CD27表达促进功能效应器-记忆CD8的长期存活⁺HIV感染患者的细胞毒性T淋巴细胞

摘要

介绍

病毒特异性细胞毒性CD8的诱导和维持⁺T细胞反应足以控制大多数慢性病毒感染(1,2)，但不足以感染HIV。尽管HIV-特异性CD8数量巨大⁺在感染的大部分慢性阶段，T细胞反应，病毒复制持续(三–5)最终感染会发展成艾滋病(6–9). CD8故障⁺含有HIV的细胞反映了病毒的逃避，部分原因是感染细胞中的高突变率和I类抗原表达的下调(10–12)，以及HIV特异性CD4的优先耗竭⁺辅助性T细胞反应，这可能与其他慢性病毒感染一样，对维持有效的CD8至关重要⁺响应(13–16). 响应CD8的分析⁺T细胞(4,17–19)也表明HIV-特异性CD8的功能和分化异常⁺T细胞可能导致控制不足。艾滋病毒特异性CD8⁺从感染者外周血中分离的T细胞不能直接体外有效地溶解靶细胞。受损的细胞溶解活性可通过暴露于外源性IL-2而部分恢复(17)与关键信号分子（如CD3ζ和CD28）以及穿孔素的表达减少有关(4,18–20). 大多数HIV-特异性效应细胞也继续表达CD27，有人认为这种HIV-反应性CD8的不完全分化⁺T细胞可能有助于观察到的功能损伤(4,20–22).

人CD8的一条大致呈线性的分化途径⁺从原始细胞到记忆和效应细胞的T细胞已经被提出，这在很大程度上是基于一组细胞表面分子的表达(20,23,24). 天真的CD8⁺T细胞为CD45RA⁺28⁺27⁺CCR7号机组⁺并通过广泛增殖对抗原刺激作出反应，形成“中央”（中央记忆T细胞）或早期记忆细胞群，这些细胞能有效定位于淋巴结，表达CD45RO亚型，表达低水平颗粒酶但不表达穿孔素，具有高增殖能力但低细胞溶解活性。进一步刺激中枢记忆性T细胞会导致自我更新和产生失去CCR7和CD28表达的中间记忆细胞的增殖，然后是“效应器”（效应器记忆性T淋巴细胞）或失去CD27表达的晚期记忆细胞，表现出较低的增殖能力，但颗粒酶和穿孔素水平较高，并且直接溶细胞。这些CD45RO⁺28⁻27⁻CCR7号机组⁻效应器-记忆T细胞可以通过抗原刺激进一步驱动，下调CD45RO并重新表达CD45RA，成为“最终分化”的效应细胞(23,25). 小鼠CD8的成熟⁺T细胞对模型感染的反应显示出大多数相似的表型变化，而原始中枢记忆T细胞的确切效应功能仍有争议(26). 该模型已被证明大致描述了人类CD8的时间演化⁺反应，尽管已经确定了一些表型异常(27). 然而，在艾滋病毒感染中，这种模式似乎被打乱了。尽管病毒持续刺激，但大多数HIV-特异性CD8⁺从外周血中回收的T细胞保留了CD27的表达，并且是CD45RO⁺28⁻27⁺CCR7型⁻这被解释为反映了未能完成分化过程(20,21). 这种分化阻滞的基础以及保留CD27表达的潜在有害后果仍有待阐明。

尽管持续的CD27表达可能是HIV-特异性CTL效应器功能受损的“标记”，但最近的分析提供了证据，证明CD27–CD70相互作用为T细胞提供了协同刺激信号。CD27是TNFR家族的成员，与其跨膜配体CD70相互作用，后者在活化的T和B细胞以及潜在的树突状细胞上表达(28,29)诱导共刺激信号，激活NF-κB，促进生存，增强TCR介导的增殖信号，并增加效应器功能(30–32). CD70在HIV感染患者中过度表达，并持续向CD27发送信号⁺受感染宿主中的HIV特异性效应细胞理论上可能导致T细胞功能的改善(30–32)或T细胞功能障碍(32,33)，可能取决于提供的CD70信号的数量、持续时间和定时。CD27表达的另一种假设已被提出，其中应答CD8的分化⁺人群可能反映了特定病毒感染的独特特性(20). 例如，在巨细胞病毒感染中，大多数病毒特异性记忆细胞是CD27⁻而在EBV中，内存填充包含CD27⁻细胞，但富含CD27⁺单元格(20,34). 然而，不同的病毒如何诱导或选择不同的分化模式以及实际介导效应器功能的细胞表型尚未解决。

