病毒特异性CD8的贡献⁺T细胞受体转基因小鼠模型中细胞毒性T细胞对病毒清除或流感病毒感染病理表现的影响

摘要

甲型流感病毒具有修饰其表面抗原、血凝素和神经氨酸酶的能力(1–4)从而允许同一宿主的连续再感染。这种抗原变异导致了世界范围的流行病，并通过设计用于诱导中和抗体的疫苗阻止了疾病的控制。大部分CD8⁺CTL针对保守的内部病毒蛋白，如核蛋白（NP）¹甲型流感病毒。这些CD8⁺CTL具有广泛的交叉反应性，可识别所有主要的病毒亚型（有关综述，请参阅参考文献5–8). 因此，大量的努力都集中在开发能够诱导CD8的疫苗上⁺识别保守病毒蛋白肽表位的CTL存储器。由于哺乳动物流感病毒的复制仅限于呼吸道上皮细胞，因此免疫系统对流感的系统暴露受到限制(9,10)，CD8的贡献⁺主要抗病毒反应中的CTL本身并不明显。人类流感病毒感染的复发性(11)表明CD8介导的免疫⁺针对保守内部病毒蛋白的CTL是暂时的或仅部分有效。因此，CTL记忆细胞在流感感染后出现的频率相对较高(6,12–14)对人类异亚型病毒株再感染引起的发病率和死亡率影响不大(15–17). 关于CD8作用的观察⁺动物异亚型免疫中的CTL给出了不同的结论。因此，病毒特异性CD8⁺CTL在缺乏成熟B细胞和Abs的小鼠中保护免受甲型流感感染的攻击（18-20）。类似地，针对甲型流感病毒NP的克隆CTL可以被动传递保护(21). 另一方面，用重组NP或表达NP的载体进行主动免疫只能起到弱保护作用(22–27).

在我们的研究中，我们采用了一种新的方法来评估CD8的生理特性⁺流感感染中的CTL。由于正常动物中抗原特异性CTL的频率很低且TCR多样性很高，因此原位跟踪CTL效应器功能在技术上具有挑战性。为了克服这个问题，我们使用转基因（Tg）小鼠表达从C57BL/10小鼠获得的NP特异性T细胞克隆衍生的统一类型的αβTCR异二聚体（αβ4/β11；称为F5-Tg）(28,29). F5-Tg TCR识别由MHC-D呈现的甲型流感病毒A/NT/60/68（H3N2）的NP肽（氨基酸366–374）^b条I类分子，在～90%的外周T细胞中表达。因此，小鼠拥有高频率的抗病毒CTL前体细胞。通过用Vβ11、CD8特异性抗体和T细胞活化标记物对细胞进行染色，可以在原位直接鉴定和表征反应性Tg-CTL。我们在这里演示CD8⁺在缺乏保护性Abs的情况下，针对甲型流感病毒的保守NP的CTL可以有效地阻断病毒原位复制，并促进存活或加剧致命的流感肺炎。这些结果清楚地证明了抗病毒CD8诱导的保护和病理作用⁺CTL代表病原体和宿主免疫系统之间的不同平衡状态。这一考虑对肺部尤其重要，因为肺部结构和肺功能的破坏可能会造成毁灭性后果。

