《实验医学杂志》。1998年6月15日；187（12）：1941年至1951年。
肺上皮细胞是小鼠γ-疱疹病毒持续存在的主要场所
来自英国爱丁堡EH9 1QH爱丁堡大学兽医病理学系
地址：James P.Stewart，英国爱丁堡EH9 1QH夏霍尔爱丁堡大学兽医病理学系。电话：44-131-650-6160；传真：44-131-650-6511；电子邮件：ku.ca.de@trawets.semaj
收稿日期：1998年1月20日；1998年3月20日修订
摘要
目前认为潜伏感染的静止B淋巴细胞是γ-疱疹病毒持续存在的关键，而粘膜上皮细胞被认为是非必要的。我们使用小鼠γ-疱疹病毒68（MHV-68）重新研究了非淋巴样持续性问题。为了从非淋巴样持久性中分离淋巴样细胞，我们使用了B细胞缺陷的μMT转基因小鼠。MHV-68 DNA存在于完整和B细胞缺陷小鼠的肺部。病毒基因组的上体和线性形式都存在于肺部，这意味着存在潜伏期和生产性复制。病毒tRNA转录物的原位杂交显示肺上皮细胞中潜伏着MHV-68。在T细胞耗竭后，从μMT小鼠的肺中回收了感染性病毒，表明持续存在的病毒DNA是可重新激活的。最后，通过将B细胞过继转移到B细胞缺陷小鼠中，结果表明，肺部的病毒接种脾B细胞，而脾脏的病毒接种肺。这些结果表明，粘膜上皮可以作为γ-疱疹病毒持续存在的非淋巴样贮存器，并且在病毒持续存在期间，病毒在淋巴样和非淋巴液间存在双向运动。
关键词：γ-疱疹病毒，潜伏期，EB病毒，上皮，肺
γ-疱疹病毒在医学和兽医领域都具有临床相关性。在人类中，EBV与传染性单核细胞增多症、B淋巴瘤和鼻咽癌有关(1). 同样，卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）1也被称为人类疱疹病毒8型，与B淋巴瘤及其名称来源的病变有关(2). 在兽医领域，有一组密切相关的病毒，包括绵羊疱疹病毒2型和阿尔克拉芬疱疹病毒1型，它们与家畜致命的淋巴增生综合征有关，称为恶性卡他热(三).
所有革兰病毒的特征都是能够潜伏在淋巴细胞中。这些病毒也会感染上皮细胞，尤其是呼吸道上皮细胞，并在宿主之间传播(1). 迄今为止，只有EBV解决了γ-疱疹病毒在宿主中的持续存在模式。仅描述了上皮粘膜部位的生产性感染，而非潜伏性感染，因此，这些部位被认为对病毒的持续性不重要(4–6). 事实上，根据现有证据，潜伏感染的静止B淋巴细胞池是EBV持续存在的核心和基本特征，咽上皮细胞偶尔会从这些细胞再次感染(6–10). 然而，对大多数革兰病毒，特别是感染人类的革兰病毒的发病机制的研究是困难的。因此，我们正在使用小鼠γ疱疹病毒68（MHV-68）重新研究持久性和潜伏性的可变位点的问题。
MHV-68将通过鼻内接种感染实验室小鼠，然后在肺泡上皮细胞中建立生产性感染(11). 病毒随后传播到脾脏，在那里B淋巴细胞中建立了潜伏感染(12). 肺部的急性病毒复制在感染后7–10天（p.i.）后消失，超过该时间后，通过生物方法（即直接菌斑试验或再活化试验）在该器官中找不到感染证据。相反，潜伏病毒可以在动物一生中从脾脏B细胞重新激活。据推断，与EBV一样，B淋巴室是MHV-68持续和潜伏期的主要部位(12). 然而，我们最近对成熟B细胞转基因缺陷的μMT小鼠的研究对这一假设提出了质疑(13). MHV-68对这些小鼠肺部的感染遵循正常的过程，但感染病毒的清除从每次10–17天延迟。通过重新激活试验或敏感的巢式PCR试验，我们都没有发现脾或血源性感染或其他器官感染的证据。相反，使用相同的PCR检测，我们能够显示MHV-68 DNA在肺部的长期存在。这表明，尽管B细胞显然是潜伏期和持续性的主要部位，但它对病毒的持续性并不重要，这可能发生在粘膜部位，在本例中是肺。本研究的目的是进一步研究MHV-68在感染小鼠肺部的长期持续存在，并研究脾脏B细胞和肺部上皮细胞之间持续存在期间的病毒运输。
材料和方法
细胞系和病毒。
如前所述，使用BHK-21细胞进行斑块试验，对MHV-68菌株g2.4进行增殖和定量(11). B淋巴细胞肿瘤细胞系S11（MHV-68阳性）和S31（MHV 68阴性）是在本实验室获得的，并按照Usherwood等人的描述进行生长(14).
