ng）、MAL和MAL突变衍生物构建物（10 ng）或C3转移酶（2 ng）。细胞在0.5%胎牛血清中保存22 h，然后测量荧光素酶活性。萤火虫荧光素酶活性标准化为雷尼利亚荧光素酶活性。三个独立的SEM实验数据与共表达SRF-VP16的报告激活相关。C3转移酶共表达的数据通过SRF-VP16和C3转移因子共表达归一化为报告激活。

GST下拉测定。

谷胱甘肽琼脂糖（Sigma）被谷胱甘苷饱和S公司-转移酶（GST）或GST融合蛋白和肽大肠杆菌在结合缓冲液（50 mM Tris-HCl[pH8]，100 mM NaCl，3 mM MgCl₂0.2 mM EGTA、0.2 mM ATP、1 mM二硫苏糖醇[DTT]和蛋白酶抑制剂），通过注射剂和离心去除不溶性物质。使用相当于150 mm NIH 3T3细胞的汇合皿进行两次结合反应。在结合缓冲液中结合2小时，如有指示，补充0.5%TX-100。在不含蛋白酶抑制剂的各自结合缓冲液中清洗树脂三次，并进行4至12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹，检测内源性β-肌动蛋白（AC-15；Sigma）。印迹被蓬索染色以显示诱饵输入。

荧光各向异性。

荧光素异硫氰酸酯（FITC）结合肽由英国癌症研究院肽合成设施合成，并使用方程式ɛ进行定量₄₉₂=83000米⁻¹厘米⁻¹肌动蛋白从兔子骨骼肌中提纯，在G缓冲液（2 mM Tris-HCl[pH8.0]，0.3 mM MgCl）中培养使其不可聚合₂0.2 mM EGTA，0.2 mM ATP，0.5 mM DTT），10倍的LatB摩尔过量量（钙生物化学），持续15 h。通过添加20×起始缓冲液（2 M NaCl，60 mM MgCl）使未复合肌动蛋白聚合₂，10 mM ATP）并通过超速离心去除。在总体积为50μl的Mg中测量荧光各向异性²⁺-F缓冲液（2 mM Tris-HCl，pH 8.0；100 mM NaCl；3 mM MgCl₂; 0.2 mM EGTA；0.7 mM ATP；0.5 mM DTT）。在0.5μM下使用FITC-共轭肽，同时从1 nM到59μM添加LatB-actin。在室温下至少混合5小时后读取板材，以确保使用Safire建立结合平衡²荧光偏振模式下的微孔板阅读器（Tecan）（激发，470±20 nm；发射，525±20 nm，10次读取；40μs积分时间）及其麦哲伦软件（5.03版）。各向异性（A）由麦哲伦软件使用公式A=(我_平行−我_垂直的)/(我_平行+ 2我_垂直的)，其中我_平行和我_垂直的分别表示平行于和垂直于激发平面的荧光强度，G因子为1.2041。确定平衡解离常数（K）的非线性回归_D类)使用GraFit 5.0.11版（Erithacus软件），使用以下等式计算值(7):

哪里A类是各向异性的测量值；A类_（f）和A类_b条分别是自由肽和结合肽的各向异性值；和[R（右）_t吨]和[L（左）_t吨]分别为总肽（“受体”）和总LatB-actin（“配体”）浓度。

活细胞成像和光漂白。

基本上按照参考文献中的描述进行了肝细胞成像23简单地说，为了研究光漂白过程中的荧光损失，将细胞置于MatTek培养皿（MatTek Corporation）上，转染50 ng MAL-green荧光蛋白（GFP）和嵌合-GFP质粒或20 ng MAL（1-204）-2GFP或其衍生物，并在成像前在含0.3%血清的苯酚无红培养基中保持18小时。在成像前30至60分钟刺激细胞，并将细胞质中的一个区域重复漂白80秒。为了分析，减去背景，并将漂白前的核荧光设置为1。每个条件下至少分析两个独立实验中的10个细胞。为了分析刺激后MAL（1-204）-2GFP的核积累，使用了表达MAL（1-204）-2GFP的稳定细胞系。刺激前的核荧光设置为0，完全积累后的核荧光设为1。对每种情况下三部独立电影中的至少12个细胞进行分析。有关详细信息，请参阅参考23.