在这项工作中，我们在克隆和重复刺激最初的CD27后监测了CD27的表达⁺艾滋病毒特异性CD8⁺T细胞，并比较CD27⁺和CD27⁻来自同一亲本克隆的亚群。CD70结合刺激性TCR信号连接表面CD27导致CD27的下调，这对大多数细胞来说是暂时的，但CD27的很大一部分是暂时的⁺细胞永久转换为CD27⁻每个连续刺激的细胞。与CD27相比，保留CD27表达的细胞表现出正常的效应器功能⁻人口。此外，CD27⁺如果用TCR信号传递CD27共刺激信号，细胞会产生IL-2，并在体外显示出更好的存活率和更强的增殖反应。将混合人群过继转移为HIV感染者后，CD27⁺子集，但不是CD27⁻来自同一克隆的子集在体内持续存在。结果表明，CD27的优势⁺CD8细胞⁺感染者体内的HIV-反应性T细胞可能并不反映分化异常，而是一种适当的代偿性事件，反映了这些细胞在靶点识别后的存活和增殖优势，特别是在CD4缺乏的环境中，这可能有助于增强和维持抗病毒反应。

材料和方法

结果

CD27在HIV、CMV和EBV特异性T细胞克隆上的表达。

HIV、CMV和EBV特异性CD8⁺T细胞克隆分别由四个不同的供体独立生成，并对每个供体的一到两个同时衍生的T细胞克隆进行CD27表面表达分析。CD27在所有HIV和大多数EBV特异性T细胞克隆上都可检测到，但在任何CMV特异性T细胞克隆上均未检测到(图1A） ●●●●。除一名HIV感染者（编号07966）外，所有患者的病毒拷贝数均低于检测限。令人惊讶的是，来自几个HIV和EBV特异性T细胞克隆群体的细胞上的CD27表达并不一致，有些细胞是CD27⁺和其他CD27⁻虽然在0.3个细胞/孔的电镀后分离出T细胞克隆，但这种表型异质性增加了细胞群体可能不是克隆起源的可能性。因此，对两个异质性HIV特异性T细胞克隆的TCR基因进行测序，并从T细胞受体的高变CDR3区内设计克隆特异性引物。分选CD27制备DNA的实时PCR⁺和CD27⁻子集证明了在单个相同TCR的每个实例中的用法，证实了两个子集都来自相同的T细胞（未描述）。

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图1。

HIV、CMV和EBV特异性CD8克隆的CD27表面表达和端粒长度。所有HIV-特异性CD8克隆都识别gag蛋白，其中两个限制于B57等位基因，两个限制为B8，两个限定为B13。对两个独立产生的克隆进行了患者编号15249和16342的分析。两个CMV特异性T细胞克隆是A2限制性和pp65特异性的，一个是对具有未知限制性的即时早期蛋白特异性的，两个是对未知CMV蛋白特异性的。所有EBV特异性CD8克隆均为A2-限制性克隆，并识别BMFL1肽。（A） 通过FACS评估CD8克隆的表面表达，CD27的百分比⁺显示总T细胞的细胞数。（B） 用FACS分析了相同克隆的端粒长度。血浆和CD4中的病毒拷贝数⁺获取克隆细胞时的T细胞计数适用于HIV感染患者。

CD27在所有HIV、一些EBV和非CMV特异性T细胞克隆上的表达与报道的这些病毒特异性多克隆T细胞的体内表型一致(20). 然而，这一结果令人惊讶，因为所有克隆都是通过重复刺激和广泛增殖获得的，这与端粒缩短和CD27表达缺失有关(23). 因此，我们评估了携带CD27的人群⁺与CD27相比，克隆前和克隆过程中细胞经历的分裂更少⁻用自动流动FISH测量单个淋巴细胞端粒长度的人群(36). HIV、EBV和CMV特异性T细胞克隆的平均端粒长度相对较短（<5 kb），这表明这些人群都经历了大量的细胞分裂，这与CD27表达的保留或丢失无关(图1B） ●●●●。与这些病毒反应的T细胞可能都是由体内专业APC启动的，但随后经历了不同的体内事件以及不同的体外初始刺激条件，CMV特异性T细胞是由感染的成纤维细胞刺激的，而专业APC是针对HIV和EBV的，所有这些可能都影响了CD27的表达。然而，所有T细胞克隆在表达CD70的LCL和所有CD8的LCL存在下扩增⁺细胞对不依赖CD27表达的T细胞受体刺激的瞬时上调CD70(图2A） 表明CD27在体外重复刺激期间被CD70连接的能力的差异不能解释观察到的HIV、CMV和EBV特异性T细胞克隆的不同表型。

