《实验医学杂志》。2004年5月3日；199(9): 1285–1291.
人CD4的抑制功能缺陷+CD25细胞+自身免疫性多腺综合征II型中的调节性T细胞
,1 ,2 ,1 ,1 ,1和1
马丁·克里格尔
1临床免疫学和风湿病研究所医学三部
托比亚斯·洛曼
2德国埃尔兰根大学医学一系内分泌科，邮编：91054
克里斯托夫·加布勒
1临床免疫学和风湿病研究所医学三部
诺伯特·布兰克
1临床免疫学和风湿病研究所医学三部
约阿希姆·R·卡尔登
1临床免疫学和风湿病研究所医学三部
汉斯·马丁·洛伦茨
1临床免疫学和风湿病研究所医学三系
1临床免疫学和风湿病研究所医学三部
2德国埃尔兰根大学医学一系内分泌科，邮编：91054
向Martin A.Kriegel致函，地址：美国康涅狄格州纽黑文市Cedar街300号耶鲁大学医学院TAC S-560免疫生物学科，邮政信箱：208011，邮编：06520。电话：（203）785-5383；传真：（203）737-2958；电子邮件：moc.liamtoh@传奇KnitraM
收稿日期：2003年12月11日；2004年3月26日接受。
摘要
在自身免疫性多腺体综合征（APS）中，有几个器官特异性自身免疫疾病聚集在一起。尽管I型APS是由中枢耐受性丧失引起的，但II型APS（APS-II）的病因目前尚不清楚。然而，在一些小鼠模型中，CD4的耗竭+CD25细胞+调节性T细胞（T法规)导致类似人类APS-II的综合征，伴有多种内分泌疾病。因此，我们假设外周主动抑制的丧失可能是该综合征的特征。T型法规从APS-II的外周血中，患有单一自身免疫性内分泌疾病的对照患者和正常健康献血者在数量（除了患有孤立自身免疫性疾病的患者）、功能重要的表面标志物或生长因子撤除诱导的细胞凋亡方面没有差异。引人注目的是，APS-II T法规他们的抑制能力有缺陷。该缺陷持续存在，并不是由于应答器细胞抵抗所致。这些数据为APS-II的发病机制以及可能的人类自身免疫提供了新的见解。
关键词：抑制细胞、自身免疫性多内分泌疾病、艾迪生病、I型糖尿病、自身免疫甲状腺炎
介绍
免疫耐受的中枢和外周机制在很大程度上阻止了自身免疫。外周耐受机制可进一步分为主动调节和被动调节(1)。主动外周耐受的一个突出机制最近被重新评价；也就是说，特异性淋巴细胞对自身反应性的抑制(2)。尽管它们被优先称为调节性T细胞（T法规)它们的主要功能不是抑制T细胞，而是抑制T细胞。在几种抑制细胞中，小鼠CD4+CD25细胞+T型法规最近被广泛描述(2)。它们在体外是天然无反应的，但在体内可以扩张(三)。它们抑制先天性(4)以及适应性免疫，包括记忆(5)。它们的抑制模式尚未完全阐明，但需要叉头转录因子FOXP3(6–8)。FOXP3基因突变导致儿童出现严重炎症综合征，称为IPEX（免疫失调、多内分泌疾病、肠病和X连锁综合征）或X连锁自身免疫过敏性失调综合征(9).
人类对应物占外周CD4的5-15%+T细胞，通常在与CD4的体外共培养试验中进行测试+CD25细胞−应答细胞(10–13)。它们可以调节感染耐受性(10,13)。它们极易受到生长因子撤除诱导的细胞凋亡的影响(14)，其抑制能力在CD25中最强高的-表示分数(15)。其他几个研究小组也获得了关于人类T细胞生理学的有效数据法规使用常规CD4+CD25细胞+T型法规(5,11,12,14,16).
