淋巴毒素（LT）1α以两种分子形式存在，一种可溶性同源三聚体，在结构上与可溶性TNF有关，可以结合并激活两种公认的TNF受体TNFR-I和TNFR-II(1,2)以及与结构相关的LTβ链和化学计量比LTα相关的膜结合异三聚体1LTβ2(三,4). 该配体与肿瘤坏死因子受体相关蛋白（TNFR-rp，也称为LTβ受体；参考文献4,5)，一种在非淋巴样细胞上广泛表达的受体。TNF/LT家族的一些配体和受体有助于正常淋巴组织结构的形成。例如，LTα(6–8)，LTβ(9)和TNFR-I(10)每个都是形成正常的派耶贴片结构所必需的，所有这些加上TNF(11)在脾白髓的初级和次级滤泡内形成滤泡树突状细胞簇（FDC）所必需的。在缺乏这些细胞因子或受体的小鼠中，用不含佐剂的T细胞依赖性抗原（如羊红细胞[SRBCs]或锁孔帽贝血蓝蛋白）免疫后，未能形成成熟的同种型开关免疫球蛋白反应(7,11–13). 因此，这些结果表明，TNF和LT表达细胞可能与FDC或FDC前体相互作用，以支持其在原发性脾滤泡内形成有组织的簇。骨髓（BM）衍生的LTα表达细胞在转移到LTα缺乏（LTα）细胞后能够恢复FDC簇的形成−/−)老鼠(13). 当用SRBCs和其他抗原免疫重组小鼠时，这些恢复的FDC簇可以支持生发中心（GC）的形成和成熟的同种型开关免疫球蛋白反应。因此，骨髓源性细胞产生的LTα对FDC簇的形成至关重要，而FDC簇又为成熟B细胞反应的形成提供了宽松的环境。
我们的初步实验表明，当野生型BM细胞转移到LTα−/−受体，在细胞移植后2～4周在脾脏白髓中形成FDC簇，之后可以检测到有效的IgG反应。相反，当重建LTα−/−小鼠有成熟的野生型脾细胞，在细胞转移和SRBCs免疫后10天，未检测到FDC簇或SRBCs的IgG(13). 这表明，表达LTα的BM衍生细胞需要数周才能恢复微环境，包括形成FDC簇，从而实现有效的IgG应答。考虑到这一点，很可能在短期重建实验中−/−接受混合脾细胞或纯化淋巴细胞亚群的小鼠不适合分析控制功能性FDC簇形成的细胞元素。
众所周知，T和B细胞都是生成GC和产生针对T依赖性抗原的类开关抗体所必需的。先前使用部分纯化的成熟T细胞制剂对裸鼠进行的研究表明，只有一小部分T细胞需要与B细胞合作形成GC和同型开关IgG反应(14,15). 为了消除一种淋巴细胞谱系与另一种淋巴细胞谱系污染的问题，我们选择通过遗传消融单个细胞谱系的方式从供体动物中转移骨髓，而不是仅通过转移脾中表达LTα的淋巴细胞亚群的纯化群体，来确定对表达LTα细胞谱系所需的条件。我们在此表明，表达LTα的B细胞对于恢复LTα的初级、次级和记忆性体液免疫反应至关重要−/−老鼠。表达LTα的B细胞形成适当的FDC簇后，LTα缺陷的T细胞可以与B细胞相互作用，产生产生的GC和类开关抗体反应。
材料和方法
老鼠。
C57BL/6J，129Sv，重组激活基因（RAG）-1−/−（目录号JR2216；C57BL/6J-抹布1tm1毫米)，B细胞受体（BCR）−/−（目录号JR2288；C57BL/6J-免疫球蛋白-6tm1校准)、和TCR−/−（目录号JR2122；C57BL/6J-Tcrb公司tm1毫米Tcrd公司tm1毫米)小鼠取自杰克逊实验室（缅因州巴尔港）。LTα−/−老鼠(6)保持在129Sv×C57BL/6混合背景下，并在特定的无致病条件下繁殖。
抗原特异性Ig的测定。