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图2。

T细胞活化后CD27表达。在LCL、辐照饲养细胞和IL-2的存在下，用抗CD3单克隆抗体扩增病毒特异性克隆。在指定的时间点，（A）CD27⁻CMV特定克隆MT（和第270页，未描述）和（B）CD27⁺用FACS分析EBV特异性克隆EG+4（和RS+26，未描述）CD27和CD70的表达。（C） HIV gag特异性T细胞克隆9G6-35（和42E5-176，未描述），最初包含CD27⁺和CD27⁻细胞，以及CD27的命运⁺和CD27⁻分别对T细胞进行分析。（B和C）初始CD27刺激周期结束时⁺EBV和HIV特异性细胞，对细胞进行CD27表达和CD27分选⁺和CD27⁻在下一个周期中对细胞进行监测。（D） 重复扩增T细胞克隆9G6-35和42E5-176，并在抗CD3单克隆抗体刺激14天后评估CD27的表达。（E） CD27的端粒长度⁺和CD27⁻对第五次体外扩增结束时的细胞进行比较。（F） 第27页⁺在存在或不存在5μg/ml抗-CD70mAb的情况下，用平板结合的抗-CD3 mAb刺激来自克隆42E5-176的T细胞4天。显示刺激后4天CD27的表面表达。

CD27⁺和CD27⁻经过一个刺激周期后，通过FACS分类从单个HIV特异性克隆中分离出亚群，然后用抗CD3和低剂量IL-2（50 U/ml）重新刺激后监测亚群CD27和CD70的表达，并与CD27的反应进行比较⁻CMV特定和CD27⁺EBV特异性克隆。两个CD27⁺和CD27⁻T细胞暂时上调CD70表达，最初阳性的CD27 T细胞在第5-9天失去表面CD27表达(图2，A–C). 然而，在15天刺激周期结束时，CD70表达再次降低，最初阴性的CD27细胞仍为CD27⁻大多数最初阳性的CD27细胞重新表达CD27。一小部分最初阳性的CD27细胞未能再表达CD27，重新刺激和分析CD27⁻人口显示，这种损失是不可逆转的。由CD27组成的HIV特异性T细胞克隆的重复体外扩增⁺和CD27⁻亚群导致CD27的逐渐丢失⁺CD27每次刺激和积累的细胞⁻T细胞(图2D） ●●●●。分选CD27中端粒重复序列的平均长度⁺和CD27⁻第五个扩张周期结束后的亚组均较短(图2E） ，再次表明CD27⁺和CD27⁻T细胞亚群广泛增殖。刺激CD27后观察到CD27的瞬时下调⁺T细胞依赖CD70结扎，因为表面CD27在CD27上表达稳定⁺存在阻断性CD70抗体的TCR刺激后的细胞(图2D） ●●●●。

结果表明效应器-记忆CD27⁺CTL逐渐转化为末端CD27⁻具有连续细胞分裂的表型，但所有CD27⁺CD27结扎后细胞暂时失去CD27表面表达。因此，CD27的直接体外分析⁻细胞可能会被两个截然不同的群体混淆：最近刺激的CD27⁺CTL和终末分化CD27⁻CTL。

CD27型⁺和CD27⁻HIV gag特异性CD8⁺T细胞在功能上是不同的。

CD27的存在⁺和CD27⁻扩增后来自同一亲本T细胞克隆的细胞可以分析CD27在基因相同的HIV-特异性T细胞上的功能。典型的表现是，这两个细胞亚群在其他方面具有可比性，TCR链或CD3ζ表达水平没有差异，并且这两个群体都是CD45RA^低，CD45RO^你好，CD38^你好，CD69^你好，Ki67⁻，增殖细胞核抗原^低，CCR7⁻，CD62L⁻，Bcl-2型⁺、FAS^你好和CD28⁻（未描述）。为了便于功能分析，通过定义具有部分匹配靶点的限制性等位基因和使用重叠gag肽和自体B细胞LCL作为靶点的表位映射来确定克隆的精细特异性。来自患者编号15249的克隆9G6-35受到B57限制，并识别出肽TSTLQEQIGW。来自患者编号07966的克隆42E5-176受到B13限制，并识别肽ERQANFLGKI。