小鼠T法规最近在不同的模型中与各种有益或有害的影响相关（即，下调自身免疫、过敏、移植物抗宿主病，以及肿瘤和感染免疫；参考文献2,17)。然而，CD4+CD25细胞+T型法规最初由Sakaguchi等人在一种独特的小鼠自身免疫模型中发现(18)。体外CD4耗竭后+CD25细胞+T细胞，小鼠对多个器官产生自身免疫。值得注意的是，大多数靶器官是内分泌腺；因此，它们在很大程度上类似于人类自身免疫性多腺体综合征II型（APS-II）。
人类APS的特点是由同一患者自身免疫过程引发的多种内分泌疾病(19,20)。早发性APS-I（也称为自身免疫性多内分泌病-念珠菌病-表皮营养不良综合征或APECED）是由自身免疫调节物AIRE突变导致的中枢耐受缺陷引起的(21)包括艾迪生氏病、甲状旁腺功能减退症以及皮肤粘膜念珠菌病的易感性(19,20)。成人发病APS-II的特征是以下两种或两种以上的自身免疫性内分泌疾病同时发生：Addison病、I型糖尿病或自身免疫性甲状腺疾病(19,20)。除了与CTLA-4多态性和HLA延伸单倍型相关外，APS-II的发病机制目前尚不清楚(19,20,22)。由于CD4缺失小鼠的自身免疫表型具有惊人的相似性+CD25细胞+T细胞(18)我们假设这些细胞的缺陷一定是人类综合征的核心组成部分。因此，我们分析了CD4+CD25细胞+APS-II患者、对照患者和正常健康献血者的T细胞表型和功能。
材料和方法
研究对象。
所有APS-II和对照组患者均通过临床和实验室参数进行诊断，包括长期疾病后靶组织的自身抗体。此外，对所有患者进行了可能发生的其他自身免疫性内分泌疾病的随访。具体而言，艾迪生氏病对照组患者在最后一次就诊期间TSH值在正常范围内（患者3的TSH值为0.75μU/ml，患者6的TSH为1.56μU/ml；TSH的正常值为0.3–3.5μU/m1）。抗甲状腺过氧化物酶、抗甲状腺球蛋白和抗胰岛抗体筛查为阴性。所有患者在激素替代治疗中都得到了很好的控制，这是他们在研究期间唯一的药物。APS-II患者没有表现出甲状旁腺功能减退、皮肤或胃肠道共病、免疫缺陷、念珠菌病或牙釉质发育不良，这与APS-I明显不同。IPEX也可以排除在外，因为发病、临床差异和女性占优势。患者的年龄、内分泌疾病的组合以及每种疾病的持续时间如所示从该地区招募正常健康受试者进行自愿献血。正常健康献血者的年龄范围为24-60岁，平均年龄为36岁。在研究之前，排除任何正常献血者或有感染或全身免疫激活症状或体征的患者。根据大学道德委员会的指导方针，所有研究对象同意献血仅用于研究目的。
表一。
患者的性别、年龄和每种自身免疫性内分泌疾病的持续时间一
| 病人 | 性别 | 年龄 | 阿狄森氏病
病 | I型
糖尿病 | 自身免疫
甲状腺炎 | 戈纳达尔
不足 |
|---|
| | 年 | 年 | 年 | 年 | 年 |
| 1 | F类 | 30 | 1 | – | 12 | – |
| 2 | F类 | 33 | – | 24 | 24 | – |
| 三 | F类 | 35 | 24 | – | 21 | 19 |
| 4 | F类 | 62 | 15 | 23 | 15 | – |
| 5 | F类 | 31 | 17 | – | 17 | – |
| 6 | F类 | 30 | 8 | – | 8 | – |
| 7 | F类 | 34 | 5 | – | 8 | – |
| 8 | 米 | 63 | 31 | 31 | – | – |
| 1 | F类 | 36 | – | – | 三 | – |
| 2 | F类 | 43 | – | 5 | – | – |
| 三 | 米 | 34 | 三 | – | – | – |
| 4 | F类 | 22 | – | 8 | – | – |
| 5 | F类 | 51 | – | – | 1 | – |
| 6 | 米 | 40 | 7 | – | – | – |