材料和方法

结果

抗流感病毒的保护与抗病毒抗体的活性有关，而CTL反应在局部免疫中起外围作用

鼻腔给药≤10⁶A型流感病毒A/NT/60/68对F5-Tg小鼠的PFU导致肺部感染和相关病理学，并在2周内定期得到解决（图。​（图1，1,A类,电子、和我). 病毒复制在第2天到第4天达到高峰，随后在第8天病毒肺滴度迅速下降。这与血清IgM和IgG抗病毒抗体水平增加有关。注意F5-Tg小鼠含有大量成熟CD4⁺胸腺中通过内源性TCRα链选择的Th细胞（由于不太严格的等位基因排除）以及产生IgG需要B细胞与病毒特异性CD4相互作用⁺T细胞(31,42,43). 接种高剂量（10⁷A/NT/60/68的PFU）导致病毒在肺部快速传播；～40%的动物死亡（图。​（图11 A类). 由BAL和肺相关淋巴系统组织分离的Tg-CTL能够识别和溶解病毒感染的靶细胞，或在标准细胞毒性试验中用Tg-CTL肽表位脉冲的细胞（数据未显示）。最大细胞溶解活性与第6-8天肺部病毒减少相关。从脾或非肺相关淋巴系统组织获得的细胞中未观察到Tg-CTL激活的证据，这些细胞直接通过CTL试验或通过激活标记物染色进行检测（数据未显示）。在对照组C57BL/10（H-2）中观察到类似的感染过程^b条)近交系小鼠（图。​（图1，1,B类,F类、和J型). 为了直接评估抗病毒CTL在预防流感方面的作用，F5-Tg小鼠感染了Tg-CTL无法识别的X31重配病毒。当X31感染的F5 Tg小鼠与对照C57BL/10小鼠进行比较时（图。​（图1，1,C类,G公司、和K（K），与D类,H（H）、和L（左）)，在存活率、肺部病毒复制或病毒特异性抗体滴度方面未观察到显著差异。病毒下降的整体动力学略有不同，在F5-Tg小鼠中直到第12天都能检测到病毒。这些观察结果表明，在抗病毒抗体存在的情况下，流感病毒NP特异性宿主CTL在局部免疫中仅起外围作用。

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图1

通过降低肺部病毒滴度和存活率，观察小鼠对甲型流感病毒感染的保护作用，并与抗病毒抗体水平相关。F5-Tg或C57BL/10对照小鼠感染A/NT/60/68(A类和B类,电子和F类、和我和J型)或X31(C类和D类,G公司和H（H）、和K（K）和L（左）)甲型流感病毒。(A–D)小鼠感染了10只⁷全氟辛烷磺酸(实心圆)或≤10⁶PFU（功率因数校正装置）(实心三角形)10–15只小鼠的存活率。(E–H（E–H）)抗病毒IgG含量(开放的圆圈)或IgM(实心圆)10只感染小鼠血清中⁶测定甲型流感病毒PFU。抗体活性的显示值为三只小鼠的平均对数（ELISA滴度）±SEM。(I–L型)在感染10只⁶甲型流感病毒PFU。三到五只小鼠的病毒滴度显示为每克肺的平均log10 TCID50±SEM。

在缺乏保护性抗体的情况下，CTL能保护宿主免受流感病毒的感染吗？

接下来，我们使用RAG-1缺陷的F5小鼠（F5–RAG-1），在缺乏抗病毒抗体的情况下，通过评估CTL的免疫反应性，更严格地评估了CTL在流感病毒感染中的作用^−/−). 这些小鼠的外周血淋巴细胞库仅由Tg-CTL组成(31). F5–RAG-1层^−/−和RAG-1^−/−（后者缺乏B和T细胞）对照小鼠经鼻接种不同剂量的A/NT/60/68或X31流感病毒，并通过以下方式检查CTL功能。

CTL根据肺部病毒载量的大小对流感病理学起保护或促进作用。

通过测量F5–RAG-1的存活率来评估CTL限制急性肺部感染严重程度的能力^−/−感染A/NT/60/68后的小鼠（图。​（图2，2,左边). 在最高剂量下（10⁷PFU），所有小鼠在第2天至第6天之间死亡（图。​（图22 A类,左边). 当病毒接种量减少时，观察到死亡时间逐渐延迟，存活率增加（图。​（图2，2,B–E类)，在≤10时观察到完全保护⁴PFU。所有控制RAG-1^−/−感染A/NT/60/68的小鼠死于病毒性疾病（0%存活率；图。​图2，2,左边). 同样，所有F5–RAG-1^−/−和RAG-1^−/−感染X31的小鼠在最初20天内死亡，具有可比的动力学（图。​（图2，2,正确的). F5–RAG-1^−/−感染10⁷A/NT/60/68的PFU死亡速度显著加快（第2-6天；P（P）<0.0001（通过Wilcoxon测试）比RAG-1^−/−小鼠（第6–24天）但在相对低剂量的感染（≤10）下存活⁴PFU）表明，根据肺部病毒载量的大小，CTL可以在流感病毒感染中提供保护或促进病理。