老鼠。
本研究中使用的小鼠为μMT/μMT(15)在C57/BL6背景上。它们在μ免疫球蛋白链中有靶向性损伤，导致IgM表达失败；因此，B细胞发育在前B细胞阶段被阻止。爱丁堡大学兽医病理学系从这些小鼠中建立了一个群体。C57/BL6小鼠来自英国赫尔市的Bantin and Kingman Ltd。雄性和雌性小鼠在4-11周龄时经鼻感染4×105氟烷麻醉下的PFU MHV-68。
DNA PCR分析。
使用Qiamp组织试剂盒（QIAGEN Inc.，Chatsworth，CA）从细胞和组织中提取MHV-68 DNA。使用DNA荧光仪（DyNA Quant 200；法玛西亚生物技术公司瑞典乌普萨拉）。如前所述，使用gp150基因特异性引物对100 ng高分子量DNA进行巢式PCR扩增(13). 将引物对PAG1加PAG2（外部）用于最初的40个周期，将引物配对PAG11和PAG12用于随后的25个周期，使用10μl的第一次扩增产物。在含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶上分析产物。
使用已知数量的克隆模板，确定该过程可以在100 ng高分子量DNA中检测到病毒基因组的一个拷贝。
定量竞争PCR。
这基本上是按照Gilliland等人的描述进行的(16)还有Siebert和Larrick(17). 定量竞争（QC）PCR检测基于上述gp150特异性检测。使用引物PAG1和PAG2的gp150特异性PCR模板不包含限制性内切酶BamHI的位点。制作了一个含有内部BamHI限制性内切酶位点的突变竞争模板，用于QC-PCR。使用含有gp150基因的DNA作为模板进行两次单独的PCR。第一个使用了外部引物PAG1（有义；见上文）和引物MUT1，5′-CAG GAA GAG GAT CCA ACT ATG ACT C（反义），该引物对gp150基因下游约200 bp的序列具有特异性，但该序列突变为BamHI位点。第二种使用引物MUT2（MUT1的反向补体）和外部引物PAG2（反义）。从这些PCR中生成了两个长度约为200和300 bp的反应产物，代表gp150模板的上游和下游部分。PAG1和MUT1产物的3′25 bp与MUT2和PAG2产物的5′25 bp重叠。因此，当将部分产物（10μl）与引物PAG1和PAG2混合并通过PCR扩增时，这导致产生包含内部BamHI位点的501-bp突变gp150模板。当用BamHI切割时，该模板形成大小为～200 bp和300 bp的片段。使用标准分子克隆技术将该突变竞争模板插入载体pKS（−）（Stratagene Inc.，La Jolla，CA）。
在100 ng高分子量DNA上准确定量样品中存在的MHV-68 DNA的拷贝数。使用引物PAG1和PAG2对每个样本进行一系列PCR，每个引物都含有相同数量的高分子量DNA，但添加了一系列稀释的规定数量的突变竞争模板。然后像以前一样使用引物PAG11和PAG12进行巢式PCR，但PAG12已用IRD-41标记。用BamHI切割反应产物，并使用检测IRD-41标记DNA的测序机（LI-COR Inc.，Lincoln，NE）评估标记野生型（501 bp）和竞争型（300 bp）产物的数量。使用克隆的野生型DNA构建标准曲线，并将日志（[竞争对手产品]/[野生型产品]）与日志[竞争对手]关联。这是一条斜率为1的直线。然后，通过用高分子量测试DNA替换克隆的野生型DNA，并计算[竞争产品]等于[野生型产品]或对数（[竞争产品]/[野生型产物]）等于零的点，来确定每个样品中的确切DNA量。
原位-Lysis Gardella凝胶和PCR。
Gardella凝胶电泳和PCR分析按照前面描述的水平格式进行(7)进行了以下修改。凝胶切片在65°C下熔化，5μl直接通过PCR分析MHV-68。将MHV-68 gp150的单轮（非嵌套）PCR与引物PAG1和PAG2（见上文）一起使用30–40个周期。
肺分离为单细胞悬液。
在取出肺之前，用30毫升PBS通过右心室对肺进行灌注。取出肺并置于冰镇培养基中。大气道连同肺相关淋巴组织和结缔组织一起被切除。然后将剩余的组织切成约1–2 mm的碎片三然后将切好的肺与150U/ml胶原酶/分散酶的溶液一起孵育(西格玛化学公司。密苏里州圣路易斯）和50 U/ml DNase I(西格玛化学公司。)在含有10%FCS的RPMI 1640培养基中，37°C下培养2小时，然后通过23号针头分离。然后用10 ml培养基将悬浮液冲洗两次，并用台盼蓝染色进行评估。介于2到5×10之间7每只小鼠获得活细胞。
体内T细胞耗竭。
使用大鼠单克隆抗体YTS 191.1（抗CD4）和YTS 169.4（抗CD8）去除T细胞亚群。小鼠尾静脉注射0.1 ml抗体，浓度为10 mg/ml，2天后再次注射。随后，在最初注射后的7天和11天，对小鼠进行相同剂量的腹腔注射。
细胞荧光测定法。
用单克隆抗体对细胞进行染色，并使用FACScan进行分析®(贝克顿·迪金森，加利福尼亚州圣何塞），如前所述(13). 抗CD4和抗CD8抗体来自杂交瘤YTS 191.1和YTS 169.4，抗B220（CD45R）购自法尔敏根（加利福尼亚州圣地亚哥）。
T缺失脾细胞的过继移植。
首先通过挑逗从脾脏中去除脾细胞，然后用水溶解红细胞。然后用100μg/ml的抗CD4（YTS 191.1）和抗CD8（YTS 169.4）以及1:4稀释的兔补体培养细胞（加拿大安大略省霍恩比市Lowtox-H；Cedarlane Labs.Ltd.）。在37°C下培养1小时后，清洗细胞，并将其5×107每只小鼠腹腔注射200μl PBS中的细胞。
原位杂交。
在福尔马林固定石蜡包埋切片上进行放射性和非放射性原位杂交，基本上如前所述(18). MHV-68 tRNA分子1-4的正反义标记转录物分别使用T3或T7聚合酶从质粒pEH 1.4（英国剑桥大学S.Efstathiou博士的礼物[19]）中制备。同样，使用pKS（−）中包含的基因（Stratagene Inc.）制作MHV-68胸苷激酶基因的标记转录本(20). 在同一切片上检测tRNA和细胞角蛋白如下。对切片进行原位杂交预处理，包括在柠檬酸盐缓冲液中进行微波处理，如Sibony等人所述(21). 用地高辛标记的tRNA探针进行杂交，用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/硝基蓝四唑（BCIP/NBT）底物制备载玻片(西格玛化学公司。)如前所述(18). 然后根据制造商的说明，将切片与抗细胞角蛋白/HRP（MNF116-EPOS，U7022；Dakopatts A/S，Copenhagen，Denmark）反应，并最终使用3,3′-二氨基联苯胺四氢氯化物（DAB）底物进行开发(西格玛化学公司。).