RPEL结构域控制MAL的动态核质穿梭。

接下来，我们测试了在缺乏其他MAL或MC序列的情况下，RPEL结构域是否足以介导Rho肌动蛋白调节的核质穿梭。MAL和MC RPEL结构域融合到PK，PK是60-kDa亚基（MAL（2-204）-PK和MC（2-150）-PK）的细胞质四聚体（图。​（图2A）2安培) (10). 我们评估了融合子或点突变衍生物在先前显示影响MAL亚细胞定位的许多条件下的行为（图。​（图2B）2B型) (14,23).

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图2。

MAL的RPEL结构域足以进行核质穿梭。（A） PK融合蛋白示意图。（B） PK融合蛋白的免疫荧光显微镜。瞬时转染细胞被血清饥饿、饥饿和刺激，或按指示处理（PK衍生物，绿色；F-actin，红色）。底部，免疫荧光显微镜定量：MAL、MAL（2-204）-PK、MC和MC（2-150）-PK在150至200个细胞中的定位评分如下：N，核；N/C，细胞核和细胞质中强度相当；C、 细胞质（有关示例，另请参见图。​图5B）。第5页). 进行了三个独立的实验。误差线，SEM；FCS，胎牛血清；Jasp，茉莉酸内酯；R62D，β-肌动蛋白R62D的共表达。xxx指通过R→A交换所有三个RPEL基序的突变（图。​（图5A）。5A级). MAL（2-204）-PK的表达见图补充材料中的图S4。

MAL（2-204）-PK的表现与全长MAL非常相似。在缺乏血清的细胞中，它主要是细胞质，在诱导MAL核积累的处理后，它在细胞核中积累（图。​（图2B，2B型，比较左栏和右栏）。血清诱导的MAL（2-204）-PK核聚积可通过血清洗脱或LatB处理快速逆转，并通过Rho失活或非聚合β-肌动蛋白突变体R62D的过度表达来阻止。如完整的MAL所示，所有三个RPEL基序中保守精氨酸的丙氨酸替换（随后称为R→A突变）导致MAL（2-204）-PK的构成性核定位。无论是由血清刺激还是RPEL基模突变诱导的核积累都依赖于RPEL域B2区域（图。​（图2B，2B型，比较左栏和右栏）(14,23). 这个结果支持了B2区是一个受肌动蛋白结合调控的核定位信号的观点(23). 与MC一样，MC（2-150）-PK在未刺激细胞中是核（图。​（图2B）。2B型). 血清刺激和LatB治疗均不影响MC或MC（2-150）-PK的核定位，尽管β-actin R62D的共表达(19)导致MC和MC（2-150）-PK适度地重新定位到细胞质，这表明MC RPEL结构域原则上可能与肌动蛋白结合。MC和MC（2-150）-PK中B2区域的缺失分别导致其实质性或完全细胞质定位（数据未显示）。综上所述，这些观察结果表明，RPEL结构域足以响应Rho-actin信号，MAL和MC的不同行为反映了其RPEL结构区的不同属性。

为了评估RPEL融合蛋白的动力学，我们将MAL和MC RPEL结构域连接到一个双GFP标记[MAL（1-204）-2GFP和MC（1-150）-2GFP]（图。​（图3A）。3A级). 在缺乏血清的细胞中，MAL（1-204）-2GFP为细胞质；LMB处理后其核积累率显示其核输入的基本速率与之前在MAL-GFP中观察到的血清或CD刺激后的基本速率相当（图。​（图3B）3B公司) (23). 为了监测MAL（2-204）-2GFP的核出口，我们再次进行了FLIP实验。在实验条件下，GFP的核荧光在细胞质漂白过程中迅速衰减（图。​（图3C）。3C公司). 在LMB存在下，MC（1-150）-2GFP的核荧光与MAL-GFP的核荧光一样，在很大程度上对细胞质漂白不敏感。因此，MC的RPEL域不能促进核出口。CD治疗或血清刺激后核MAL（1-204）-2GFP荧光的漂白效率稍高，与MAL（1-204）-2GFP的肌动蛋白结合缺陷xxx衍生物的漂白效率相当。之前在MAL-GFP中也观察到类似结果(23). 总之，MAL和MC-RPEL结构域足以在MRTF上赋予肌动蛋白控制和CRM1依赖的核质穿梭或构成性核定位。