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图2

在缺乏保护性抗病毒抗体的情况下，肺组织中的CTL具有抵抗低病毒攻击的保护作用，但在高病毒剂量下会加剧疾病。F5–RAG-1层^−/−(实心圆)或RAG-1^−/−(开放的圆圈)小鼠感染A/NT/60/68(左边)或X31(正确的)甲型流感病毒。10–15只小鼠的存活率显示。该病毒经鼻内注射，剂量为(A类) 10⁷, (B类) 10⁶, (C类) 10⁵, (D类) 10⁴，或(电子) 10²PFU。F5–RAG-1的存活率显著高于^−/−感染10只小鼠⁷(P（P）<0.0001（通过Wilcoxon测试）或10⁵PFU（功率因数校正装置）(P（P）<0.0001）的A/NT/60/68比对照组感染的RAG-1^−/−老鼠(A类和B类,左边). 无显著差异(P（P）>0.09）在感染X31的相同品系小鼠之间观察到(A类和B类,正确的).

对流感病毒或致命病毒病理学的防护与CTL控制病毒感染的成败有关。

对流感病毒（通常对小鼠致命）的敏感性与进行性肺部病毒感染密切相关。因此，与F5–RAG-1的比较研究^−/−和RAG-1^−/−对受感染的小鼠进行试验，关联存活率（图。​（图2）2)肺部有病毒滴度（图。​（图3）。三). 通过测量最大病毒滴度和病毒清除率（图。​（图3，三,A–D). 保护（增加存活率；见图。​图2）2)抗流感病毒与较低的最高水平和病毒滴度的快速下降相关。因此，F5–RAG-1^−/−感染A/NT/60/68的小鼠只有在控制病毒复制的情况下才能得到保护（图。​（图3，三,C类和D类,左边). 相反，在感染后死亡的小鼠中可以看到高病毒肺滴度（对比图。​图22 A类和​和3三 A类). 10⁴鼻腔注射A/NT/60/68的PFU为临界剂量；大约四分之一的感染小鼠未能清除病毒并死亡，而其余的小鼠清除了病毒并得到保护（比较图。​图22 C类和​和3三 B类). 本节中的实验表明，CTL通过阻断原位病毒复制而对流感提供保护。他们未能控制病毒感染与致命疾病密切相关。

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图3

如果CTL能够在病毒感染开始时控制病毒在肺组织中的复制，那么它们可以对致命流感起到保护作用。F5–RAG-1肺组织中的病毒滴度^−/−(实心圆)或RAG-1^−/−(开放的圆圈)感染A/NT/60/68的小鼠(左边)或X31(正确的)甲型流感病毒表达为三到五只小鼠每克肺的平均log10 TCID50。小鼠经鼻感染的剂量为(A类) 10⁷, (B类) 10⁵, (C类) 10^三，或(D类)10 PFU。