如前所述，对特定抗体进行测量和分析(16). 简而言之，Immulon 4平板（Dynatech Laboratories，Inc.，Chantilly，VA）涂有SRBC（150μl，5×107/ml）悬浮于PBS中0.25%戊二醛中。然后加入稀释的小鼠血清，并在4°C下孵育1小时。碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠同种型特异性抗血清（Southern Biotechnology Assoc.，Birmingham，AL）对IgM稀释1:500，对总IgG或IgG亚类稀释1:2000，添加100μl和100μl，并在4°C下培养1 h，然后清洗并添加碱性磷酸酶底物第页-硝基苯磷酸盐(西格玛化学公司。（密苏里州圣路易斯市）1 mg/ml。将三个孔405 nm处的平均OD与滴定血清的标准曲线进行比较，以使用线性回归分析计算相对单位。结果表示平均值±SEM。
淋巴细胞转移。
用剪刀将单个小鼠供体的脾切碎，并在两个磨砂显微镜载玻片之间挑逗脾脏，制备出完整的脾细胞悬液。如前所述，使用尼龙羊毛柱富集T和B细胞(17). 如前所述，通过抗Thy1.2加补体治疗进一步纯化B细胞(18). 这些制剂含有92–95%的B细胞，定义为IgM+B220型+流式细胞术检测。没有检测到污染T细胞。对于T细胞重建，制备的T细胞>80%，B细胞<10%。受污染的B细胞不太可能显著，因为受体TCR−/−小鼠体内含有大量内源性B细胞。如有指示，受体在细胞移植前3小时用750拉德照射。如有需要，在静脉注射前将SRBCs与脾细胞悬液混合。每个收件人收到10个7纯化细胞。
骨髓移植。
如前所述，采集骨髓并准备受体(13,18). 用1050 rads对受体小鼠进行致命照射，并用5×10重组6供体骨髓细胞。移植后6周，用108在初次或二次免疫后10天采集血清样本、SRBCs和血清样本。
脾脏卵泡结构的评估。
采集脾脏，包埋在O.C.T.化合物中（Miles，Elkhart，in），并在液氮中冷冻。冷冻切片（6–10μm厚）固定在冷丙酮中。用0.2%H淬火内源过氧化物酶2O（运行）2甲醇中。清洗后，通过首先与FITC-共轭B220和生物素化Thy1.2孵育对切片进行染色(法尔敏根加利福尼亚州圣地亚哥），生物素化抗补体受体（抗CR）1（8C12；法尔敏根)或生物素化花生凝集素（PNA；Vector，加利福尼亚州伯林盖姆），均以1:50–1:100稀释。辣根过氧化物酶-结合兔抗FITC（稀释1:20；丹麦Glostrup Dako）和碱性磷酸酶-结合链霉亲和素（稀释1:20；Zymed公司，南旧金山，加利福尼亚州）在1小时后添加。用碱性磷酸酶反应试剂盒（载体）和二氨基联苯胺对结合碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶进行显色。
结果和讨论
初级、次级和记忆性Ig反应需要表达LTα的B细胞，但不需要表达LTγ的T细胞。
LTα由活化的T细胞表达，尤其是CD4+辅助性T细胞1型和活化的B细胞和NK细胞(2). T细胞和B细胞都需要诱导GC的形成和对T细胞依赖性抗原的类开关抗体反应。当前的实验旨在确定哪些BM衍生的细胞元件，即T、B或NK细胞，需要传递LTα依赖性信号以形成GC和产生成熟的同种型开关Ig反应。我们使用野生型小鼠的骨髓作为所有骨髓衍生谱系LTα表达细胞的来源。来自Igμ重链靶向小鼠（BCR）的BM−/−)提供除B细胞外的所有骨髓衍生LTα表达谱系，以及TCR-β和TCR-δ（TCRβ和TCRδ）缺陷小鼠的骨髓−/−)提供除T细胞外的所有骨髓衍生LTα表达谱系。来自RAG-1的BM−/−除了B细胞和T细胞外，小鼠提供了所有骨髓衍生的LTα表达谱系。通过重组致命照射的LTα制备复合BM嵌合动物−/−小鼠从LTα获得1:1 BM混合物−/−小鼠（提供LTα−/−所有造血谱系的细胞）和野生型BCR−/−、TCR−/−，或RAG-1−/−老鼠。这些重组动物包含所有造血谱系，但其中一个或多个谱系不能表达LTα。
用LTα混合物重建小鼠−/−骨髓移植后6周腹腔免疫时，野生型BM能够产生强烈的IgG抗SRBC反应（图。