结果
MHV-68持续存在于完整小鼠的肺部。
我们之前使用PCR分析的结果表明，在脾脏或其他器官没有感染的情况下，经鼻途径感染后，MHV-68可以在B细胞缺乏的μMT小鼠的肺部持续存在(13). 为了证实肺部持续感染不仅仅是μMT小鼠的一种异常，我们分析了12个月前感染MHV-68的完整小鼠。我们想区分仅通过肺部血液供应的B淋巴细胞中MHV-68产生的阳性信号和来自肺组织的阳性信号。因此，我们在取出前用PBS广泛灌注肺部，并从五只小鼠的血液、骨髓和肝脏以及肺和脾脏中提取高分子量DNA。然后通过巢式PCR分析DNA中是否存在MHV-68基因组(13). 该检测对MHV-68 pg150基因具有特异性，对每100 ng DNA中1个基因组拷贝敏感。结果如图所示。如预期，在所有五只小鼠的肺部和脾脏中都发现了MHV-68 DNA。然而，没有一只小鼠的肝脏或肾脏中有MHV-68。两只小鼠（2和3）的血液和骨髓中有MHV-68 DNA的证据。因此，在小鼠2和3的情况下，肺组织中的阳性信号可能是由于MHV-68在血液中的运输。其他三只小鼠不太可能出现这种情况，因为它们的血液或肝脏和肾脏中都没有检测到MHV-68 DNA。该数据表明，MHV-68存在于完整小鼠的肺部和脾脏中，并且表明我们最初对μMT小鼠的观察不是由于B细胞缺陷系统的伪影。
PCR检测C57/BL6小鼠中的MHV-68。从5只经鼻感染MHV-68 12个月的C57/BL6小鼠的器官中提取DNA，并用gp150基因特异性巢式PCR分析是否存在MHV-68 DNA。在含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶上分析产品，并使用紫外线透射仪进行可视化。为了清晰起见，图像以颠倒的颜色显示。相对1-kb DNA阶梯进行分子量测定(先生)，并且以bp为单位的相关条带的大小显示在左侧。在所有小组中，使用来自MHV-68阳性肿瘤细胞系S11的DNA作为阳性对照(+价值工程)并产生了368bp的预期产物。来自MHV-68阴性肿瘤细胞系S31（−价值工程)与去离子水一起使用(H（H）2哦)作为阴性对照。(A类)肺部分析结果(肺1-5)、脾脏(SPL 1–5)和骨髓(BM 1–5)所有五只老鼠。(B类)血液分析(血液1-5)所有五只老鼠。(C类)肝脏分析(LIV 1–5号机组)和肾脏(儿童1-5)所有五只老鼠。
为了确定肺、脾和骨髓中MHV-68 DNA水平之间是否存在任何关系，我们通过QC-PCR测量了每个器官中病毒DNA的确切数量。该试验按照材料和方法中的描述进行，对每100 ng DNA中的1个基因组拷贝敏感。对图中使用的相同五个DNA样本进行此分析的结果。如图所示。肺中的MHV-68 DNA水平表现出最大的变异性，从1到1000拷贝/100 ng，而脾脏中的水平更为一致（12到300拷贝/100 ng.）。骨髓中检测到的病毒DNA水平要低得多（1-10拷贝/100纳克）。肺部和脾脏中的病毒DNA水平之间没有直接关系。在两只小鼠中，脾脏中的水平高于肺部，在另外两只小鼠中情况正好相反，并且一只小鼠在两者中的水平相同。相反，脾脏中病毒DNA的水平与骨髓中的水平直接相关。这表明在完整的C57/BL6小鼠中，肺和脾可能是MHV-68持续存在的独立部位。骨髓中病毒的存在和水平似乎与脾脏中病毒的数量直接相关，这表明骨髓可能不是病毒持续存在的独立场所，而是依赖血液中的贩运细胞和/或脾脏中的种子。这也可能表明，在接种其他器官方面，完整小鼠的脾脏持久性发挥着更重要的作用。
QC-PCR测定器官中MHV-68 DNA载量。肺、脾和骨髓中MHV-68 DNA的精确拷贝数(BM公司)在与图中相同的样品中。通过QC-PCR测定。结果显示在散点图上，即每只小鼠每个器官每100 ng高分子量DNA的拷贝数。鼠标1(♦); 鼠标2(▪); 鼠标3（▴）；鼠标4（X）；和鼠标5（•）。
在肺部持续存在期间，MHV-68 DNA的染色体和线性形式都存在。
使用Gardella凝胶分析通过分子方法确定MHV-68在肺部的持续状态。这项技术能够区分线性基因组和上位基因组。使用这项技术，已经表明潜在感染细胞包含的基因组是共价闭合的圆形（外体）构象。相比之下，尽管在有生产力的复制细胞中可能存在多种形式的基因组，但对这些细胞的Gardella凝胶分析只揭示了线性构象的基因组(7,14,22). 在对照实验中，我们对之前描述的Gardella凝胶进行了Southern分析(14). 我们使用的是S11B淋巴细胞系，已知该淋巴细胞系同时含有潜在和产生型MHV-68。已知其中大约5%的细胞在任何时候都在进行生产性复制，而其余的细胞则处于潜伏状态(14). 我们还使用了急性感染的小鼠上皮细胞（C127）。结果如图所示。.A类清楚地显示了S11细胞中MHV-68基因组的线性和环形分辨率，而B类显示在急性感染的上皮细胞中只存在线性形式的基因组。
Gardella凝胶分析对照细胞中MHV-68 DNA构象。使用Gardella（原位溶解）凝胶分离完整细胞中的DNA。A类和B类显示Gardella凝胶的Southern blot分析。凝胶显示为侧面，以与C类和天，并指示凝胶顶部(顶部).A类显示了使用MHV-68阳性B细胞系S11的结果，该细胞系已知同时含有上位体和线性DNA。B类显示了使用C127（小鼠上皮细胞）的结果，该细胞在24小时前曾被10 PFU/cell MHV-68急性感染。C类和天显示Gardella凝胶切片的结果，并通过PCR分析每个切片是否存在MHV-68 DNA。因此，每个面板代表Gardella凝胶的一条通道，顶部显示在第一个连续切片的旁边。在含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶上分析PCR产物，并使用紫外线透照器进行可视化。为了清晰起见，图像以颠倒的颜色显示。使用来自MHV-68阳性肿瘤细胞株S11的DNA作为阳性对照（+），并产生368 bp的预期产物。来自MHV-68阴性肿瘤细胞系S31（−）的DNA用作阴性对照。C类显示了使用S11细胞的结果A类、和天显示了用病毒DNA复制抑制剂4′-S-EtdU处理S11细胞14天后的结果。显示了环状和线形MHV-68 DNA的位置(顶部).