低与高病毒挑战条件下肺组织中转基因CTL的特征。

BAL从F5–RAG-1中恢复炎症细胞的表型和功能状态^−/−或RAG-1^−/−对小鼠进行了检查（图。​（图4）。4). 在所有测试条件下，原发性炎症反应相似，主要由巨噬细胞/单核细胞组成（F4/80和Mac-1a抗原阳性；数据未显示）。BAL回收的细胞总数（图。​（图4，4,打开的符号)迅速增加（第2-5天），在第4-8天达到峰值，最大值与感染剂量相关。然而，转基因CTL（Vβ11⁺CD8（CD8）⁺; 图。​图4，4,填充符号)仅在F5–RAG-1中发现^−/−感染A/NT/60/68的小鼠（图。​（图4，4,A–C). 转基因CTL在肺部的出现动力学表明，转基因CTL早在感染10⁷PFU（第2天）比10天⁴或10²PFU（第3-5天）。这一差异在两个进一步的实验中得到了证实（我们未发表的观察结果）。与原始转基因CTL相比，感染不同剂量A/NT/60/68的小鼠肺部在第2-16天分离出的转基因CTL经流式细胞术分析后呈爆炸状，显示了活化状态（IL-2R和CD44抗原上调，L-选择素下调）（数据未显示）。正如预期的那样，CTL能够有效地裂解载有相关病毒肽（A/NT/60/68 NP-366-374）的靶细胞。因此，通过BAL从两只小鼠获得的细胞被合并，并直接在EL-4（H-2）上进行分析^b条)在细胞毒性试验中负载肽的靶细胞，以及在最高转基因CTL与靶细胞比率下计算特异性溶解百分比。F5–RAG-1的裂解活性^−/−感染10只小鼠⁷与感染10只的动物相比，A/NT/60/68的PFU分别为15%（第4天，比率2:1）、30%（第5天，比率12:1）和50%（第8天，比率25:1）²PFU表现为10%（第5天，比率4:1）、25%（第8天，比率12:1）和60%（第12天，比率25:1）。在最高E/T比率下，在卸载的靶细胞上测试的相同效应细胞显示出细胞毒性<2%。此外，来自对照F5–RAG-1的BAL中的裂解活性^−/−感染X31或RAG-1的小鼠^−/−感染A/NT/60/68的小鼠未被检测到（<2%）。因此，死于致命流感小鼠肺部的转基因CTL具有功能活性。控制F5–RAG-1^−/−感染X31或RAG-1的小鼠^−/−感染A/NT/60/68或X31的小鼠出现进行性肺部炎症，但未检测到转基因CTL（图。​（图44 D类和数据未显示）。最后，由于转基因CTL在肺部出现与病毒性疾病致死结果之间的时间间隔很短（2–4天），因此感染小鼠中的转基因CTL逃逸变异体不太可能对这些结果负责(44,45). 同样，我们的发现与无能不相容(46–49)或转基因CTL的克隆缺失(50,51)F5–RAG-1功能丧失的可能机制^−/−小鼠用相对高剂量的a/NT/60/68控制感染。

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图4

甲型流感病毒感染小鼠BAL中总炎症细胞与转基因CTL的动力学。F5–RAG-1^−/−小鼠经鼻感染(A类) 10⁷, (B类) 10⁴，或(C类) 10²A/NT/60/68的PFU，或带有(D类) 10⁷对照X31病毒PFU(正方形). 此外(D类)RAG-1号机组^−/−感染10只小鼠⁷A/NT/60/68的PFU作为对照(三角形). BAL中炎症细胞的数量(打开的符号)表示为三到五只小鼠每肺的平均值±SEM log10。BAL样本（每个肺的总体积为1 ml）含有<10⁴每毫升细胞数（我们的血细胞计数检测极限）估计为10⁴每个肺的细胞数。Tg-CTL(填充符号)用Vβ11、CD8特异性抗体对细胞进行染色，并用流式细胞仪进行分析。Tg-CTL的绝对数量通过流式细胞术乘以总细胞数计算为转基因阳性细胞的百分比。<1%的人群被认为无法检测到。