A类). 因此，野生型细胞比LTα占优势−/−形成同型开关T细胞依赖性抗体反应的细胞。类似地，用LTα混合物重组小鼠−/−和TCR−/−BM也能够产生强烈的IgG抗SRBC反应。这表明表达LTα的T细胞不需要用于发展同种型开关抗体反应。然而，用LTα混合物重建小鼠−/−和BCR之一−/−或RAG-1−/−BM未能产生抗原特异性IgG反应。因此，表达LTα的B淋巴细胞是恢复同种型开关抗体反应所必需的。
表达LTα的B细胞可以恢复LTα中的初级、次级和记忆性抗SRBC IgG反应−/−老鼠。对3-5只8周龄小鼠进行致死性照射，并用来自LTα的BM 1:1混合物进行重组−/−小鼠和BCR−/−、TCR−/−，或RAG-1−/−小鼠如图所示。用来自野生型供体的BM和LTα重组的致命照射野生型小鼠−/−用来自LTα的BM重组小鼠−/−捐赠者作为对照。BM重建6周后，用108PBS中的SRBC。主要抗SRBC IgG反应(A类)10天后通过ELISA检测(16). 用于测量二次响应(B类)，小鼠接受了10次强化免疫87天后收集PBS和血清中的SRBCs。用于测量记忆反应(C类)，用所示BM混合物重新配制的小鼠用单剂量108SRBC和7天后，5×107将脾细胞转移到亚致死剂量（750 rads）的正常C57BL/6小鼠，并立即用相同剂量的SRBCs攻击受体。7天后，测定血清抗SRBC IgG反应。所示数据表示三至五只小鼠三次测定的平均值±SEM。俄罗斯，相对单位。每个实验重复至少两次，结果相似。
LTα−/−小鼠表现出继发性损伤（图。
B类)和存储器（图。
C类)SRBC激发后的反应。为了研究表达LTα的B细胞是否能够重建这些反应，我们进一步评估了复合BM嵌合体动物。用来自LTα的BM混合物重建的小鼠中检测到强烈的次级和记忆性IgG反应−/−和TCR−/−鼠标（图。,B类和C类). 正如预期的那样，用LTα混合物重建的小鼠中没有出现继发性和记忆性IgG反应−/−和BCR之一−/−或RAG-1−/−骨髓（数据未显示）。这些数据表明，表达LTα的B细胞支持次级和记忆反应的发展，而且T细胞不需要表达LTα来帮助反应。尽管CD40配体（CD40L）等膜蛋白从T细胞发出的信号对产生记忆B细胞至关重要，但T细胞的LTα对为这些反应提供B细胞帮助并不重要。与这些数据一致，我们在其他实验中发现LTα−/−小鼠不能产生记忆B细胞，但可以产生记忆T细胞（数据未显示）。
表达LTα的B细胞，但不表达LTαT细胞诱导FDC微环境的形成。
FDCs簇是淋巴滤泡的重要组成部分，被认为支持形成GC，而GC是以基本方式产生强大的初级和次级IgG反应所必需的(19,20). 我们最近表明，在LTα中重建抗原特异性IgG反应−/−通过移植野生型BM的小鼠与FDC簇的恢复密切相关(13). 这些先前的研究表明，骨髓源性细胞产生了一批表达LTα的细胞，能够支持脾白髓结节内FDC簇的发育。为了确定负责传递该信号的基本LTα表达谱系，我们分析了LTα脾滤泡的结构−/−用LTαBM混合物进行致死性照射和重组的小鼠−/−小鼠和BCR−/−或TCR−/−老鼠。用抗CR1单克隆抗体8C12免疫组化检测FDC簇(21)，通过结合PNA检测GC（图。). 在LTα中FDC簇和GC均恢复−/−接受来自LTα的BM细胞混合物的小鼠−/−小鼠和TCR−/−老鼠。这表明T淋巴细胞系的细胞没有必要表达LTα以形成FDC簇和GC。相反，在接受来自LTα的BM混合物的小鼠中，既没有检测到FDC簇也没有检测到GC−/−和BCR−/−老鼠。因此，表达LTα的B细胞是脾初级卵泡（包括成簇的FDC）形成所必需的。虽然T细胞和B细胞都是GC形成和对SRBCs等T细胞依赖性抗原产生IgG反应所必需的，但这些细胞群提供的信号尚未完全确定。我们的数据表明，来自TCR的表达LTα的B细胞之间的相互作用−/−小鼠和来自LTα的LTα缺陷T细胞−/−小鼠能够在重建环境中支持GC形成、同型类转换和B细胞记忆。特别令人感兴趣的是，我们的数据表明，B细胞以一种重要的方式利用LTα调节其淋巴组织微环境，从而支持有效IgG反应的形成。