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图3。

MAL RPEL结构域足以介导MAL的动态核质穿梭。（A）2GFP融合蛋白的示意图。（B） 指示刺激下MAL（1-204）-2GFP的核积累动力学；顶部，代表性显微照片；底部，核荧光定量（每个条件至少12个细胞；误差条，SD）。t[s]，时间单位为秒。（C） MAL RPEL domin通过阻止核出口，导致血清和CD-诱导的核聚积。FLIP分析如图所示。​图1D。一维MAL（1-204）-2GFP和MC（1-150）-2GFP的定位见补充材料中的图S1。

MAL和MC RPEL结构域与肌动蛋白的结合不同。

由于肌动蛋白结合对于将MAL定位与Rho信号传导耦合至关重要，我们测试了MAL而不是MC与Rho信号传导的连接是否是肌动蛋白与其RPEL结构域差异结合的结果。在GST下拉分析中，GST-MAL（2-261）从总细胞裂解物中招募内源性β-肌动蛋白；GST-MC（2-209）招募肌动蛋白的效率大大降低，并且在洗涤剂的存在下进一步减弱（图。​（图4A）。4A级). 为了测试肌动蛋白与MAL和MC的差异结合是否发生在细胞环境中，我们使用FLIM检测到的FRET（图。​（图4B）。4B类). 在本试验中，MAL-GFP和Cy3-免疫标记的MYC-β-actin之间的FRET可以很容易地检测到（FRET效率，在血清饥饿和LMB处理的细胞中分别为4.55和4.91）(23). 相反，在相同条件下，我们没有检测到MC-GFP和肌动蛋白的FRET（FRET效率，0.5）。因此，两个RPEL结构域的差异调节特性与其体内外肌动蛋白结合特性的差异有关。

孤立的RPEL基序定义了一个肌动蛋白结合元素。

为了研究MAL和MC RPEL结构域差异肌动蛋白结合特性的基础，我们分析了单个RPEL基序的特性。系统发育分析表明，三个MAL RPEL基序中的每一个与其他家族成员中的相应基序的关系都比与MAL中的其他基序更密切。RPEL1和RPEL2在MAL和MC之间差异最大，而RPEL3相对保守（图。​（图4C4摄氏度).

我们首先使用单个RPEL基序作为诱饵进行GST下拉分析。MAL RPEL1或RPEL2的GST融合有效地从细胞裂解物中招募β-肌动蛋白，而MAL RPEL 3无效地恢复β-肌动蛋白（图。​（图4D，4D（四维），左）。在本试验中，MAL RPEL1 R→A取代大大减少，但没有消除与肌动蛋白的相互作用，而RPEL2和RPEL3中的类似取代的影响更大。MAL RPEL1中一个更严重的电荷逆转突变RR81/82DD阻断了其与肌动蛋白的相互作用。与MAL相比，尽管MC RPEL3似乎与MAL RPEL3结合肌动蛋白类似（图。​（图4D，4D（四维），右侧）。

为了在溶液结合平衡条件下定量测定RPEL-肌动蛋白结合亲和力，我们采用了荧光各向异性分析。将越来越多的非聚合LatB-actin滴定到含有恒定量的32残基RPEL肽的结合反应中，并用荧光素对其进行N端修饰。测量了525nm处的荧光各向异性，并根据材料和方法中的描述导出了平衡解离常数。MAL RPEL1和RPEL2结合肌动蛋白，亲和力分别为5.4±0.5μM和2.3±0.2μM（图。​（图4E）。第四版). MAL RPEL3结合较弱三到七倍，具有K_D类仅为18.8±1.0μM。R→A突变使MAL RPEL1和RPEL2对肌动蛋白的亲和力分别降低到16.4±2.1μM和15.0±3.3μM，并将MAL RPEL 3的亲和力降低到检测极限以下，RPEL1电荷反转突变也是如此。肌动蛋白以K键与MC RPEL1结合_D类15.4±0.8μM，比MAL RPEL1低三倍，但在我们的检测条件下，肌动蛋白与MC RPEL2的结合无法检测到。MC RPEL3与MAL RPEL3的亲和力非常相似，K_D类16.6±0.2μM。综上所述，这些数据表明，RPEL基序定义了一种具有广泛肌动蛋白亲和力的肌动蛋白结合元件，并表明MAL和MC RPEL结构域的不同性质可能反映了它们的RPEL基模对肌动蛋白的亲和力的差异。