这些HIV gag特异性CD8的反应⁺在用自体肽脉冲B-LCL刺激以模拟对靶细胞的识别后，以及在用抗CD3和抗CD27刺激后，评估T细胞克隆，以直接分析CD27在没有其他共刺激信号的情况下的作用。CD27增殖指数⁺细胞比CD27高两倍⁻肽脉冲自体LCL刺激后的细胞(图3A） ●●●●。在用30 ng板结合抗CD3刺激后，抗CD27对CD27的增殖反应没有影响⁻细胞，但对于CD27⁺细胞增殖与CD27结扎水平成正比，10μg抗CD27抗体增加[^三H] 胸腺嘧啶掺入CD27达100倍⁺细胞与CD27比较⁻单元格(图3B） ●●●●。差异[^三H] CD27之间的胸腺嘧啶掺入⁺和CD27⁻六个周期后的HIV-特异性T细胞比三个周期的扩增更明显(图3C） ，表明CD27–CD70相互作用可能对CD8变得越来越重要⁺作为CD8的响应⁺细胞获得更大的增殖史。

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图3。

CD27的功能性体外检测⁺和CD27⁻CTL。[^三H] CD27的胸腺嘧啶核苷摄取⁺和CD27⁻细胞分选和体外扩增后，以响应（A）用所述肽浓度脉冲的自体LCL，或（B）滴定量的板结合抗CD27和30 ng抗CD3单克隆抗体。（C）[^三H] 胸腺嘧啶核苷掺入CD27⁺和CD27⁻克隆9G6-35的T细胞经过三次（R3）或六次（R6）体外扩增，以响应滴定量的平板涂层抗CD3单克隆抗体（OKT3）。增殖指数确定为[[^三H] 刺激样品的胸腺嘧啶核苷摄取]/[[^三H] 未刺激样品的胸腺嘧啶掺入]。[^三H] 未刺激CD27对胸腺嘧啶的摄取⁺和CD27⁻各亚群具有可比性。（D） annexin V的百分比⁺细胞如CD27所示⁺和CD27⁻在存在或不存在10μg/ml包被抗CD27mAb的情况下，用10μg/ml的板结合抗CD3 mAb和/或10μg/m1的可溶性抗FAS mAb刺激16–18小时后的T细胞亚群。（E） CFSE标记的CD27⁺和CD27⁻在有或无10μg/ml包被抗CD27单克隆抗体的情况下，用30 ng/ml的板结合抗CD3单克隆抗体（OKT3）刺激克隆号为9G6-35的T细胞。刺激后7天显示CFSE表达。CD27的IL-2生成⁺和CD27⁻用（F）肽脉冲自体LCL或（G）滴定量的板结合抗CD27和30 ng抗CD3单克隆抗体刺激36小时后对细胞进行评估。（H）[^三H] 胸腺嘧啶核苷掺入CD27⁺和CD27⁻在存在或不存在阻断性抗IL-2Rβ单克隆抗体的情况下，用100 nM自体肽脉冲LCL刺激克隆9G6-35后，测量其T细胞。显示了三份样品的平均值，误差条表示SEM。图中显示的所有体外刺激都是在培养基中没有IL-2的情况下进行的。