体内CTL活性的形态学表现。

BAL获得的细胞特征可能不能完全反映整个肺部炎症过程。因此，对对照组（未感染）或病毒感染小鼠的肺组织进行组织学分析（表​（表1）。1). 苏木精和伊红染色的肺石蜡切片显示F5–RAG-1的一般肺病理过程^−/−感染A/NT/60/68的小鼠部分受到肺部病毒传播速度的影响，但在很大程度上取决于抗病毒CTL（图。​（图5）。5). 事实上，限制性病毒感染小鼠肺部的Tg-CTL（即10²PFU i.n.）缓解了疾病的严重性（图。​（图55 A类). 肺部病理仅限于少数单核细胞（巨噬细胞/单核细胞）的血管周围和支气管周围炎症灶，其中包含大量白细胞/淋巴母细胞。虽然炎症持续超过2周，且程度逐渐下降，但上皮坏死和受影响的气管支气管粘膜脱皮的证据较少。相反，进行性病毒感染小鼠肺中Tg-CTL的活性（即10⁷PFU i.n.）对宿主有有害影响（图。​（图55 B类). 由于广泛的炎症和水肿，肺组织的整个结构在几天内发生了深刻的改变，肺泡间隔增厚，肺泡消失，但出血的证据较少。对照组RAG-1的病理过程^−/−小鼠（10⁷A/NT/60/68）的PFU发展较慢；在感染的第一周，肺组织病理改变的证据较少，原发性炎症反应仅限于少数浸润细胞灶。然而，在感染过程中，动物出现了致命病毒性肺炎的特征（肺组织水肿、充血和肺泡塌陷；数据未显示）。F5–RAG-1的肺组织^−/−感染X31（10⁷PFU；图。​图55 C类)显示F5–RAG-1所描述的进行性致命性肺炎的特征^−/−感染10只小鼠⁷A/NT/60/68的PFU。未感染F5–RAG-1的肺组织^−/−小鼠通气良好，没有浸润或病理改变的迹象（图。​（图55 D类). 总之，这些结果证实了我们最初的观察结果，即由于流感病毒的大量感染，抗病毒CTL对肺部病理学的贡献。

表1

TCR转基因小鼠感染甲型流感病毒后肺部炎症过程的程度

老鼠		病毒		感染后时间
				第2天		第5天		第8天		第15天		第20天
F5–RAG-1层−/−		A/NT/60/68，107PFU（功率因数校正装置）		+		++		++		*
		A/NT/60/68，102PFU（功率因数校正装置）		−		+		+		±		±
		X31、107PFU（功率因数校正装置）		+		++		++		*
RAG-1号机组−/−		A/NT/60/68，107PFU（功率因数校正装置）		±		+		++		++		++
		X31、107PFU（功率因数校正装置）		+		++		++		*

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++，严重的病理学表现为包括多个肺组织部分的细胞炎症。出现广泛的肺水肿和充血。肺泡间隔增厚和肺泡丢失，炎症反应包括中、小气道上的一些支气管周围和血管周围浸润灶。有少量证据表明受影响的气管支气管粘膜上皮坏死。±，肺组织有少量浸润。无上皮坏死或脱皮，肺组织通气良好。肺组织无浸润或病理改变。 

^*，在指定时间，所有小鼠均已死亡。 

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图5

肺组织的组织学检查。第6天或第8天从F5–RAG-1取肺^−/−转基因小鼠感染(A类) 10²A/NT/60/68的PFU(B类) 10⁷A/NT/60/68的PFU，或(C类) 10⁷X31甲型流感病毒的PFU。(D类)对照组未感染F5–RAG-1的肺组织^−/−鼠标。

体内给予抗IFN-γ单克隆抗体对抗病毒CD8介导致死性和亚致死性流感的影响⁺CTL公司

进一步明确病毒特异性CD8的机制⁺检测T细胞介导的炎症清除或增强，以及肠外注射抗IFN-γ的效果。尽管所有F5-RAG小鼠都感染了高剂量的a/NT/60/68（10⁷PFU）在第2天和第6天死亡，在整个实验过程中，当感染动物用抗IFN-γ单克隆抗体治疗时，观察到死亡时间延迟，存活率增加（～50%）（图。​（图66 A类). 令人惊讶的是，经过治疗的动物在第8天时完全清除了肺实质中的病毒（图。​（图66 C类). 相反，对照组未经治疗的感染小鼠无法消除病毒；然而，在第6天检测到病毒肺滴度显著降低，并一直保持到小鼠感染致死（图。​（图66 C类)表明抗病毒CD8⁺T细胞在控制感染方面仅部分有效。用抗IFN-γ单克隆抗体治疗小鼠对肺实质中效应物Tg-CTL反应的动力学或大小没有影响（图。​（图66 电子). 在抗干扰素-γ治疗小鼠和对照小鼠的BAL中发现相同的炎症细胞总数（图。​（图66 G公司). 然而，肺组织的组织学分析显示，与对照病毒感染小鼠相比，感染早期肺炎的炎症模式受限，病理特征显著降低，抗IFN-γ单克隆抗体治疗后，肺炎的数量逐渐下降（数据未显示）。给小鼠服用亚致死剂量10²流感病毒的PFU、IFN-γ的阻断对致死率、肺病毒的清除或肺实质Tg-CTL反应的动力学和大小几乎没有影响（图。​（图6，6,B类,D类,F类、和H（H）).