| 7 | F类 | 30 | – | 26 | – | – |
| 8 | F类 | 65 | – | 41 | – | – |
抗体和试剂。
如前所述，使用培养基、OKT-3和PHA(23)。1μg/ml抗CD28 mAb 9.3是百时美施贵宝赠送的。对于FACS®分析中，使用了以下结合抗体：CD4和HLA-DR（免疫技术）；CD28、CD25、CTLA-4和CD95（BD Biosciences）；和PD-1（电子生物科学）。TGFβ来自IQ Products，糖皮质激素诱导的TNF受体（GITR）来自R&D Systems。还从Immunotech获得了同位素对照物（IgG1和IgG2a）。在含有碘化丙啶（Sigma-Aldrich）的缓冲液中使用FITC-共轭膜联蛋白V（Roche）定量细胞凋亡。
CD4的分离+CD25细胞+和CD25−T细胞。
通过Ficoll-Hypaque（BAG）密度梯度离心法从肝素化外周血中分离PBMC。CD4细胞+从CD4阴性的PBMC中分离出T细胞+根据制造商的协议，从Miltenyi Biotec获得T细胞分离试剂盒。通过流式细胞术分析常规确认纯度（>95%CD4+)也由于缺乏增殖至1μg/ml PHA。类似地，CD4+CD25细胞+和CD25−从纯的、未接触的CD4中分离出T细胞+使用CD25微珠的T细胞（Miltenyi Biotec）。
CD4的分离+CD25细胞高的T细胞。
CD4细胞+如上所述分离T细胞。CD25高的-表达部分从CD25中进一步分离低的和CD25−使用CD4-FITC和CD25-PE标记抗体进行流式细胞术分选。使用MoFlo机器（DakoCytomation）进行分选。CD25纯度高的-表达CD4+T细胞百分之百。
细胞增殖试验。
5 × 10三细胞孵育7天。在所有增殖试验中，以10:1的比率使用辐照的（3000灰色）PBMC作为饲养细胞。[三H] 如前所述，使用胸腺嘧啶摄取和并入基因组DNA来量化细胞增殖(23).
流式细胞仪分析。
使用EPICS XL™流式细胞仪（Beckman Coulter）检测结果和讨论部分所述的各种标记物并量化凋亡。用不同的FITC-和PE结合单克隆抗体组合及其相应的同型对照物对细胞进行染色。T细胞在黑暗中4°C孵育20–30分钟。用PBS/1%BSA（Sigma-Aldrich）洗涤细胞后，用流式细胞仪分析细胞。在所有实验中，设置了闸门，以便阴性对照染色<1%的假阳性细胞。
早期凋亡、晚期凋亡和坏死的量化。
2.5 × 104CD4细胞+CD25细胞+和CD25−细胞单独保存在培养基中，或补充10 U/ml的IL-2，在平底微量滴定板中培养2 d。用FITC-结合膜联蛋白V在含碘化丙啶的染色缓冲液中在黑暗中4°C下染色30分钟，检测细胞死亡特征。流式细胞仪分析后，可区分四个群体：活细胞（膜联蛋白Ⅴ阴性和碘化丙锭阴性）、，早期凋亡细胞（annexin V阳性和碘化丙啶阴性）、晚期凋亡细胞（annexin V阳性和碘化丙啶中间体）和原发性坏死细胞（碘化丙锭高度阳性）。
用RT-PCR对mRNA进行半定量分析。
为了分析人类FOXP3转录物的表达5CD4细胞+CD25细胞+和CD25−分离后立即对T细胞进行裂解。如前所述，使用RNeasy Mini kit™（QIAGEN）分离总RNA(23)。信使RNA用寡核苷酸（dT）引物逆转录，并用基因特异性引物扩增。如有要求，可从作者处获得引物序列。FOXP3的cDNA扩增28和35个周期，GAPDH的cDNA则扩增21和28个周期。
统计分析。
使用InStat™软件（3.00版；GraphPad），通过Tukey-Kramer后验和Wilcoxon配对签名秩检验进行单向方差分析。
结果和讨论
CD4的定量和功能表征+CD25细胞+外周血T细胞。
