介绍
肝脏是哺乳动物体内唯一能在受伤后完全再生的器官。在功能性肝组织丧失后，例如通过手术、毒素诱导的坏死或病毒感染，静止的肝细胞重新进入细胞周期并增殖以恢复原来的肝块。这对身体至关重要，因为肝脏在代谢内稳态、各种化合物的解毒、，以及营养素的合成、储存和分泌。再生障碍有助于肝衰竭的发病机制或纤维化/肝硬化的发展(迪尔，2002).
肝部分切除术后的肝再生可分为三个阶段：启动、增殖和停止(福斯托，2000;迪尔，2002;陶布，2004年). 启动由促炎细胞因子介导，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）(福斯托，2000;迪尔，2002;Taub，2004年). 核因子κB（NF-κB）、激活蛋白1（AP-1）、信号转导子和转录激活子3（STAT3）随后的激活是G0至G1肝细胞的转变和存活(克雷斯曼等, 1995;菲茨杰拉德等, 1995;海姆等, 1997). 肝细胞增殖受不同的有丝分裂原调节，包括肝细胞生长因子（HGF）、表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子受体的配体(米德和福斯托，1989年;Steiling公司等, 2003;博罗威克等, 2004;嗯？等, 2004;米切尔等, 2005). 此外，最近的研究揭示了胰岛素样生长因子1（IGF-1）及其受体在肝切除术后肝细胞增殖中的作用(彭尼西等, 2004;Desbois-Mouthon公司等, 2006). 一旦原始肝块恢复，肝细胞就会静止，很可能是通过转化生长因子β（TGF-β）和激活素信号转导(Oe公司等, 2004).
肝脏经常遇到氧化应激，这会影响肝脏功能，导致肝细胞死亡，并干扰损伤后的再生过程(福斯托，2000;卡马塔等, 2005;施瓦布和布伦纳，2006年). 因此，严格调节肝脏细胞氧化还原平衡至关重要。NF-E2相关因子2（Nrf2）是防御氧化应激的关键因素。这种转录因子控制抗氧化蛋白质和酶的表达，这些蛋白质和酶参与有害化合物的解毒，如谷胱甘肽秒-转移酶（GST）-ya、GST-π、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）和NAD（P）H醌氧化还原酶1（NQO1）（由Jaiswal，2004年). Nrf2是转录因子“cap”n“clock”家族的成员，该家族还包括相关的Nrf1和Nrf3蛋白，以及p45 NF-E2、Bach1和Bach2（由Motohashi公司等, 2002). 这些转录因子与目标基因启动子中的顺式作用元件结合，称为抗氧化反应元件（ARE）（由阮（Nguyen）等, 2003).
Nrf2基因敲除小鼠的表型反映了Nrf2在细胞应激反应中的关键作用。随着年龄的增长，他们会患上类似于红斑狼疮的自身免疫性疾病(锂等, 2004). 即使是幼小的动物也更容易受到各种毒素的影响(Chan和Kan，1999年;陈等, 2001)Nrf2介导的基因表达缺乏会增加肝脏对癌症的易感性(拉莫斯·戈梅兹等, 2001)和皮肤(auf dem Keller公司等, 2006). Nrf2也被确定为皮肤伤口修复中的炎症调节因子，尽管缺乏Nrf2不会导致愈合受损(布劳恩等, 2002). 在这里，我们证明了Nrf2在肝脏再生和胰岛素抵抗中的新作用。
结果
Nrf2基因敲除小鼠的肝脏/体重比降低，但没有肝脏损伤
对8-10周龄Nrf2缺乏小鼠肝脏的组织学分析未发现明显异常(补充图1A). 这些动物的肝脏/体重比降低(补充图1B)，可能是由于发育过程中肝细胞增殖减少。为了测试这是否影响一般肝功能，进行了血清分析。两种基因型的动物的总蛋白和白蛋白水平相当，葡萄糖水平也没有变化。在Nrf2基因敲除小鼠中观察到总胆红素增加（归一化为肝脏重量）(补充图1C)，但两种基因型小鼠血清中天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶的活性（与肝脏重量标准化）相似(补充图1D和E). 由于这些肝脏特异性酶过度释放到血清中是肝功能障碍和损伤的标志，因此敲除动物的肝功能似乎没有严重受损。
Nrf2对肝脏再生至关重要
为了确定Nrf2在肝再生中的作用，我们将二/三肝切除模型应用于Nrf2基因敲除小鼠和野生型室友。如核糖核酸酶保护试验（RPA）所示，Nrf2 mRNA水平在野生型小鼠的正常和损伤肝脏中相似，而在基因敲除小鼠中检测不到。Nrf1在正常肝脏和肝切除术后也表达，但在缺乏Nrf2的情况下没有上调。在两种基因型的小鼠中均未检测到Nrf3 mRNA(补充表1).