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图6

注射抗IFN-γ对流感病毒感染F5-RAG-1患者死亡率、肺病毒清除率、Tg-CTL数量与BAL中总细胞计数的影响^−/−老鼠。F5–RAG-1^−/−小鼠经鼻感染致死剂量为10⁷全氟辛烷磺酸(左边)或亚致死剂量10²PFU（功率因数校正装置）(正确的)第A/NT/60/68号文件。用抗IFN-γ单克隆抗体治疗小鼠(实心圆)如材料和方法中所述，或以PBS为控制(开放的圆圈). (A类和B类)显示了5-10只小鼠的存活率。(C类和D类)肺组织中的病毒滴度表示为三到五只小鼠每克肺的平均log10 TCID50。(电子和F类)用Vβ11、CD8特异性抗体对细胞进行染色，并用流式细胞仪进行分析，在同一样品中检测到Tg-CTL，并用三只小鼠每肺的平均值±SEM log10表示。(G公司和H（H）)BAL中炎性细胞的数量表示为三只小鼠每个肺的平均±SEM log10。

讨论

许多研究已经证明CD8的主要作用⁺CTL控制病毒感染。然而，很难在感染组织中原位跟踪特异性CTL反应的发展。在这里，我们报告了一种创新的方法，使用流感病毒（F5）特异性转基因TCR小鼠和CD4缺陷小鼠⁺和B细胞（F5–RAG-1^−/−)，允许监视特定CD8⁺CTL直接原位反应。这一强大的工具为研究病毒特异性CTL在肺组织中的体内命运、效应器功能和相互作用提供了独特的机会。

本文报道的结果阐明了宿主CTL增强对流感病毒防御的一些基本原理。首先，定位于病毒感染部位的效应器CTL可能对受感染的宿主产生有益或有害的影响。在缺乏保护性抗体的情况下，CTL可以有效阻止病毒复制，从而对流感病毒提供保护，也可以显著促进致命疾病的发生和发展。CTL介导的效应与持续肺部病毒感染的程度有关，因此肺组织中CTL出现的时间似乎是最关键的因素。在流感病毒感染期间，CTL介导的对抗作用（保护作用与致命病理作用）的这个引人注目的例子增加了CTL可能加剧病毒感染疾病的报道(52–56). 其次，流感病理学的主要驱动力是病毒。因此，病毒在肺部的无限制传播会导致致命的肺部疾病。这项研究的结果不支持这种理论，即肺部病理学是由于病毒的固有细胞病变作用。然而，数据也不表明该病毒是“无辜的旁观者”。相反，病毒在肺部的复制伴随着炎症过程，这可能是由受感染细胞释放的趋化因子启动的。然后，这些趋化因子将炎症细胞吸引到感染部位。第三，我们的研究表明了流感病毒CTL反应发展的动态过程(57). 一些证据表明，如果在感染发生之前或之后很早肺部出现效应CTL，那么疾病进程就会迅速终止(8,58–62). 我们的结果表明，通过旨在增加抗病毒CTL前体的频率的疫苗接种策略，很难实现这种情况。为了支持这一观点，研究发现，未经修饰的CTL和经过修饰的CTLs都需要4-5天才能成为有效的CTL效应器(7,58,63). 因此，CTL的保护能力受限于其效应器活性和肺部病毒载量之间的微妙平衡。识别流感亚型表面蛋白微小变化的保护性抗体可能通过减缓病毒复制（从而减少病毒载量）来改变这种平衡，从而使CTL能够快速终止肺部的病毒复制。这可能为为什么CTL不能预防流感疫情提供了一个简单的解释，但另一方面似乎对临床疾病提供了有限的保护(8,64).