复合骨髓瘤嵌合小鼠脾脏卵泡的结构。从图中所示的小鼠收集血清后。
A类采集脾脏，冰冻切片用抗Thy1.2（蓝色）和抗B220（棕色）染色，以显示T和B细胞区(A类和B类)、抗CR1单克隆抗体8C12（蓝色）和抗B220（棕色），以可视化FDC簇(C类和天)或PNA（蓝色）和抗IgD（棕色）以可视化GC反应(E类和F类).A类,C类、和E类显示LTα的脾脏切片−/−用LTα骨髓混合物重建小鼠−/−和BCR−/−老鼠；B类,天、和F类显示LTα的脾脏切片−/−用来自LTα的BM混合物重建小鼠−/−和TCR−/−老鼠。两种复合BM嵌合体均未恢复B和T细胞区的适当分离；然而，在用表达LTα的B细胞重建的小鼠中，FDC簇和GC的形成都得到了恢复。
在没有T细胞的情况下，B细胞可以诱导FDC簇的形成。
正如在LTα中观察到的−/−小鼠外周淋巴组织科学情报部小鼠缺乏FDC簇(21)这表明成熟的B和/或T淋巴细胞是FDC簇形成所必需的。使用科学情报部受体Kapasi等人建议，T细胞或B细胞可以部分重建淋巴结中FDC簇的形成，但这两种细胞群都是完全恢复FDC所必需的(21). Cerny等人先前假设B细胞具有诱导FDC发育的特殊作用(22). 此外，Yoshida等人使用异基因系统表明，当用抗T细胞抗体治疗受体抑制移植物抗宿主病时，脾细胞（可能是T细胞功能被阻断的）可以恢复内源性FDC簇的形成科学情报部收件人(23). 然而，由于在这些研究中难以定义纯细胞群，仅B或T细胞诱导FDC聚集的能力很难评估。此外，T淋巴细胞（即使数量很少）已被明确证明对抗原驱动的GC的形成至关重要(14,15). 通过选择性去除T细胞或阻断共刺激信号（如CD40–CD40L或B7–CD28传递的共刺激信号）对T细胞功能的实验性干扰可阻止GC的形成和特异性IgG反应的形成(20,24–29). 因此，有趣的是，FDC表达CD40(30)它有可能与T细胞上的CD40L以生产性方式相互作用，而且先天性CD40L缺乏患者的淋巴结中FDC簇严重缺失(25). 这些观察结果表明，一些CD40-CD40L相互作用可能对FDC簇的形成至关重要。因此，我们意外地发现CD40L靶向缺失小鼠(31)，尽管SRBCs腹腔免疫后未形成GC，但表现出脾初级卵泡和FDC簇，与正常小鼠相似（数据未显示）。这表明FDC簇和分离的T、B细胞区的形成和/或维持可能独立于CD40-CD40L相互作用。
因为CD40L中保留了FDC簇−/−对于B–T细胞相互作用严重受损的小鼠，我们研究了是否需要任何B–T淋巴细胞相互作用来形成脾脏FDC簇。TCR脾脏切片−/−和BCR−/−用抗CR1单克隆抗体8C12对小鼠进行染色，以检测是否存在FDC簇（图。). 引人注目的是，TCR的脾脏−/−小鼠表现出与野生型小鼠相似的FDC簇。BCR脾脏切片−/−小鼠没有发现FDC簇。这些数据表明，表达LTα的B细胞是形成FDC簇所必需的，并且这些B细胞可以在没有T细胞的情况下支持FDC簇的形成。我们对CD3ε转基因小鼠的初步分析表明，B细胞是诱导FDC簇所必需的唯一淋巴细胞类型。这些小鼠缺乏NK和成熟T细胞活性(32,33). 有趣的是，对其脾脏切片的免疫组织化学分析显示，B细胞区内有成簇的FDC，与TCR中的类似−/−小鼠（数据未显示），表明NK或T细胞均不需要发育成FDC簇。
TCR中存在FDC集群−/−但不是BCR−/−老鼠。业务连续性审查−/−(A类和B类)、TCR−/−(C类和天)、和野生型(E类和F类)小鼠腹腔注射10810天后收获SRBC和脾脏。冰冻切片用抗Thy-1.2（蓝色）和抗B220（棕色）染色，以显示T和B细胞区(A类,C类、和E类). 用抗CR1/2单克隆抗体8C12（蓝色；B类,天、和E类).