首先，我们从正常健康供体、APS-II和对照患者中分离出PBMC，并量化CD4上CD25的表达+T细胞。CD4的平均百分比+CD25细胞+我们正常供体的T细胞与以前的人类T细胞计数兼容9.3%规则健康人群中的数字。CD4亚群的数量+APS-II患者的T细胞相似（平均9.0%），但对照组患者的血中T细胞普遍减少（平均3.0%）。两个研究组均未发现CD4淋巴细胞减少。随着时间的推移，我们发现T水平持续降低规则来自对照组患者的数字（未公开的数据），指出在保持正常的自然T含量方面可能存在内在缺陷雷格斯单一内分泌疾病患者。
对T进行功能分析法规，我们分离了CD4+CD25细胞+和CD25−T细胞组分。以1:1的比例混合来自正常供体的两个群体，诱导CD25的深度抑制−T细胞增殖对OKT-3的反应(A） 或PHA(B） 分别是。对照组患者的细胞也得到了类似的结果()。令人惊讶的是，CD4的抑制能力+CD25细胞+APS-II患者的T细胞持续受损()。T型法规与正常供体或对照组患者相比，APS-II患者与可溶性抗CD28加OKT-3共刺激后也出现功能障碍（未公布数据）。比较每个研究对象的增殖抑制百分比表明，一些APS-II患者的细胞共培养甚至可以诱导增殖而不是抑制(C） ，反映了抑制功能的完全丧失。如果较高的T数，则缺陷是部分可逆的法规被滴定至应答者(D） ，而T法规来自正常供体和对照患者的细胞数量依赖性强抑制(D） ●●●●。测试T是否法规APS-II患者对IL-2仍有反应，除了OKT-3刺激外，我们在共培养物中添加IL-2。T型法规不再有低反应，并且在所有三组中都消除了对增殖的抑制（未发表的数据）。为了检验抑制功能的缺乏是否随时间而稳定，我们在三名受试者的几个时间点进行了相同的共培养实验。三个研究对象中的每一个在几个月的时间内都保持了APS-II抑制功能的丧失以及正常供体和对照患者的完整功能(E） ●●●●。
CD4的功能分析+CD25细胞+T型法规（A和B）辐照饲养细胞的背景增殖（白条），CD4的增殖+CD25细胞−应答细胞（黑条），CD4+CD25细胞+T型雷格斯（交叉阴影条），或从正常健康献血者中以1:1的比例添加两个群体（斜条纹条）(n个=10），APS-II(n个=8），或对照组患者(n个=8）分别响应OKT-3或PHA刺激。OKT-3刺激的p值如下（A）：**=0.0078（正常供者），**=0.078（对照组）；对于PHA刺激：**=0.002（正常供者），**=0.0078（对照患者）。（C） CD4增殖抑制率+CD25细胞−CD4应答细胞+CD25细胞+T型法规以1:1的比例从正常健康的供体(n个=10），APS-II(n个=8），或对照组患者(n个=8）。通过PHA刺激的增殖试验计算数值。**，P<0.01；*，P<0.05。（D） 抑制CD4增殖+CD25细胞−CD4应答细胞+CD25细胞+T型法规与正常供体（灰色三角形，n个=7），APS-II（黑色方块，n个=6），或对照组患者（白色圆圈，n个=6）。误差条代表SEM。（E）CD4增殖抑制百分比+CD25细胞−CD4应答细胞+CD25细胞+T型法规代表性正常供体（灰色三角形）、APS-II（黑色方块）或对照患者（白色圆圈）在>1年的时间内以1:1的比例进行。通过OKT-3刺激的增殖试验计算值。从每个研究对象（由每个时间点指示）抽取的血液分离数周至数月。（F） 确定缺陷抑制的来源。CD4增殖抑制百分比+CD25细胞−CD4应答细胞+CD25细胞+T型法规以1:1的比例。来自正常供体或APS-II患者的应答者和抑制物混合在以下组合中：APS应答者+APS抑制物（白色条），APS应答器+正常供体抑制物，和正常供体应答器+APS抑制器（斜条）。每个条形代表三个独立实验的平均值。误差条代表SEM。
接下来，我们想分析APS-II患者中抑制细胞功能缺陷与应答细胞耐药性的关系，因为在APS-II患者细胞的共培养试验中发现的调节缺陷理论上可以归因于法规（如建议）或响应细胞对T的抵抗规则-介导抑制(24)。为了测试这两种可能性，我们将APS-II患者的应答细胞与T细胞混合法规来自正常供体，反之亦然(F） ●●●●。尽管T法规正常供体适当抑制APS-II患者的反应，APS-II T法规明显不能抑制正常供体应答细胞的增殖(F） 表明增殖抑制受损明显是由于T缺陷法规而不是回应者的抵抗。