为了获得在肺部持续存在期间检测MHV-68所需的灵敏度，我们需要使用基于PCR的改良Gardella凝胶技术，该技术已成功用于在体内检测潜在EBV和KSHV基因组(7,22). 不是通过Southern印迹分析Gardella凝胶，而是在电泳后，将凝胶的各个通道切除并依次切割成薄片。然后通过PCR分析每个切片是否存在MHV-68 DNA。因此，PCR凝胶的每个泳道代表Gardella凝胶泳道的一个连续切片。同样在对照实验中，我们使用S11细胞。该品系未经治疗或经抗病毒药物2′-脱氧-5-乙基-β-4′-硫代尿苷（4′-S-EtdU）治疗14天后使用(23). 这种药物被认为作用类似阿昔洛韦，被病毒胸苷激酶磷酸化，并通过链终止抑制DNA合成。通过这种方式，已知可以抑制MHV-68的高效复制，但不影响潜伏期。图中显示了传统Southern杂交的结果。.C类显示未处理S11细胞的分析。如中所示A类，可以清楚地看到该面板中基因组的上位和线性形式的分辨率。用4′-S-EtdU处理S11细胞后(天)，基因组的线性形式不存在，这表示药物预计会阻断DNA复制并清除细胞中的线性DNA。因此，Gardella-PCR系统能够区分控制细胞中的外显体基因组和线性基因组。
接下来我们分析了来自小鼠肺部的细胞。我们在这些实验中主要使用μMT小鼠，因为肺部是这些小鼠的持久性部位，并且没有可检测到的病毒血源。使用完整的C57/BL6小鼠作为对照。在感染持续期从小鼠身上取下肺：μMT小鼠为2个月，C57/BL6小鼠为7个月。选用小鼠进行疱疹病毒DNA复制抑制剂4′-S-EtdU治疗。在取样前，受试小鼠在饮用水中连续28天服用1 mg/只小鼠/d的药物。已知该浓度的药物可完全抑制体内产生的MHV-68 DNA合成和复制。μMT和C57/BL6小鼠的肺部通过右心室灌注，以最大限度地减少血液供应中淋巴细胞的污染，然后分解为单个细胞悬浮液。然后将来自肺部的细胞加载到Gardella凝胶的孔中，该凝胶通过上述PCR进行分析。实验重复了两次，结果相当。结果的代表性选择如图所示。在六分之五的病例中，μMT小鼠的肺被发现含有附加型和线性基因组(A类)但在一个案例中，我们只发现了上位基因组的证据(B类). 此外，所有（四分之四）完整的C57/BL6小鼠都含有线性和上位形式的基因组(C类). 在用4′-S-EtdU治疗μMT小鼠28天后，我们发现在所有病例中（四分之四），仅存在基因组的上位体形式(天).
Gardella凝胶-PCR分析肺细胞中MHV-68 DNA构象。将完整的细胞装载到Gardella（原位裂解）凝胶的孔中。电泳后，将单个通道依次切成薄片。然后用PCR分析每条车道的切片是否存在MHV-68 DNA。PCR产物在含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶上进行分析，并使用紫外线透射仪进行可视化。为了清晰起见，图像以颠倒的颜色显示。因此，每个面板代表Gardella凝胶的一条通道，顶部显示在第一个连续切片的旁边。图中显示了代表环形和线形基因组在Gardella凝胶上位置的切片(顶部). 在所有小组中，使用来自MHV-68阳性肿瘤细胞系S11的DNA作为阳性对照（+），并产生预期的368 bp的产物。来自MHV-68阴性肿瘤细胞系S31（−）的DNA与去离子水一起使用(H（H）2哦)作为阴性对照。A类,B类、和天显示了使用μMT小鼠肺细胞（2个月p.i.）的结果，而C类显示了使用C57/BL6小鼠肺部7个月p.i.细胞的结果，并相应地进行了标记。天显示了使用μMT小鼠肺在2个月p.i.时的结果，但在感染病毒DNA复制抑制剂4′-S-EtdU后的最后28天进行治疗。
因此，MHV-68基因组的上位和线性形式都存在于大多数小鼠肺中，这表明潜伏和生产性感染细胞可能正常存在。然而，在一只μMT小鼠中仅存在上体DNA，而在其他小鼠中经过4′-S-EtdU处理（抑制病毒DNA复制）后，上体DNA也存在。这表明，MHV-68在肺部潜伏状态的持续存在可能不依赖于生产性感染细胞的存在。
感染性MHV-68可在μMT小鼠中重新激活。
我们推测，如果小鼠肺部的MHV-68 DNA代表完整的病毒，那么应该可以通过生物手段检测到它。我们之前所有在持续感染期间从小鼠肺部诱导产生感染性病毒的尝试都失败了。这些包括通过去除包括CD4在内的T细胞来进行免疫抑制+或CD8+仅T细胞和CD4细胞+和CD8+T细胞、环孢素A免疫抑制和地塞米松治疗。由于μMT小鼠没有B细胞，它们无法产生抗病毒抗体。因此，我们试图在感染持续期（即54天p.i.）从μMT小鼠和完整的C57/BL6小鼠中获得感染病毒。实验重复两次，结果相当。使用抗CD4（YTS 191.1）、抗CD8（YTS 169.4）或抗CD4和-CD8联合使用可耗尽T细胞亚群。对照组小鼠仅接受PBS。FACS公司®淋巴细胞耗竭后的分析显示相关T细胞亚群耗竭>99%。耗竭14天后，对小鼠进行取样，并测定肺部存在的病毒滴度。结果如表所示和之前的实验一样，MHV-68不能从完整的小鼠中重新激活。然而，在耗尽任一CD8后，感染性病毒从μMT小鼠中恢复+T细胞或CD4+加CD8+细胞。CD8病例中回收的病毒量很小+CD4中的T细胞耗竭，但更大，接近急性感染时的水平+加CD8+–枯竭的动物。
表1
| 治疗 | | C57/BL6肺部的病毒滴度*
| | μMT肺部的病毒滴度*
|
|---|
| |
PFU/肺
| |
PFU/肺
|
| 美国公共广播电视公司 | | <10 | | <10 |
| 抗CD4 | | <10 | | <10 |
| 抗CD8 | | <10 | | 15 |
| 抗CD4+CD8 | | <10 | | 6 × 105
|
在经鼻途径感染的μMT小鼠中，除了肺部外，我们没有发现其他MHV-68持续存在的部位。因此，上述结果表明，通过分子方法在肺部检测到的持续病毒可能没有缺陷，并且能够在没有抗病毒抗体和T细胞的情况下复制到高水平。
潜伏性MHV-68持续存在于肺上皮细胞中。
为了确定持续存在期间肺中携带MHV-68的细胞类型，我们对取自任一μMT的组织切片进行了原位杂交(n个=3）或C57/BL6(n个=3）小鼠在54 d p.i.持续期，在模拟感染μMT和C57/BL6小鼠的切片上进行对照杂交。切片最初与35S标记的核糖探针与MHV-68潜伏期表达的MHV-68 tRNA-like基因互补（反义）(19). 作为对照，相邻的序列切片用一个有意义的tRNA探针和一个与编码MHV-68胸腺嘧啶激酶和gH蛋白的mRNA杂交的探针进行杂交，这些蛋白在MHV-68感染的生产期表达(24). 结果的代表性示例如图所示。.