组织学分析和嗜脂蛋白染色显示，肝切除术后正常观察到的短暂脂肪变性对再生很重要(Shteyer公司等, 2004)在肝切除术后48小时，Nrf2基因敲除小鼠中加重(). 通过5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）掺入研究，我们发现Nrf2基因敲除动物的肝细胞增殖明显延迟(). 在这两种基因型的小鼠中，在未受损的肝脏和肝切除术后6 h仅检测到极少数增生的肝细胞。即使在损伤后24小时，也只有不到1%的肝细胞合并了BrdU（数据未显示）。肝切除术后48小时，增殖达到高峰，但Nrf2基因敲除小鼠的增殖高峰比野生型动物低得多（21.3%的BrdU阳性细胞对13.36%的敲除小鼠；;P（P）=0.0057,n个⩾8). 损伤后72小时，与野生型动物相比，基因敲除小鼠中BrdU标记细胞的数量仍然较低(;P（P）=0.0931,n个=6），尽管差异不再具有统计学意义。在第5天，野生型小鼠的增殖几乎完成，而Nrf2缺陷的肝细胞在此时间点继续增殖(;P（P）=0.0111,n个=7). 两种基因型小鼠损伤后第7天的BrdU阳性肝细胞百分比均小于1%（数据未显示）。与这一发现一致，在肝切除术后第7天，野生型和敲除型小鼠的肝脏/体重比率几乎恢复到损伤前的水平。这些发现表明，Nrf2缺乏小鼠的肝脏可以再生，尽管有明显的延迟。
Nrf2缺乏小鼠的肝脏再生受损。(A类)肝切除术后48小时，用苏木精/伊红染色Nrf2基因敲除小鼠（ko）和野生型（wt）同胞的肝脏切片。箭头表示肝细胞中的脂滴。(B类)增殖通过BrdU掺入进行评估。显示了损伤肝脏的代表性切片（肝切除术后48小时）。(C类)增殖细胞的百分比通过在×200倍放大镜下计数每个肝脏3-5个独立的显微镜视野来确定，n个（小鼠数量）>6只/基因型和时间点。(D类)冰冻切片染色以检测裂解半胱天冬酶-3。肝切除术后6小时染色细胞的百分比通过计数3-5个独立的显微镜视野（×，n个=每个基因型4个）。条形代表平均值±标准误差。；*P（P）<0.05;**P（P）<0.01.
Nrf2基因敲除小鼠肝再生受损不是由于主要肝细胞有丝分裂原表达减少所致
为了确定Nrf2基因敲除小鼠肝细胞延迟增殖是否是由于参与肝脏修复的生长因子和细胞因子表达减少所致，我们通过RPA分析了它们的表达。在不同动力学的再生过程中，HGF、TGF-α和TGF-β1 mRNA水平瞬时升高，但在敲除小鼠和野生型小鼠之间没有观察到差异(补充表1). 与这些发现一致的是，在肝切除术后的所有阶段，野生型和敲除型小鼠的EGF和HGF受体（c-Met）的磷酸化（反映了它们对配体结合的激活）是相当的(补充图2A和B). IGF-1和血管内皮生长因子在正常和受损肝脏中高表达，但这些生长因子的mRNA水平不受肝切除术或基因型的影响(补充图1). 在所有时间点，野生型和基因敲除小鼠的血清中IGF-1水平普遍较高。与野生型小鼠相比，基因敲除小鼠的血清水平略低，但这一差异在统计学上并不显著，也可能反映了较低的肝脏重量(补充图2C). 最后，两种基因型小鼠损伤后，IL-6和TNF-αmRNA水平均轻度升高(补充表1).