更高[^三H] 细胞群体的胸腺嘧啶掺入可能反映CD27信号转导后细胞分裂增加和/或细胞存活增强。CD27的敏感性⁺和CD27⁻在最后一次刺激后15-18天，通过分选CD27检测具有与激活诱导的细胞死亡和FAS诱导的细胞凋亡相同TCR的T细胞⁺和CD27⁻亚群并在存在板结合抗CD3或可溶性抗FAS的情况下孵育16小时(图3D） ●●●●。通过CD27的并发信号减少了抗CD3触发TCR诱导的凋亡以及抗FAS直接诱导的凋亡。CD27的增殖⁺和CD27⁻通过检测CFSE标记细胞中的染料稀释度来分析T细胞对CD3抗体的反应。TCR刺激后CD27与抗CD27结合增加CFSE稀释(图3E） ●●●●。CD27数量增加⁺T细胞与CD27相比分裂⁻即使在没有抗CD27抗体的情况下，T细胞也可能是由于激活后T细胞表面上CD70对CD27的连接上调所致(图2A） ●●●●。经包被抗体结扎的CD27也在更有限的程度上增加了分选CD27的细胞周期⁻T细胞(图3E） ，这可能反映出存在少量污染CD27⁺分选CD27中的细胞和/或细胞⁻在之前的刺激周期中仅短暂下调CD27。

IL-2是一种重要的生长和生存因子，通常在TCR和共刺激分子CD28连接后产生。然而，其他共刺激信号可以促进IL-2的产生，我们检测了CD27增殖的观察差异⁺和CD27⁻T细胞可能部分反映了IL-2的产生(30,31). HIV gag–特异性CD8⁺效应记忆T细胞被抗原刺激(图3F） 或通过滴定剂量的抗CD3和抗CD27(图3G） ●●●●。仅CD27⁺亚群产生可检测到的IL-2，并且IL-2的产生随着更强的CD27介导的信号而增加。CD27的增殖⁺细胞，以及较小程度的CD27⁻CD8细胞⁺T细胞，通过在抗IL-2Rβ链中添加阻断抗体而减少(图3H） ●●●●。观察到的不完全阻断可能反映了该抗体的局限性和/或IL-2非依赖性增殖机制的作用。CD27增殖的有限减少⁻尽管在培养上清液中检测不到IL-2，但细胞对IL-2Rβ的抗体可能反映了增殖细胞消耗低水平IL-2或抗体的非特异性背景效应。因此，尽管IL-2的产生并不完全依赖于CD27的连接，但CD27-CD70的相互作用在数量上增加了IL-2的产生。

CD27的类似体外效应器功能⁺和CD27⁻HIV gag特异性T细胞。

HIV-特异性CD8上CD27表达的持续性⁺T细胞与效应功能受损和穿孔素表达不足有关(4,19). 然而，CD27的细胞内染色和FACS分析⁺和CD27⁻HIV gag特异性T细胞克隆42E5-176和9G6-35的亚群显示穿孔素和颗粒酶A的水平相当(图4，A和B). 用滴定量的肽刺激自体CD70后⁺LCL，CD27⁺和CD27⁻细胞对IFN-γ产生的反应相当(图4C） 和以相同效率裂解肽脉冲靶细胞(图4D） ●●●●。尽管这似乎与报道的干扰素-γ产生和CD27裂解活性的差异形成对比⁺和CD27⁻直接体外分析HIV-特异性T细胞(17,19,21)在我们的实验中，已知细胞受到相同的刺激和维持，这不能用直接从体内环境中获得的不同表型的细胞来控制，尤其是具有可变病毒负荷的细胞。因此，保留的CD27表达与效应器功能受损或无法获得这些功能没有内在联系。此外，如上所示，CD27的直接体外分析⁻效应器-记忆T细胞可能包括最近刺激的CD27⁺（瞬时CD27⁻)因此表达高穿孔素和IFN-γ水平的T细胞具有直接的体外细胞溶解活性。

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图4。

CD27的效应器功能⁺和CD27⁻CTL。CD27穿孔素（A）和颗粒酶A（B）的表达⁺和CD27⁻细胞分选和体外扩增后进行检测。纳入同型对照单克隆抗体进行比较。（C） CD27的细胞内IFN-γ染色⁺和CD27⁻用不同肽浓度的LCL进行体外刺激后，评估克隆9G6-35的亚群。（D） 标准⁵¹使用CD27进行Cr释放试验⁺和CD27⁻表明克隆9G6-35的效应细胞和1μM肽脉冲自体靶细胞在效应-靶比率下。显示了三种代表性分析中的一种。