原位杂交法测定肺中潜伏MHV-68的细胞类型。从小鼠福尔马林固定石蜡包埋的肺组织中切下5μM厚的切片，病毒在54 d p.i.时持续存在(A–F). 对照切片来源于每天5天的小鼠(G公司和H（H）,严重的). 中显示的部分A–C和H（H）与…杂交35S标记的核糖探针，并使用照相乳剂进行显影。中显示的部分D–G型与地高辛标记的核糖探针杂交，并使用碱性磷酸酶标记的抗地高辛蛋白和NBT/BCIP组合开发(蓝色/黑色). 所用探针对潜伏相关tRNA具有特异性(A类和C–G类,tRNA)或生产周期相关的胸苷激酶(TK公司)和gH基因(B类和H（H）,TK公司+克/小时).D–G另外与抗细胞角蛋白抗体反应并使用DAB开发(棕色的,抗CK).A类和B类是一个μMT小鼠活检的相邻连续切片。所有其他面板均来自不同的μMT小鼠。A–C和H（H）苏木精和伊红复染。A类和B类, ×230;C–H型, ×580.
在模拟感染小鼠（未显示）的切片上使用控制意义tRNA探针或反义tRNA探针未发现任何反应。使用反义tRNA探针（图。,A类和C类). 这些病灶很小，每节有一到五个（平均两个）。在相邻的连续切片上使用胸腺嘧啶激酶和gH探针没有反应(B类)；然而，对照杂交显示，胸腺嘧啶激酶加gH探针能够检测急性感染期间出现的高效感染细胞(H（H）). 因此，似乎观察到的tRNA表达病灶可能是潜伏感染MHV-68的细胞。此外，活检中病灶的位置表明，这些潜在感染细胞并非集中在炎症或血管区域，而是靠近气道，可能是上皮细胞。
为了准确鉴定所涉及的细胞类型，我们使用地高辛标记的反义tRNA探针进行了第二组原位杂交。相同的切片与细胞角蛋白特异性单克隆抗体反应。采用感染急性期的阳性对照切片进行比较。在感染的生产阶段，MHV-68 tRNAs(深蓝色)在大量细胞的细胞核中表达，也表达细胞角蛋白(棕色的)因此是上皮细胞(G公司). 如图所示。
D–F型在潜伏期内，仅出现tRNA序列阳性的小细胞灶；然而，这些细胞的细胞角蛋白也呈阳性。因此，在感染持续期表达MHV-68 tRNA的肺细胞本质上是上皮细胞。
病毒潜伏期间MHV-68在肺和脾之间的运动。
我们的数据表明，肺和脾是MHV-68潜伏期和持续性的部位。我们想知道这些位点是否真正独立，或者驻留在脾脏的病毒是否能够传播到肺部，驻留在肺部的病毒是否可以传播到脾脏。
为了观察持续存在小鼠脾脏中的MHV-68是否可以传播到肺部，我们从模拟感染或感染MHV-68的C57/BL6小鼠脾脏提取了T缺失细胞。然后我们将这些细胞注入未感染的μMT小鼠。对小鼠进行预转移测试，发现没有B220+血液中的细胞。在转移后4天进行测试时，发现其B220含量介于1到18%之间+细胞，表明过继转移的细胞持续存在。11天后，通过PCR对这些小鼠的脾脏、肺和血液进行MHV-68的筛选。在取出之前，用PBS灌注肺部，以清除血液供应中存在的污染淋巴细胞。结果如图所示。
答：。接受未感染小鼠B细胞的小鼠中没有一只(嘲弄)有MHV-68感染的证据。接受感染小鼠细胞的五分之二小鼠的脾脏和肺部都有感染迹象，但血液中没有。因此，在移植成功建立脾脏感染B细胞的小鼠中，也有肺部感染的证据。这意味着驻留在脾B细胞中的病毒能够在肺部传播和建立感染。
B淋巴细胞过继转移后μMT小鼠器官中MHV-68的检测。采用gp150巢式PCR检测MHV-68基因组。在含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶上分析产品，并使用紫外线透射仪进行可视化。为了清晰起见，图像以颠倒的颜色显示。相对1-kb DNA阶梯进行分子量测定(先生)，左侧显示了bp中相关带的大小。在所有小组中，使用来自MHV-68阳性肿瘤细胞系S11的DNA作为阳性对照(+价值工程)并产生了368bp的预期产物。来自MHV-68阴性肿瘤细胞系S31（−价值工程)与去离子水一起使用(H（H）2哦)作为阴性对照。(A类)感染者T细胞缺失的脾细胞(信息1-4)或模拟感染(模型1-3)将C57/BL6小鼠过继转移至未感染μMT小鼠。11天后，提取DNA并通过巢式PCR分析MHV-68。脾、肺和血液的分析结果显示在相关轨迹的上方。(B类)三只持续感染μMT的小鼠(1–3)用巢式PCR检测MHV-68。肺部或脾脏的结果显示在相关轨迹的上方。(C类)将来自未感染C57/BL6小鼠的T细胞耗竭的脾细胞过继性转移至模拟感染小鼠(模型1和2)或持续感染(信息1–3)μMT小鼠。14天后，提取DNA并用巢式PCR分析MHV-68。脾和肺的分析结果显示在相关轨迹的上方。