最后，我们还研究了CD4中的抑制物功能+CD25细胞高的两名APS-II代表性患者（一名持续受损，一名T完整规则功能）。FACS公司®-排序，CD25高的-表达CD4+功能失调患者的T细胞法规与正常供体细胞（32.4%对78.8%抑制PHA诱导的增殖，18.6%对68.4%抑制OKT-3诱导的增殖）或来自T完整患者的APS-II细胞相比，其抑制功能仍然受损雷格斯（未发布的数据）。在所有三名受试者中，分类的细胞呈现出与MACS分离的总CD25相似的结果+细胞。
CD4的表型特征+CD25细胞+T细胞。
进一步研究T的深层缺陷法规从APS-II患者身上，我们想检查T细胞可能的表型变化法规表面CTLA-4和膜结合TGFβ被描述为小鼠T细胞的可能介导物规则功能(2,17,25)。虽然我们可以确认这些分子在人类T细胞上的表达法规(A） ，我们没有发现APS-II T上CTLA-4或TGFβ的表面表达发生显著变化法规与正常供者或对照患者比较(A） ●●●●。此外，T的数量法规表达这些标记在各组之间没有差异(A） ●●●●。尽管在休息T时没有显著表达法规，GITR在激活时上调，并向小鼠T细胞传递负信号法规(26,27)。因此，我们还想确定静止T时GITR水平是否异常升高法规来自APS-II患者的数据可能是可以测量的。然而，我们在T细胞上没有检测到GITR的显著表达法规来自任何研究组（未公布的数据）。
（A） CD4表型分析+CD25细胞+T型法规CD4细胞表面CTLA-4、TGFβ和HLA-DR的表达+CD25细胞+T型法规与正常供体、APS-II或对照患者分离后。细线表示同型控件。所示数据代表至少两个独立实验；每个图的值表示阳性细胞的百分比。（B–D）CD4细胞凋亡率+CD25细胞−应答细胞（应答者）和CD4+CD25细胞+T型法规正常供者（B）、APS-II（C）和对照组患者（D）在单独培养基和补充IL-2的培养基中培养2天后（抑制物）。如材料和方法中所述，可以区分四个种群。所示数据代表至少三个独立实验；值表示阳性细胞的百分比。
除了这些功能相关的分子外法规表达几个激活标记。我们认为其中一个HLA-DR会引起特别关注。除了在活化的人类T细胞上表达外，HLA-DR主要位于T细胞表面法规与CD25相比−T细胞(15)。因为T细胞上的MHC II类分子已被证明参与T–T相互作用，导致靶细胞无能(28)，我们选择筛选T细胞上HLA-DR表达或密度的改变法规然而，在T法规来自正常供体、APS-II或对照患者(A） ●●●●。同样，对CD28和PD-1（共刺激家族的两个重要成员）以及Fas（CD95）的分析也没有发现差异（未公布的数据）。由于一些表型改变在触发细胞之前可能不明显，我们还测量了T细胞上的GITR和CTLA-4法规激活后。为此，我们用平板结合的OKT-3和IL-2刺激细胞7天。但同样，各组之间未检测到显著差异（未公布的数据）。
CD4细胞凋亡+CD25细胞+和CD25−退出生长因子后的T细胞。
Taams等人证明人类T法规在体外快速死亡，而CD4+CD25细胞−T细胞对提取生长因子的敏感性大大降低(14)。在培养基中添加IL-2可以提高T细胞的存活率法规在有限的范围内(14)。排除T的可能性法规APS-II或对照组患者的死亡速度比正常供者T快雷格斯，我们测量了在含有或不含IL-2的培养基中培养2天后的细胞凋亡率()。虽然我们可以证实抑制细胞比体外应答细胞死亡更快(B） ，我们没有检测到APS-II中细胞死亡的增加(C） 或控制患者细胞(D） ●●●●。这对于早期、晚期凋亡或坏死细胞死亡是显而易见的()。此外，IL-2可以拯救CD25−和CD25+我们系统中有限的细胞(B） ，但在APS-II或对照组患者的细胞中未发现缺乏救援().