Nrf2基因敲除小鼠肝损伤后肝细胞凋亡增强
在病理条件下，肝切除术后肝细胞凋亡增强(马利等, 2006;施瓦布和布伦纳，2006年). 半胱天冬酶-3裂解染色显示，两种基因型的非损伤肝脏和假手术小鼠肝脏中只有少量凋亡细胞（数据未显示）。然而，肝切除术后6小时，Nrf2基因敲除小鼠的凋亡细胞数量增加了5倍(P（P）=0.0159,n个=4）与野生型对照相比(). 在肝切除的肝脏中未检测到坏死区域，这与基因型无关（数据未显示）。
Nrf2基因敲除小鼠正常肝脏和肝切除肝脏中Nrf2靶基因表达减少
接下来，我们分析了Nrf2基因敲除小鼠正常和损伤肝脏中主要Nrf2靶基因的mRNA水平。Nrf2基因敲除小鼠静息肝脏中GST-ya、NQO1和GST-π的表达在较小程度上降低。野生型动物肝切除术后48-120小时内，观察到GST-ya和NQO1表达的诱导，以及GST-πmRNA水平的轻微增加，但在Nrf2缺乏小鼠中的程度要小得多(和补充表1). 编码谷胱甘肽生物合成速率限制酶催化亚单位（GCLC）的RNA水平在肝切除术后48小时在野生型肝脏中轻微诱导，但在Nrf2基因敲除小鼠中没有诱导(和补充表1). 血红素氧化酶-1（HO-1）、过氧化物酶类（Prdx）1和6的表达不受Nrf2缺失的影响(补充表1).
Nrf2敲除小鼠的正常和肝切除肝脏中Nrf2靶基因的mRNA水平降低和氧化应激增强。(A类)通过RPA分析编码Nrf2靶基因的转录物的总细胞RNA（每个时间点和基因型至少四只小鼠的混合肝脏中的10μg）。每个车道顶部标明肝切除或假手术后的时间；0h表示肝脏处于静止状态，在肝切除术中被切除；20μg tRNA作为阴性对照，1000 c.p.m.的杂交探针用作大小标记。与GAPDH核糖探针杂交作为负荷控制。显示了两个独立实验的代表性放射自显影图。(B类)在部分肝切除术后72小时，检测静息和受损肝脏的总裂解物的GST活性。用分光光度法测定谷胱甘肽/1-氯-2,4-二硝基苯共轭物的形成。条形代表平均值±标准误差。；**P（P）<0.01 (n个=6). (C类)分析肝细胞的GST活性。条形代表平均值±标准误差。；*P（P）<0.05;**P（P）<0.01 (n个=6). (D类)用DEH对未损伤和损伤肝脏（肝切除术后72小时）新鲜制备的冰冻切片（7μm）进行染色，并用荧光显微镜进行分析(n个⩾5). (电子)用H处理Nrf2基因敲除小鼠和野生型小鼠的原代肝细胞2DCFH-DA和流式细胞术分析细胞内ROS水平。
为了确定肝脏中Nrf2靶基因的全谱，我们对年轻野生型和基因敲除小鼠未受损肝脏的RNA进行了微阵列分析。在Nrf2基因敲除小鼠的肝脏中，我们发现一些GST和NQO1的表达降低，而GCLC、HO-1、Prdx 1和6的表达水平相似。因此，两种独立的方法显示了已知Nrf2靶基因的差异表达。此外，微阵列分析确定了Nrf2基因敲除小鼠肝脏中参与药物代谢和解毒的几种酶的差异表达(补充表2). 完整的微阵列数据可以从GEO存储库下载：(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？token=tvwphcsycaqgcti&acc=GSE8969).