在没有T细胞的情况下建立的微环境可以支持T细胞和B细胞在形成GC和类开关IgG反应中的相互作用。
如预期，当TCR−/−用SRBC免疫小鼠，尽管有大量IgM抗SRBC反应，但没有形成形态学上定义的GC，也没有检测到IgG抗SRBC抗体的产生（数据未显示）。相反，当来自TCR的BM−/−被过继地转移到LTα−/−小鼠的GC形成和产生抗原特异性IgG的能力完全恢复（图。和). 这些数据表明LTα−/−受体动物的T细胞可以与供体动物的表达LTα的B细胞共同作用，形成GC并支持Ig类转换。通过从野生型或LTα中转移纯化的T细胞，获得了T细胞能够以非依赖于LTα的方式支持GC形成的额外证据−/−小鼠进入含有TCR的FDC集群−/−收件人。未辐照TCR−/−小鼠通过输注107纯化的野生型或LTα脾T细胞−/−捐献者和10人的输液8SRBC。10天后，两个GC（图。)TCR中检测到高水平的IgG抗SRBC抗体（数据未显示）−/−受体，无论他们是接受野生型还是LTα−/−T细胞。这表明TCR中的FDC集群−/−一旦提供补充的T细胞，小鼠有能力支持GC的形成和产生的同种型开关Ig反应。与来自CD40L的T细胞相比−/−小鼠，LTα缺乏的T细胞可以激活B细胞进行GC反应，并且一旦表达LTα的B细胞建立了适当的微环境，就可以支持同种型转换。
纯化的表达LTα和缺乏LTα的T细胞都能恢复TCR中GC的形成−/−老鼠。未辐照TCR−/−给小鼠输注107从LTα脾中纯化的T细胞−/−(B类,天、和F类)或野生型小鼠(A类,C类、和E类). 同时，用108静脉注射SRBC。10天后收获受体的脾脏，并按照图所示对冷冻切片进行染色。.A类和B类B（棕色）和T（蓝色）细胞染色；C类和天B细胞（棕色）和FDC（蓝色）染色；E类和F类用B220（棕色）和PNA（蓝色）染色。
成熟的B细胞足以修复FDC簇。
上述BM转移研究表明，B细胞系中表达LTα的细胞需要诱导脾脏FDC簇的形成。为了研究该谱系的成熟B细胞成分是否足以为FDC的形成提供LTα依赖性信号，我们重组了未受辐射的RAG-1−/−静脉注射10种药物的小鼠7纯化脾B细胞或2.5×106来自TCR的BM细胞−/−捐赠者。转移后3周，两组小鼠的脾脏FDC簇相似（图。). 这些数据表明，仅表达LTα的成熟B细胞就足以在初级卵泡中重建内源性FDC簇的形成。有趣的是，静息处女B细胞被认为是LTα表达阴性(29,34). 因此，这意味着B细胞必须参与对话，在对话中，可能在白髓的适当区域诱导其表达LTα，然后LTα可以传递形成FDC簇的信号。诱导LTα表达的信号以及接收LTα信号的直接靶细胞的性质尚待确定。LT-dependent信号似乎不仅需要用于感应，还需要用于FDC集群的维护。我们先前的数据表明，用LTα替代正常BM后，FDC簇在2–3周内消失−/−BM公司(13). 因此，这是B细胞提供信号的一个独特例子，该信号用于诱导和维持支持B细胞功能反应进一步成熟的结构元件。
RAG-1中FDC簇的相似重构−/−小鼠通过转移BM或纯化B细胞。未辐照RAG-1−/−给小鼠输注2.5×106骨髓细胞(A类和C类)或107纯化脾B细胞(B类和天)来自TCR−/−捐赠者。3周后，采集脾脏，冰冻切片进行B/T细胞区和FDC簇染色，如图所示。,A–D。
关于B细胞在脾脏淋巴组织腔室内诱导FDC簇的能力，人们特别感兴趣的是在某些慢性炎症和自身免疫性疾病中含有FDC的淋巴滤泡和GC异位发育的先前描述。例如，重症肌无力患者可以在胸腺内出现淋巴滤泡和GC(35). 类风湿关节炎患者炎症滑膜组织中也发现类似的滤泡和GC(36). 这些GC含有与正常淋巴组织GC相似的FDC簇。我们推测浸润这些组织的B细胞表达LTα可能为FDC簇的形成提供初始信号，支持异位GC的形成。然而，在外周淋巴组织的整个B细胞区，FDC簇并不与B细胞共定位。相反，它们在初级B细胞滤泡中心附近形成集群，并保留这些滤泡的外围。这种定位的一个可能解释是，局部信号可能调节这些B细胞区域内LTα的表达。或者，这种受限的定位可能意味着除了B细胞衍生的LTα外，还需要其他信号来诱导FDC簇的形成和维持。更全面地了解调节FDC簇形成和维持的信号可能为控制免疫反应的质量和幅度提供新的机会。