为了观察持续存在于小鼠肺部的MHV-68是否会扩散到脾脏，我们利用了这样一个事实，即在没有任何脾脏感染证据的情况下，MHV-68持续存在于μMT小鼠肺部。因此，我们将模拟感染或感染MHV-68的μMT小鼠接种80天。然后将C57/BL6小鼠的T缺失脾细胞注入这些小鼠。对小鼠进行预转移测试，发现没有B220+血液中的细胞。在转移后的第2天，他们的B220比例在1-18%之间+血液中的细胞，表明过继转移的细胞持续存在。14天后，对小鼠进行取样，并通过PCR检测肺部和脾脏是否存在MHV-68。再次，在取出之前，对肺部进行灌注，以清除血容量中的污染B细胞。结果如图所示。,B类和C.B公司在一项对照实验中显示，病毒存在于持续感染μMT小鼠的肺部，但不存在于脾脏。这支持了我们之前的观察(13).C类显示了将实验转移到类似小鼠的结果。在两个模拟感染小鼠的肺部或脾脏中均未发现明显的病毒。然而，在感染小鼠的肺部和脾脏中都发现了MHV-68感染。因此，这表明在B细胞存在的情况下，持续存在于肺部的MHV-68可在脾脏中建立感染。
讨论
上述数据表明，MHV-68可在完整和B细胞缺乏小鼠的肺部持续存在。通过Gardella凝胶分析，在肺部检测到了基因组的外显体和线性形式，这意味着存在潜伏期和生产性复制，并且我们已经表明，免疫抑制后，持续存在的病毒可以以感染形式恢复。持续感染期间，在肺上皮细胞中发现潜伏的MHV-68，但未发现有生产性感染的细胞。过继性转移实验表明，滞留在肺部的病毒可以为脾脏播种，反之，滞留在脾脏的病毒也可以为肺部播种。
我们使用了μMT B细胞缺陷小鼠，因为我们和其他人已经证明MHV-68在肺部持续存在，但在这些小鼠鼻内感染后尚未检测到的脾脏或任何其他器官中都没有(13,25). 其他工作人员已经证明，该病毒能够感染μMT小鼠并在其脾脏中持续存在，但只有在腹腔内接种更大剂量的病毒后，才能建立更广泛的全身感染(26). 这意味着MHV-68需要B淋巴细胞在呼吸激发后运输和接种脾脏，并且在没有B细胞的情况下，脾脏内的替代细胞类型能够携带持续病毒。我们使用鼻内感染的数据并没有最终排除更复杂的宿主-病原体关系的可能性，例如与CMV存在的关系，其中多个位点对持久性有重要影响。然而，在μMT小鼠中，我们从未在持续存在期间在肺部以外的任何器官中检测到病毒DNA。这与μMT小鼠血液中病毒DNA的缺失有关（图。
A类)有力地表明，在当前的实验中，肺可能是持久性的主要来源。因此，我们认为μMT小鼠的鼻内感染为研究γ-疱疹病毒在粘膜部位的持久性提供了有力的手段。使用μMT菌株获得的数据可能具有代表性，因为这些小鼠肺部的持久性模式在各个方面都由完整的C57/BL6小鼠反映出来。
分子分析表明，在μMT和完整小鼠中，MHV-68持续存在的模式是潜伏期和生产性复制的混合。使用生物标准（如直接斑块或再活化试验）从未获得病毒在肺部持续存在的证据。然而，我们的数据（表)结果表明，T细胞耗竭后，μMT小鼠肺部感染病毒可被恢复。我们在这个系统的任何其他器官中都没有发现病毒，尽管这并不排除在一些迄今未被识别的部位存在少量潜伏病毒。此外，这里无法最终解决的一个问题是，检测到的感染性病毒是否是由于免疫机能丧失或潜伏期重新激活导致μMT小鼠中存在的少量持续活性复制的扩增所致。即便如此，我们的数据强烈表明，在肺部发现的传染性病毒起源于那里，通过分子手段发现的病毒没有缺陷。之前未能通过生物方法检测肺部中的MHV-68不太可能是因为病毒水平低于检测水平，因为肺部中含有与脾脏相当数量的病毒DNA（见图。). 一个更可能的解释是，病毒所在的上皮细胞可能不如脾脏中的B淋巴细胞支持体外活化。
控制宿主中γ-疱疹病毒重新激活的确切机制尚不清楚。当然，T细胞发挥着关键作用，因为无论是医源性T细胞缺乏还是由于疾病导致T细胞功能缺乏的人都可能死于EBV驱动的淋巴增生性疾病(27). 此外，艾滋病患者经常会发展为与KSHV相关的卡波西肉瘤(2). 然而，我们的结果表明，T细胞的耗竭并没有导致MHV-68的重新激活。μMT小鼠在没有抗体和T细胞的情况下实现了再激活。尽管还需要其他实验来证实这一点，但这些结果强烈表明抗体在重新激活后控制γ-疱疹病毒中发挥了作用。因此，即使面临严重的免疫抑制，完整小鼠体内抗病毒抗体的存在也可能阻止了重新激活病毒的传播。这可能在一定程度上解释了为什么EBV驱动的淋巴增生性疾病通常只在数月的T细胞耗竭后才发生(27). 如果没有T细胞，B细胞记忆和抗体可能需要很长时间才能下降到足以使病毒重新激活的水平。抗体的这种作用并不是唯一的。同样使用小鼠μMT株的优雅工作表明，抗病毒抗体对控制复发性小鼠巨细胞病毒很重要(28).