MAL RPEL的三个基序在功能上协同调节。

接下来，我们利用肌动蛋白结合分析中的见解来探讨RPEL基序对MAL调节的功能意义。为此，我们在每个RPEL基序中引入R→A突变，生成单（x23；1x3；12x）、双（1xx；x2x；xx3）和三（xxx）MAL RPEL域突变体（图。​（图5A）。5A级). 这些蛋白在NIH 3T3细胞中表达，并分析其亚细胞定位及其激活SRF报告子的潜力。

在缺乏血清的条件下，在不到10%的细胞中可以检测到野生型MAL的细胞核（细胞核或在细胞核和细胞质中具有同等强度）（图。​（图5B）第5页) (14). RPEL1、RPEL2和RPEL3处的丙氨酸替换分别将其增加到约25%、40%和70%的细胞。与单个RPEL突变体相比，所有双RPEL突突变体都表现出在细胞核内积聚的趋势，MAL 1xx和xxx几乎无法区分，90%的细胞主要表现为细胞核定位（图。​（图5B）。第5页). 血清刺激后，所有蛋白质在>80%的细胞中主要为细胞核（数据未显示）。这些突变体激活SRF报告子的能力与表现出明显核聚积的细胞比例密切相关（图。​（图5C）。5摄氏度). 单核苷酸替代降低了报告者对Rho的依赖性，其中RPEL3突变的影响最大，而双重替代则进一步降低了Rho依赖性（图。​（图5C）。5摄氏度). 因此，MAL调控需要所有三个RPEL基序的完整性。

丙氨酸取代的MAL RPEL1和RPEL2肽对肌动蛋白的亲和力与MAL RPEL 3相似（图。​（图4E）。第四版). 为了更深入地分析肌动蛋白与RPEL1结合的作用，我们将RPEL1电荷反转突变（RR81/82DD）引入MAL（MAL-1^尽职调查)（图。​（图5A）。5A级). MAL-1型^尽职调查比MAL x23更严重的放松管制：只有30%的细胞是细胞质，大约60%是全细胞，大约10%是细胞核（图。​（图5D），第五天)它更强烈地激活了SRF报告器（图。​（图5E）。第五版). 我们对MAL RPEL2使用了类似的方法，在这种情况下，精确地将其替换为MC RPEL2，后者在体外不能检测到与肌动蛋白的结合（MAL-2^国会议员)（图。​（图5A）。5A级). 该突变体也表现出显著的失调，在20%的细胞中有核定位，其余大部分细胞显示出泛细胞定位（图。​（图5D）；第五天); MAL-2的表达^国会议员在很大程度上独立于Rho（图。​（图5E第五版).

这些结果表明，三个MAL RPEL基序在功能上相互配合，即使是最弱的肌动蛋白结合基序RPEL3也在MAL调控中发挥着重要作用。任何单个MAL RPEL基序的突变都足以导致MAL亚细胞定位的放松调节，前提是此类突变有效地消除了体外RPEL-actin相互作用。总之，这些结果表明，MAL调节涉及高阶肌动蛋白MAL复合物的组装（见讨论）。

RPEL1-RPEL2装置规定了MAL和MC的差动调节。

MAL、MC RPEL1和RPEL2的不同肌动蛋白结合亲和力表明，MAL和MC差异调节的原因可能存在于包含这两个RPEL基序的单元中。事实上，上述观察结果表明，用MC取代MAL RPEL2会导致MAL亚细胞定位和活性的实质性放松管制，这与这一观点是一致的。为了更系统地解决RPEL基序在MC定位中的作用，我们生成了一系列MAL-MC嵌合体，其中N末端序列的交换范围不断增加，交叉点位于RPEL-RPEL连接子序列的中心（见图。​图6A6A级用于命名）。分析嵌合体的亚细胞定位和在缺血细胞中激活SRF报告子的能力，并使用FLIP分析其核输出率。