收养性转移CD27的长期存活率⁺，但不是CD27⁻、HIV gag–特定CD8⁺体内T细胞。

我们的研究表明CD27⁺HIV特异性T细胞在连接CD27后产生IL-2，对细胞凋亡更具抵抗力，对抗原的反应比CD27更好地增殖⁻具有来自相同亲本T细胞的相同TCR的细胞。很难分析这些观察结果在人体内的潜在相关性。然而，我们能够利用一名先前参与研究方案的患者来评估通过过继转移自体HIV-特异性CD8来增强HIV免疫力⁺克隆在体外扩大到了大量，因为这个病人用一个克隆进行治疗，回顾起来，这个克隆含有64%CD27的混合物⁺和36%CD27⁻单元格(图5). 编号为15249的患者在研究开始时接受抗逆转录病毒治疗，血浆RNA水平<50 copies/ml，但在静止的外周CD4中定期检测到HIV-RNA⁺T细胞（未描述）。病人接受了3.3×10的输液⁹细胞/m²在第0天进行自体体外扩增HIV gag特异性T细胞克隆，然后进行低剂量IL-2（2.5×10⁵单位/米²)每日皮下注射14d以提高过继移植细胞的植入率(38). 如前所述，给药的克隆9G6-35包含两个CD27⁺和CD27⁻在效应器功能或激活或归巢分子的表达方面没有差异，并且端粒长度相等的子集。转移后通过分离CD27的定量PCR监测每个亚群的持续性⁺和CD27⁻克隆特异性CDR3区域的PBMC。在细胞输注前，用PCR无法在PBMC中检测到克隆来源的亲代细胞，但输注后1小时，转移的细胞占所有CD8的6%⁺T细胞(图5). 转移的细胞最多扩增到所有CD8的10%⁺输注后第4天，T细胞的频率在接下来的40天内下降，然后稳定在所有CD8的～2%⁺T细胞。在每个时间点，对PBMC进行CD8排序⁺CD27型⁺和CD8⁺CD27型⁻T细胞，并通过定量PCR评估每个组分中注入的T细胞数量。在转移细胞膨胀的峰值，约占总循环CD8的10%⁺细胞，CD27的分数⁻细胞数量增加（60%），这可能反映了CD27在应答CD27时的短暂下调⁺细胞和/或CD27优先早期扩张⁻细胞在外源性IL-2的存在下。峰值后，CD27的百分比⁻细胞持续下降（第28天为29%，第42天为8%），这主要是CD27⁺尽管我们不能正式排除CD27⁻HIV-特异性CTL在体内重新表达CD27，在体外分析中从未发现这种变化，我们的结果强烈提示输注CD27⁺在这个HIV感染患者中，CTL优先存活。因此，HIV-特异性CD8⁺表达CD27的细胞在体内具有存活优势，CD27的转移⁺细胞可以在HIV中建立强大的持续反应⁺患者。

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图5。

HIV gag特异性CD8的频率和表型⁺过继转移后的T细胞克隆。自体3.3×10⁹/米²克隆CD8⁺在第0天输注T细胞（来自患者编号15249的克隆9G6-35），然后注射低剂量IL-2（2.5×10⁵单位/米²)每天皮下注射14天。转移的T细胞的频率随后进行CDR3区域特异性定量PCR，如材料和方法所述。在指定的时间点，CD8⁺对PBMC进行分类，以检测CD27的表面表达，然后对分类样本进行定量克隆型PCR。FACS点图中的数字表示CD8的百分比⁺T细胞，以及PCR产物百分比表示的数字表示CD27中转移的T细胞克隆的百分比⁺或CD27⁻亚群。

讨论

TNFR家族成员CD27由天真的人类CD8表达⁺据报道，T细胞在克隆扩增和向效应细胞正常分化过程中丢失。因此，CD27⁻CD8细胞⁺种群似乎是从CD27的持续刺激中进化而来的⁺前体，可能代表一种分化程度更高的抗原经历细胞，与CD27相比具有更广泛的增殖史和更完整的效应器功能⁺CD8细胞⁺单元格(24). 然而，病毒特异性CD8表达CD27⁺感染不同病毒后持续存在的T细胞的变化比这种有序的线性分化模式预测的变化更大，尽管这种差异没有明确的生物学基础(4,20,34,39). 在这项工作中，我们检查了CD27表达和CD8之间关系的性质⁺直接比较体内外CD27的T细胞分化和功能⁺和CD27⁻来自同一亲本细胞的细胞，结果表明当前模型需要修改。