APS-II的发病机制尚不清楚，导致这些患者并发多种内分泌疾病的共同发病机制尚未阐明。我们发现T的抑制功能有缺陷雷格斯在大多数APS-II患者中，我们无法检测到T细胞的显性定量或表型异常法规来自这些患者。此外，他们的凋亡行为对生长因子的撤回是完整的。然而，最近活化的CD25的污染增加+由于以下原因，可以排除T细胞。排除任何有感染症状或体征的研究对象。由于自身免疫性内分泌疾病具有器官特异性，因此不会伴随全身免疫激活。APS-II患者外周血CD25的数量没有增加+T细胞与正常供者比较。我们还通过FACS证实了抑制物功能障碍®-排序CD25高的-表达T法规此外，T法规所有研究组均具有相似的表型特征和凋亡行为。T型法规APS-II患者表现出与T患者相同的功能特征法规来自正常供体或对照患者，但抑制功能缺陷除外（即，他们对IL-2表现出类似的体外无反应性和反应性）。最后，在初步实验中，我们半定量了来自APS-II T的两个FOXP3信使RNA样本雷格斯与正常供体T相比，两者都含有类似水平的FOXP3转录物法规()尽管抑制功能有缺陷，但清楚地表明法规功能失调。有趣的是，T雷格斯另外一名患者的FOXP3水平降低。然而，还需要进一步的详细实验来证实和扩展这一发现。
FOXP3转录水平。RT-PCR后在CD4中检测到FOXP3信使RNA+CD25细胞+T型法规（S） 或CD25−应答细胞（R）。显示了分别来自两名正常供体和APS-II患者的样本。GAPDH成绩单数量如下图所示。
有缺陷的T规则APS-II患者的功能对自身免疫有广泛的影响。尽管小鼠CD4耗竭+CD25细胞+T细胞最初被证明主要引起多腺体自身免疫(18)，功能T法规似乎也能在其他各种小鼠模型中预防疾病(2)。因此，缺陷人类T规则细胞功能也可能调节其他疾病状态，如多发性硬化症或系统性红斑狼疮。关于APS-II，我们的数据为理解该综合征的发病机制提供了首次进展。因为在疾病过程的早期干预策略已被证明对器官特异性自身免疫有效(29)，这可能在未来很重要。
总之，我们已经证明CD4的持续缺陷抑制活性+CD25细胞+T型法规因此有助于更好地了解该综合征的发病机制以及可能的一般自身免疫。一旦抑制功能的分子机制被更好地描述，人类T法规最终可能改善抑制功能受损疾病的免疫调节策略。
致谢
我们感谢所有研究对象的参与。我们还感谢W.Baum博士对杂交瘤抗体洗脱的帮助，感谢E.Scherb提供的卓越技术支持，感谢Bristol-Myers Squibb提供的抗CD28单克隆抗体。
这项工作得到了临床研究跨学科中心（IZKF C13）和德国研究协会（Sonderforschungsbereich 263）对H.-M.Lorenz的资助，以及埃尔兰根-纽伦堡大学ELAN基金会对M.A.Kriegel和H.-M.Lorenz的资助（01.11.20.1）。
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