与mRNA数据一致，与对照组相比，Nrf2基因敲除小鼠静息肝脏中GST活性降低了36%，肝切除术后72小时降低了26%(). 在Nrf2缺陷小鼠培养的原代肝细胞中也观察到GST活性降低()表明肝细胞受到直接影响。
Nrf2缺乏小鼠肝脏氧化应激增加
随后，我们用二氢乙硫胺（一种氧化后嵌入DNA的染料）对肝脏进行染色，从而监测氧化应激体内在Nrf2基因敲除小鼠的肝脏中观察到核染色，而野生型动物的肝脏仅显示弱荧光(). 两种基因型的动物在肝切除术后72小时染色细胞核数量增加(下面板），Nrf2缺乏小鼠的染色更强。
这一发现通过新鲜分离的肝细胞进行生化验证。细胞与H一起孵育2DCFH-DA，由细胞内ROS转化为荧光衍生物DCF。后者通过流式细胞术检测。Nrf2基因敲除小鼠的肝细胞显示出强烈的荧光增强，反映了细胞内ROS水平的增加(). 这些结果表明，Nrf2是正常和肝切除肝脏中细胞氧化还原平衡的重要调节器，并证明Nrf2缺乏会导致肝细胞的慢性氧化应激，而肝损伤会进一步加剧这种应激。
Nrf2基因敲除小鼠再生肝脏中MAPK信号改变
为了阐明Nrf2缺乏小鼠肝再生受损的机制，我们首先分析了NF-κB、STAT3和AP-1转录因子复合物的损伤诱导激活。在静息肝脏中，两种基因型的动物都观察到NF-κB p65亚单位的细胞质染色(补充图3A). 肝切除术后3小时，NF-κB主要定位于肝细胞核，野生型和Nrf2缺乏小鼠之间未观察到差异(补充图3A). 此外，IKK-β（至少部分负责NF-κB活化）在野生型和敲除型小鼠中的表达水平相似(补充图3B). 然而，EMSA实验表明，肝切除术后3和6小时，NF-κB在Nrf2缺乏小鼠肝脏中的激活程度更强(补充图3C). 这一发现与氧化应激增强相一致，氧化应激增强可导致NF-κB活化(施雷克等, 1991). NF-κB提高肝切除术后肝细胞的存活率(吕德等, 2006)在Nrf2基因敲除小鼠中，其激活很可能是一种补偿作用，以减少细胞死亡的程度。
在两种基因型的动物肝切除术后3和6小时，与在肝切除术中切除的静止肝脏相比，观察到STAT3的Tyr705磷酸化强烈增加，这反映了STAT3激活(补充图4). 相反，总STAT3水平没有受到影响(补充图4). 因此，在肝切除术后Nrf2敲除小鼠中，STAT3活性显然没有改变。作为一个额外的对照，我们分析了混乱操作小鼠中STAT3的激活情况。后者接受了腹部手术和肝脏操作，但没有进行肝切除术。在假手术小鼠中，两种基因型小鼠的STAT3激活程度相似，很可能反映了应激反应(补充图4).
野生型小鼠肝切除术后3和6小时p38磷酸化明显。有趣的是，在三个独立的实验中，Nrf2基因敲除小鼠肝切除后3和6小时内，磷酸化p38的水平显著低于野生型小鼠()（伤后3小时平均减少39%，伤后6小时平均减少43%）。Erk磷酸化无差异(). 使用一种识别JNK1和JNK2的54和46kDa变异体磷酸化形式的抗体，我们发现肝切除术后3和6小时内这两种变异体的磷酸化程度都高于对照窝友(). 然而，这并没有导致AP-1异常激活，正如两种基因型小鼠中磷酸化c-Jun水平相似所表明的那样()和EMSA所证明的肝切除术后3和6小时内AP-1 DNA结合活性的相似诱导(). 这可能是由于细胞核和细胞质中MAPK磷酸酶的不同活性所致(吴等, 2006). 假手术不影响Erk、JNK和c-Jun的磷酸化状态。虽然p38也被假手术激活，但激活与基因型无关。