多种机制可能有助于抗流感CTL所显示的保护和致病作用。区分可溶性因子和细胞因子的作用以及CTL本身可能存在的质量差异很重要。这些信息对于更好地理解病毒的发病机制以及对流感和其他呼吸道病毒感染的治疗干预采取更合理的方法至关重要。CD8（CD8）⁺T细胞已被证明通过直接裂解受感染的宿主细胞或通过释放诱导抗病毒作用的细胞因子来调节体内抗病毒作用(65,66). 这些CD8的最终影响⁺T细胞介导的效应器机制在消除甲型流感病毒感染和从感染中恢复以及对肺部疾病结局的影响方面尚不明确。

关于CD8使用的效应器机制⁺Topham等人最近利用辐射嵌合体进行的一项研究表明，通过Fas或穿孔素途径介导的靶细胞破坏可能是CD8使用的主要机制⁺清除病毒的CTL(67). 另一方面，通过靶向基因破坏或向缺乏β2-微球蛋白（后者缺乏CD8⁺T细胞）表明IFN-γ在清除流感病毒感染中的作用较小(39,68). 然而，这些数据并不排除流感免疫反应中可能存在某些生物冗余的可能性，以及其他效应机制（例如抗体）可能影响迅速解决感染所需的IFN-γ的程度。F5–RAG-1的使用^−/−mice提供了一个更直接地解决这个问题的机会。本文报告的结果与上述发现一致，并对其进行了扩展。虽然干扰素-γ似乎对CD8不重要⁺T细胞介导的亚致死性流感病毒感染的恢复，这项研究清楚地表明，它对致命感染的结果有显著影响。因此，F5–RAG-1的治疗^−/−在亚致死性或致死性流感感染期间使用抗IFN-γ单克隆抗体的小鼠对肺部效应CTL反应的动力学或大小没有影响。然而，激活的Tg-CTL高水平分泌的IFN-γ似乎确实有助于F5–RAG-1感染后的死亡率^−/−携带致命剂量病毒的小鼠。这种效应最可能的解释是Tg-CTL在接触感染的MHCⅠ类阳性细胞时释放IFN-γ。这导致血管通透性增加(69)并促进大量肺水肿和白细胞向肺实质迁移和/或滞留。早期的观察结果支持了这一假设，表明IFN-γ也可能作为一种典型的炎症细胞因子，它影响肺实质中发现的细胞数量的总体增加，但对CD8的优先积累没有影响⁺T细胞或其细胞溶解效应功能(70). 尽管BAL中炎性细胞的数量与对照组未经治疗的小鼠相比没有差异，但我们发现抗干扰素-γ治疗小鼠的病毒病理学降低，这加强了这一概念。因此，在病毒感染开始时中和IFN-γ可以改善病程，使Tg-CTL从肺部清除病毒。也可以想象，IFN-γ作为免疫调节剂可以增加病毒感染细胞上MHC I类的表达，从而促进基于细胞破坏性Tg-CTL效应的病理学。用CTL细胞溶解途径（穿孔素或Fas抗原）缺陷的小鼠进行实验可以直接解决这个问题。

总之，我们的数据表明，在感染早期抑制病毒复制是预防流感病毒疾病的最重要特征。创造基于CTL的疫苗的挑战(71–77)针对异亚型流感病毒株，是在感染早期提高CTL前体细胞的丰度，以增加保护性反应，而不会加剧同样依赖CTL的病理学。最后，评估CTL免疫反应和病毒感染之间建立的动态平衡显然是更好地了解流感发病机制的先决条件，因为不适当的CTL激活会加剧病理过程(55,78,79).

致谢

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