该分析独立地从12名感染HIV、CMV和/或EBV的个体中获得克隆组。尽管克隆需要广泛的体外增殖，但克隆的表型是新分离的CD8的典型表型⁺T细胞对这些病毒有反应。特别是，大多数HIV特异性克隆是CD27⁺，一部分EBV特异性克隆是CD27⁺，并且所有CMV特异性克隆均为CD27⁻HIV和EBV特异性CD8的分析⁺来自单个祖细胞的克隆也令人惊讶地揭示了几个“克隆”在CD27表达方面的异质性，可能模拟体内反应的进展。CD27的分类⁻重新刺激后的群体显示，大多数细胞都不可逆地失去了CD27的表达。相比之下，分选CD27的动态变化明显⁺刺激后不久，所有细胞都下调CD27的表达，大多数细胞在增殖周期结束时再次表达CD27（暂时性CD27⁻CTL），但一小部分转化为稳定的CD27⁻重复刺激CD27⁺细胞，稳定CD27的分数⁻细胞逐渐增多。我们在CD27中测量的端粒长度⁺和CD27⁻增殖HIV-特异性CD27的后代⁺亲本克隆表明这两个种群都经历了大规模增殖。这些结果证实并扩展了早期的研究，表明多克隆PBMC在多次体外刺激后不可逆地失去CD27表达，RA的端粒长度⁺CD27型⁻效应细胞与RA⁻CD27型⁺直接体外测量的记忆细胞具有可比性，但比原始RA的记忆细胞短1-3 kb⁺CD27型⁺单元格(23). 综上所述，这表明CD27⁺和CD27⁻抗原体验CD8⁺T细胞有类似的增殖史。HIV-特异性CD8的端粒长度分析⁺直接从PBMC获得的T细胞也证明CD27的表达并不一定意味着之前的增殖受限(40–42).

具有CD27倾向⁺细胞产生并持续增殖至CD27⁻细胞，主要存在CD27⁺体内细胞对某些慢性病毒感染的反应表明，这种细胞在特定环境中可能具有选择性优势。通过CD27传递的信号可能通过增强增殖和存活来提供选择性优势(30,31,43). 我们发现CD27⁺和CD27⁻CD8细胞⁺T细胞存在于相同的HIV-特异性“克隆”人群中，这使得直接评估CD27表达保留或丢失的功能后果成为可能。CD27型⁺细胞对抗原或直接TCR触发的反应更好，增殖的增加依赖于CD27的连接。增殖反应的增加反映了凋亡的减少，可能反映了CD27通过NF-κB活化传递的生存前信号(44,45)以及CD27的协同刺激信号产生IL-2。CD27发出的这种信号的存在可能对促进HIV-特异性CD8的存活和持续性特别有帮助⁺T细胞有几个原因。首先，从PBMC中分离的HIV特异性效应记忆细胞通常失去了CD28的表达，否则CD28可能为IL-2的产生提供一种替代的、更有效的共刺激信号(46). 事实上，我们最近发现CD28在HIV-特异性CD28中的强制再表达⁻CD8细胞⁺通过基因修饰的效应T细胞恢复这种共刺激信号和IL-2的产生(47)，但这种再表达在CD28中并不自然发生⁻CD8细胞⁺T细胞。其次，CD4⁺通常在感染早期就失去了对HIV的反应，消除了支持CD8的IL-2的常见来源⁺对病毒的反应(13,48). 第三，观察到CD8的促凋亡环境⁺HIV感染者体内的细胞可能会增加向T细胞传递促生存信号的重要性(49). 最后，HIV-特异性CD8⁺T细胞存在于富含表达CD70的细胞的环境中，包括活化的T、B和树突状细胞(50). 因此，在HIV感染中出现的情况是，HIV-特异性CD8亚群⁺保留CD27表达的T细胞可能具有强大的体内选择性优势，并可能有助于解释CD8的强健性⁺尽管缺乏足够的CD4帮助，但感染者的反应仍会持续。