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图6。

MAL调控需要MAL RPEL基序1和2的完整单元。（A） MAL-MC嵌合体氨基末端的示意图。命名：N，N扩展；数字是指RPEL图案的位置。B2区域为黄色。（B、E和G）免疫荧光显微镜定量：如图所示，在150至200个血清缺乏的细胞中对所示的C末端HA-标记的MAL和MC衍生物的定位进行评分。​图5B。第5页表达水平参见补充材料中的图S4，代表性显微照片参见补充材料中的图S3。（C、F和H）通过表达指示的MAL和MC衍生物激活SRF荧光素酶报告子，如图所示进行分析。​图1D。一维（D）FLIP测量的MAL-MC嵌合体的核输出，如图。​图1E1E级.

我们首先使用嵌合体来绘制哪些RPEL结构域序列是确定MC核定位所必需的。用MC的序列替换MAL N延伸（这些序列的N末端到RPEL1）对MAL调节有轻微影响，更多的细胞显示出全细胞定位。然而，用相应的MC序列替换MAL N延伸和RPEL1导致其深度放松调控：MC-N1-MAL在大约70%的细胞中是核细胞，而在几乎所有剩余的细胞中则是全细胞的（图。​（图6B），6亿)它独立于Rho功能（图。​（图6C）。6摄氏度). 在FLIP试验中，与MC和MC-N123-MAL相比，MC-N1-MAL的漂白率略有增加，表明其对出口的敏感性较弱（图。​（图6D；第6天; 比较图。​图1E）。1E级). 用MC序列进一步替换MAL RPEL结构域增加了以核蛋白为主的细胞比例，并以Rho非依赖性的方式强烈激活SRF报告子。结合MAL-2的特性^国会议员图中所示的突变体。​图5，5这些结果表明，MC RPEL1和RPEL2序列在决定其核定位中起着重要作用。

为了确定RPEL结构域的哪些部分指定MAL样调控，我们用来自MAL的相应序列替换了MC RPEL结构域序列（图。​（图6A）。6A级). 用MAL替换MC N延伸对MC亚细胞定位或其激活SRF报告子的能力几乎没有影响。用MAL序列替换MC N延伸和RPEL1序列具有更大的效果：大多数细胞在细胞核和细胞质中表达MAL-N1-MC，与MAL一样，SRF报告子的激活现在基本上依赖于Rho（图。6B和C). 用MAL的等效序列替换MC N延伸、RPEL1和RPEL2，在稳态亚细胞定位和SRF报告子激活水平上对MC进行了真正的MAL样调节（图。6B和C). 经LMB处理后，MAL-N12-MC在细胞核中积累，表明其不断穿梭于细胞核中，FLIP对其核输出率的分析表明，在血清或CD刺激下，其行为与完整的MAL或MAL-N123-MC非常相似（图。​（图6D；第6天; 比较图。​图1E）。1E级). 最后，我们测试了用MAL替代MC RPEL2是否足以对MC进行MAL样调节^MAL公司，的行为与MC本身完全相同（图。6E和F). 这些结果表明，MAL的调节特性要求其RPEL1-RPEL2单元的完整性，与图中所示的分析一致。​图55.

综上所述，MAL-MC嵌合体的行为表明，MAL和MC的不同调节行为都是由其RPEL1-RPEL2单元的身份决定的。

我们感谢Nicola O'Reilly和肽合成实验室出色的肽合成，感谢Maureen Biggerstaff和Rachel Coulthard在荧光各向异性测量和数据分析方面的帮助，感谢Stéphane Mouilleron的有益讨论，感谢Rob Nicolas的持续支持。我们感谢实验室同事和卡罗琳·希尔、迈克尔·韦、尼尔·麦克唐纳以及实验室成员对手稿的技术帮助、讨论和评论。我们感谢伦敦研究所光学显微镜设施对生命细胞成像的帮助。

这项工作由英国癌症研究所资助。M.K.V.得到EMBO长期奖学金的支持，S.G.是德国沃尔克斯研究所的研究员，由伯林格·英格尔海姆基金会（Boehringer Ingelheim Fonds）的产前奖学金提供支持。

作者没有相互冲突的经济利益。