Nrf2基因敲除小鼠损伤肝脏中JNK和p38激活发生改变，但AP-1活性正常。(A类,B类)通过免疫印迹法分析Nrf2基因敲除小鼠和野生型小鼠（肝切除后每个时间点至少四只小鼠的混合肝脏和基因型）肝裂解液中的总蛋白（60μg），以了解磷酸化和总Erk、p38和JNK（A）以及磷酸化c-Jun（B）的水平。用GAPDH或Lamin A抗体染色膜作为负荷控制。显示了两个独立实验中的代表性斑点，以及不同肝切除实验中的裂解物。(C类)将含有AP-1结合位点的放射性标记寡核苷酸与来自正常和肝切除肝脏的总蛋白裂解物（20μg）孵育，并进行EMSA。添加过量的非标记寡核苷酸（标记的通道：冷组分）抑制迁移率转移，而添加带有突变AP-1结合位点的非标记的寡核苷酸则没有影响（标记的车道：多冷组分。）。
部分肝切除后Nrf2基因敲除小鼠PI3激酶/Akt信号减少
在Nrf2缺乏小鼠中，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）调节亚单位p85α及其靶点Akt的表达没有改变。然而，Akt（Ser473）的磷酸化导致其活化，发生在野生型小鼠肝切除术后3小时内。然而，此时点，敲除小鼠的磷酸化Akt水平显著降低（在四个独立实验中平均降低48%）(,和7D）。与这些发现一致，Akt靶向糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）在Ser9的磷酸化减少（肝切除术后3小时减少56%；肝切除术6小时减少63%）(). 此外，PI3K信号的两个主要靶点p70/S6K和Bad在Nrf2基因敲除小鼠受损肝脏中显示出磷酸化降低()（pS6K：3小时或6小时后分别减少34和60%；pBad：3小时后减少56%）。由于PI3K、Akt及其下游靶点对细胞生存和增殖至关重要(劳勒和阿莱西，2001年;歌曲等, 2005)该通路的激活减少可能解释了在Nrf2缺乏小鼠中观察到的肝再生缺陷，也可能解释了肝切除术后细胞死亡增加的原因。
Nrf2基因敲除小鼠受损肝脏中PI3K/Akt信号通路的激活减少。通过免疫印迹法分析Nrf2基因敲除小鼠和野生型小鼠（肝切除后每个时间点至少四只小鼠的混合肝脏和基因型）肝裂解液中的总蛋白（60μg），以检测PI3K p85α亚单位、磷酸化和总Akt、GSK-3β和S6激酶的水平(A类)，非磷酸化和磷酸化Bad，GAPDH和Lamin A(B类). 显示了两到四个实验中的代表性斑点，以及不同肝切除实验中的裂解物。
Nrf2基因敲除小鼠受损肝脏中IGF-1R/IR信号减少。(A类)通过免疫印迹法分析Nrf2基因敲除小鼠和野生型小鼠肝切除后不同时间点的肝裂解物（60μg蛋白）的总IGF-1R和IR、磷酸化IGF-1R/IR、磷酸化和总Akt、磷酸化IRS-1/2（Tyr608）和总IRS-1以及GAPDH的水平。显示了用来自不同肝切除术实验的裂解物进行的两到三个实验的代表性印迹。(B类)使用IR抗体对Nrf2缺乏小鼠和野生型小鼠损伤肝脏（肝切除术后3 h）的总肝裂解物进行免疫沉淀。使用IR或pIR/IGF-1R抗体对沉淀进行免疫印迹分析。
Nrf2缺乏小鼠受损肝脏中胰岛素/IGF-I受体信号受损
接下来，我们想知道导致PI3K和p38活性降低的上游信号。由于大多数肝细胞有丝分裂原仅在再生的后期表达(补充表1)我们推测IGF-1的表达或信号可能受到影响。众所周知，IGF-1能有效激活PI3K/Akt信号通路，也能激活p38(Cheng和Feldman，1998年). 使用识别IGF-1受体（IGF-1R）和胰岛素受体（IR）磷酸化形式的抗体，我们发现野生型小鼠肝切除术后3小时内磷酸化形式水平显著增强，而Nrf2基因敲除小鼠的磷酸化程度要低得多（在两个独立实验中分别降低71%和73%）。IGF-1R/IR的磷酸化与pAkt水平密切相关。在正常和肝切除的肝脏中检测到高水平的IR和低得多的IGF-1R，它们在修复过程的各个阶段的水平都相似(). 这表明配体依赖性激活或去磷酸化，尤其是IR，都受到Nrf2缺乏的影响(). 与这一假设相一致，分别用抗IR或IGF-1R抗体进行免疫沉淀，然后用抗pIR/IGF-1R抗体进行western blotting，结果表明主要是IR，它在肝脏中表达，并在肝切除后激活，并且在缺乏Nrf2的情况下，该受体的激活减少(). 相反，虽然相同的抗体能有效地从培养的人肝癌细胞中沉淀IGF-1R（数据未显示），但只能沉淀极低水平的IGF-1R。