该模型有利于抗HIV反应的一个潜在警告是CD27表达缺失与CD8获得效应器功能之间的拟议关系⁺单元格(4,20,21)，从而保留CD27⁺对宿主价值有限的细胞。然而，我们对CD27功能的体外分析⁺和CD27⁻来自同一克隆群体的细胞表明，效应器功能的获得与CD27表达的丧失没有密切联系。CD27型⁺细胞表达的穿孔素和颗粒酶水平与CD27相似⁻细胞产生同等水平的IFN-γ，并表现出相同的细胞溶解活性。这些差异如何影响CD27的效应器功能受损⁺解释CTL？首先，CD27的直接体外分析⁻感染者的细胞将包括最近刺激的CD27⁺仅为瞬时CD27的CTL⁻由于最近的TCR刺激，这些细胞可能会表现出完整的效应器功能。其次，在新分离的HIV-特异性CD27中观察到的功能异常⁺CD8细胞⁺可能反映了HIV感染宿主体内环境的后果，例如在高抗原负荷的情况下限制T帮助，而不是异常分化，正如在IL-2过夜培养后观察到的IFN-γ生成和细胞溶解活性所支持的那样(17). 因此，体外结果可能反映CD27的效应器潜力⁺如果适当刺激细胞。

HIV-特异性CD8持续表达CD27的模型⁺T细胞反映了由于生存优势而产生的选择，而不是代表分化缺陷，这也与在其他感染中观察到的表型相一致。显性病毒特异性记忆CD8⁺人口为CD27⁻在慢性巨细胞病毒感染中，一种强CD4⁺存在能够提供IL-2的应答，并且其中靶点例如受感染的成纤维细胞是CD70⁻并且不会提供CD27⁺具有选择性优势的细胞。具有CD27的中间表型⁻和CD27⁺在EBV感染中观察到细胞存在，在这种情况下CD4⁺响应可以支持CD27⁻随着CD8增殖而进化的群体，但CD70在一些受感染的靶点（如B细胞）上的存在可以赋予CD27优势⁺细胞。此外，在发展为EB病毒相关淋巴瘤的HIV感染者中，EB病毒特异性CD27的缺失⁻CD8细胞⁺细胞和CD27的积聚⁺CD8细胞⁺已观察到细胞(21). 尽管这些变化已经被解释，因为这些淋巴瘤并没有得到很好的控制，这为CD8的异常分化提供了进一步的证据⁺对EBV病的反应是允许的，淋巴瘤通常发生在HIV感染的后期。根据我们的数据，另一种解释是CD70的恶性扩张⁺B细胞与CD4的整体丢失⁺进行性HIV感染的T辅助反应分别导致CD27的优先选择⁺依赖于帮助者的CD27的数量和损失⁻尽管这可能仍会导致数量上的不足。

最终，体内研究对于解决这些问题是必要的，但这种研究很难在人体内进行。CD27缺陷小鼠流感感染的最新数据显示，CD27–CD70相互作用介导了一种维持感染部位CD8应答所必需的前生存信号，CD27信号在增殖中的作用尚不清楚，因为小鼠具有完整的CD4应答(45). 在一项临床试验中，我们对患者转移的T细胞上CD27的表达进行了分析，该试验检测了自体、体外扩增的HIV-特异性CD8的过继转移⁺T细胞作为增强感染者病毒特异性免疫的手段(35)已提供证据支持CD27信号在维持人类CD8反应中的积极作用。患者接受克隆HIV-特异性CD8后⁺包含CD27的人群⁺和CD27⁻转移后不久即可检测到两种表型的亚克隆细胞，但CD27的分数⁻此后不久，持续转移的细胞中的细胞开始减少，到第42天，尽管大量CD27持续存在，但基本上无法检测到⁺细胞。体外扩增后输注时，CD27⁺和CD27⁻细胞亚群为CCR7⁻和CD62L⁻表明检测到的主要是CD27⁺PBMC中的细胞随着时间的推移没有反映CD27的差异归巢⁻细胞转移到次级淋巴器官。转移的HIV-特异性CD27的生存优势观察⁺CD8亚群⁺细胞输注到HIV感染的宿主后，模拟了我们对内源性反应的预测。尽管未来的研究可能能够通过监测病毒特异性CD8的表型和功能进化，在人体内间接解决这一问题⁺病毒感染过程中的反应，直接比较HIV-特异性CD27的独特机会⁺和CD27⁻在本研究中，同一细胞在体外和体内的后代强烈支持CD27的积累⁺某些慢性病毒感染中的效应记忆细胞反映了宿主的功能适应性反应，而不是异常分化的反映。

致谢

笔记

本文中使用的缩写：羧基荧光素二醋酸酯琥珀酰酯；LCL，淋巴母细胞系。

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