在持续感染期间在肺部检测到MHV-68的生产性形式可能并不奇怪，因为这是急性感染期间生产性复制的靶器官，粘膜部位的生产性复制也为病毒从宿主传播到宿主提供了一种手段。此外，在EBV持续感染期间，粘膜部位也出现了类似的低水平、零星的生产性复制模式(1). 然而，任何时候在肺部进行生产性MHV-68复制的细胞数量都必须很小，因为尽管我们通过Gardella凝胶分析检测到它们，但原位杂交或免疫组织化学没有发现它们。
在粘膜表面的上皮细胞中检测到鼠γ-疱疹病毒，该上皮细胞具有外膜构象，并且在没有溶解循环基因表达的情况下，表明该部位的至少一些上皮细胞受到了潜在感染。因此，这是一个新颖而重要的发现。通过观察发现，在μMT小鼠中，肺是唯一已知的持久性器官，并且使用疱疹病毒DNA复制抑制剂治疗28天不会影响该部位的持久性，这增加了这种影响。这强烈表明，潜伏的MHV-68感染在肺部的持续存在并不绝对需要从其他部位（如淋巴室或局部生产性复制）不断重新接种。然而，我们的结果并不排除在完整小鼠体内持续存在期间，从其他器官重新接种该位点不会发生。这可能对我们对其他γ-疱疹病毒发病机制的看法有启示。只有另一种γ-疱疹病毒（EBV）能够解决粘膜持久性问题。唾液中可以发现含有可有效复制EBV且来源不明的上皮细胞(5). 然而，粘膜活检中从未发现潜在感染细胞，阿昔洛韦患者的长期治疗会导致EBV从粘膜而非血液中流失(6,10). 因此，有人认为，粘膜对EBV在特定宿主中的持续存在不是必需的，并且需要不断从淋巴室重新接种以保持病毒在这些部位的存在。由于伦理考虑和获取活检材料的困难，在人类和大型动物身上进行实验很困难。此外，我们的数据表明，粘膜部位的γ-疱疹病毒数量可能很低。因此，其他系统粘膜表面的病毒可能被漏掉了。另一种解释是，在粘膜部位持续生存或不持续生存的能力可能代表该亚家族不同成员之间的基本生物学差异。然而，只有重新评估EBV、KSHV和其他γ-疱疹病毒的持久性，包括粘膜持久性的替代部位，如肺，这个问题才能得到解决。这可能是特别相关的，因为持续的γ-疱疹病毒感染与粘膜疾病相关。这些包括EBV与鼻咽癌的相关性(1)，口腔毛状白斑(4)和特发性肺纤维化(29)KSHV与结节病的关系(30).
EBV的研究表明，B细胞的潜伏时间是维持持久性的核心，病毒可以从这些细胞和种子粘膜传播。当然，我们的结果如图所示。表明驻留在淋巴室中的病毒在完整小鼠体内MHV-68的持续存在中起着中心作用。我们的数据使用的是未感染μMT的小鼠，这些小鼠的脾细胞被转移到了它们体内（图。
A类)这表明，和EBV一样，在MHV-68持续存在期间，病毒可能能够从B细胞传到粘膜。然而，将未经处理的B细胞转移到感染的μMT小鼠中，粘膜可能是唯一的持久性位点，这表明MHV-68能够运输到种子B细胞。因此，这些结果表明，在MHV-68持续存在期间，粘膜上皮细胞可能与B细胞一样重要，并且病毒可能在淋巴和非淋巴贮存器之间进行动态双向运动。这可能是病毒生存策略的一部分。因此，为了确保传播到新的宿主，可能需要在粘膜部位进行持久性和复制。淋巴组织中潜伏病毒的另一个储存库，病毒在两个部位之间的流动有限，这可能确保病毒永远不会从任何一个部位清除。
目前正在进行工作，以确定受感染小鼠肺部潜伏状态的性质。关键问题是B细胞中的潜在基因表达模式是否反映在肺上皮细胞中。MHV-68长期肺部感染的后果为探索γ-疱疹病毒感染与人类和未知病因动物肺部疾病之间的联系提供了一个独特的机会。
致谢
作者谨感谢S.Efstathiou博士慷慨赠送pEH1.4，感谢E.Littler博士和P.Collins博士以及Glaxo Wellcome PLC（英国米德尔塞克斯）慷慨赠送4′-S-EtdU。
这项工作由联合王国医学研究理事会和生物技术和生物科学研究理事会的拨款资助。J.Stewart是英国皇家学会大学研究员。
本文中使用的缩写
| 4′-S-EtdU | 2′-脱氧-5-乙基-β-4′-硫尿苷 |
| KSHV公司 | 卡波西肉瘤疱疹病毒 |
| MHV-68型 | 小鼠γ-疱疹病毒68 |
| 私人股本。 | 传染病后 |
| 质量控制 | 定量竞争 |
脚注
E.J.Usherwood目前的地址是田纳西州孟菲斯市劳德代尔北部332号圣裘德儿童研究医院免疫科，邮编38103。
工具书类
1A.B.Rickinson和E.Kieff。1996年，爱泼斯坦-巴尔病毒。在菲尔兹病毒学。编辑B.N.Fields、D.M.Knipe和P.M.Howley。Lippincott-Raven出版社，纽约，2397-2446。
2Chang Y，Cesarman E，Pessin MS，Lee F，Culppeper J，Knowles DM，Moore PS。AIDS相关卡波西肉瘤中疱疹病毒样DNA序列的鉴定。科学。1994;266:1865–1869.[公共医学][谷歌学者] 三。Roizmann B、Desrosiers RC、Fleckenstein B、Lopez C、Minson AC、Studdert MJ。家庭疱疹病毒科：更新。国际病毒分类委员会疱疹病毒研究小组。维罗尔拱门。1992;123:425–449.[公共医学][谷歌学者] 4格林斯潘JS、格林斯潘D、Lennette ET、Abrams DI、Conant MA、Peterson V、Freese UK。爱泼斯坦-巴尔病毒在口腔“多毛”白斑上皮细胞内的复制，这是一种AIDS相关病变。N英格兰医学杂志。1985;313:1564–1571.[公共医学][谷歌学者] 5Sixbey JW、Nedrud JG、Raab-Traub N、Hanes RA、Pagano JS。EB病毒在口咽上皮细胞中的复制。N英格兰医学杂志。1984;310:1225–1230.[公共医学][谷歌学者] 6Niedobitek G、Young L、Lau R、Brooks L、Greenspan D、Greenspan JS、Rickinson AB、Epstein-Barr病毒在口腔毛状白斑中的感染：无可检测潜伏期的病毒复制。维罗尔将军。1991;72:3035–3046.[公共医学][谷歌学者] 7Decker LL，Klaman LD，Thorley-Lawson DA。检测健康人外周血中潜在的EB病毒DNA。《维罗尔杂志》。1996;70:3286–3289. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Gratama JW、Oosterveer MAP、Zwaan FE、Lepooutre J、Klein G、Ernberg I.通过异基因骨髓移植根除Epstein-Barr病毒：对病毒潜伏期部位的影响。美国国家科学院程序。1988;85:8693–8696. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Miyashita EM，Yang B，Lam KMC，Crawford DH，Thorley-Lawson DA。体内正常B细胞中新型爱泼斯坦-巴尔病毒潜伏期。单元格。1995;80:593–601.[公共医学][谷歌学者] 10Yao QY、Ogan P、Rowe M、Wood M、Rickinson AB。感染爱泼斯坦-巴尔病毒的B细胞持续存在于阿昔洛韦治疗携带者的循环中。国际癌症杂志。1989;43:67–71.[公共医学][谷歌学者] 11Sunil-Chandra NP，Efstathiou S，Arno J，Nash AA。感染小鼠γ-疱疹病毒68的小鼠的病毒学和病理学特征。维罗尔将军。1992;73:2347–2356.[公共医学][谷歌学者] 12Sunil-Chandra NP、Efstathiou S、Nash AA。小鼠γ-疱疹病毒68在小鼠B淋巴细胞中建立潜伏感染体内试验。.维罗尔将军。1992;73:3275–3279.[公共医学][谷歌学者] 13Usherwood EJ、Stewart JP、Robertson K、Allen DJ、Nash AA。小鼠γ-疱疹病毒68感染的B细胞缺乏小鼠脾脏潜伏期缺失。维罗尔将军。1996;7:2819–2825.[公共医学][谷歌学者] 14Usherwood EJ，Stewart JP，Nash AA。小鼠γ-疱疹病毒68感染小鼠肿瘤细胞系的特征。《维罗尔杂志》。1996;70:6516–6518. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Kitamura D、Roes J、Kuhn R、Rajewsky K。通过靶向破坏免疫球蛋白μ链基因膜外显子的B细胞缺陷小鼠。自然。1991;350:423–426.[公共医学][谷歌学者] 16Gilliland G，Perrin GG，Blanchard K，Bunn FF。细胞因子mRNA和DNA分析：竞争性聚合酶链反应检测和定量。美国国家科学院程序。1990;87:2725–2729. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Siebert PD，Larrick JW。竞争性PCR。自然。1990;359:557–558.[公共医学][谷歌学者] 18Fazakerley JF、Pathak S、Scallan M、Amor S、Dyson H。Semliki Forest病毒A7（74）株的复制在神经元中受到限制。病毒学。1993;195:627–637.[公共医学][谷歌学者] 19Bowden RJ、Simas JP、Davis A、Efstathiou S.小鼠γ-疱疹病毒68编码潜伏期表达的tRNA-like序列。维罗尔将军。1997;78:1675–1687.[公共医学][谷歌学者] 20Pepper SD、Stewart JP、Arrand JR、Mackett M.小鼠γ-疱疹病毒-68编码胸苷激酶和糖蛋白H的同源物：嘧啶激酶活性的序列、表达和表征。病毒学。1996;219:475–479.[公共医学][谷歌学者] 21Sibony M，Commo F，Callard P，Gasc J-M。mRNA增强就地微波加热杂交信号。实验室投资。1995;73:586–591.[公共医学][谷歌学者] 22Decker LL、Shankar P、Khan G、Freeman RB、Dezube BJ、Lieberman J、Thorley-Lawson DA。卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）在KS组织中作为完整的潜在基因组存在，但在KS患者的外周血单核细胞中复制。《实验医学杂志》。1996;184:283–288. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Rahim SG、Trivedi N、Bogunovic-Batcheler MV、Hardy GW、Mills G、Selway JWT、Snowden W、Littler E、Coe PL、Basnak I等。2′-脱氧-4′-硫代嘧啶核苷的合成和抗疱疹病毒活性。医学化学杂志。1996;39:789–795.[公共医学][谷歌学者] 24Mackett M、Stewart JP、Pepper S、Chee M、Efstanthiou S、Nash AA、Arrand JR。小鼠γ-疱疹病毒68典型区域的遗传内容和初步转录分析。J Gen紫色。1997;78:1425–1433.[公共医学][谷歌学者] 25Kulkarni AB、Holmes KL、Fredrickson TN、Hartley JW、Morse HC.、。，免疫低下小鼠中小鼠γ-疱疹病毒感染的特征。在体内。1997;11:281–292.[公共医学][谷歌学者] 26Weck KE、Barkon ML、Yoo LI、Speck SH、Virgin HW。急性脾脏感染需要成熟的B细胞，但小鼠γ-疱疹病毒68潜伏期的建立不需要成熟B细胞。J维罗尔。1996;70:6775–6780. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Hanto DW、Frizzera G、Gajl-Peczalska PK、Simmons RL、Epstein-Barr病毒、免疫缺陷和B细胞淋巴增殖。移植（巴尔的摩）1985;39:461–472.[公共医学][谷歌学者] 28Jonjic S、Pavic I、Polic B、Crnkovic I、Lucin P、Koszinowski UH。抗体对于解决原发性巨细胞病毒感染并不重要，但可以限制复发病毒的传播。《实验医学杂志》。1994;179:1713–1717. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Egan JJ、Stewart JP、Haslton PS、Arrand JR、Carroll K、Woodcock A.隐源性纤维性肺泡炎肺上皮细胞内爱泼斯坦-巴尔病毒复制。胸部。1995;50:1234–1239. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Di Alberti L、Piattelli A、Artese L、Favia G、Patel S、Saunders N、Porter SR、Scully CM、Ngui S-L、Teo C-G。结节病组织中的人类疱疹病毒8变种。柳叶刀。1997;350:1655–1661.[公共医学][谷歌学者] 