与降低的IR活性一致，敲除动物的磷酸化IR底物1（IRS-1）（Tyr608对应于人类IRS-1中的Tyr612）和pIRS-2水平降低(). IRS-1中Tyr608的磷酸化和IRS-2中相应的残基反映了它们的活化(布洛赫·达姆蒂等, 2006). 这些发现表明IR信号受损，导致PI3K活性降低。
氧化应激降低肝细胞的胰岛素反应性
为了确定IGF-1R/IR和PI3K信号的异常是氧化应激增强的结果还是与Nrf2的不同活性有关，我们用葡萄糖氧化酶（GO）处理野生型小鼠的原代小鼠肝细胞2小时，产生氧化应激，葡萄糖氧化酶持续产生细胞内ROS。随后用胰岛素处理细胞。胰岛素治疗后，IGF-1R/IR和Akt的磷酸化被强烈激活(). GO治疗以剂量依赖的方式降低Akt激活。然而，IGF-1R/IR受体的磷酸化不受GO的影响，进一步表明ROS介导的胰岛素抵抗是在受体下游水平介导的，很可能是在IRS水平。
氧化应激损伤肝细胞中胰岛素诱导的Akt活化。用50或100 mU/ml GO预处理野生型小鼠的原代小鼠肝细胞2小时，然后用100 nM胰岛素刺激15分钟。通过30μg总蛋白与IGF-1R/IR和Akt的磷酸特异性抗体的免疫印迹来监测IGF-1R/IR信号的激活。用总Akt和GAPDH抗体染色膜作为对照。显示了三个实验中的代表性斑点。
这些在体外研究结果强烈表明，Nrf2缺陷小鼠肝细胞中氧化应激的增强是抑制IGF-1R/IR-PI3K-Akt信号通路的直接原因。为了进一步验证这一假设，对野生型和Nrf2基因敲除小鼠的原代肝细胞进行培养、血清饥饿，然后用胰岛素治疗。与Nrf2缺陷细胞中增强的氧化应激一致（见)，敲除小鼠细胞中Akt的磷酸化几乎完全被消除(; 与野生型小鼠细胞相比，胰岛素治疗15分钟后减少82.7%，30分钟后减少91.3%，n个=4). 此外，胰岛素治疗后发生的IRS-1与PI3K（p85α亚单位）的关联在Nrf2缺陷细胞中减少（与野生型小鼠的细胞相比减少了50%）(). 相反，IR磷酸化不受影响(). western印迹法或免疫沉淀法以及western blotting法在原代肝细胞中几乎检测不到IGF-1R的表达（数据未显示）。这些结果是在两个独立的实验中获得的。在缺乏Nrf2的情况下，PI3K与IRS-1的关联性降低，也证实了体内情况。因此，与野生型小鼠相比，Nrf2基因敲除小鼠（肝切除后3小时）损伤肝脏中PI3K与IRS-1的关联性显著降低()在三个独立的实验中。总之，这些结果提供了Nrf2缺乏、氧化应激和胰岛素抵抗之间的联系，并证明氧化应激诱导的胰岛素/IGF抵抗是在IRS水平上介导的体内在培养的原代肝细胞中。
肝细胞中的Nrf2缺乏会导致胰岛素抵抗。(A类)对Nrf2基因敲除小鼠或野生型小鼠的原代肝细胞进行血清饥饿处理，并用100 nM胰岛素治疗指定时间。使用IGF-1R/IR和Akt的磷酸特异性抗体或总IR、Akt和GAPDH的抗体，通过western blotting分析蛋白裂解物（40μg）。显示了四个独立实验的代表性斑点。(B类)对Nrf2基因敲除小鼠或野生型小鼠的原代肝细胞进行血清饥饿处理，并用胰岛素治疗15分钟。用IR抗体对裂解液进行免疫沉淀，用IR或pIR/IGF-1R抗体对沉淀进行免疫印迹分析。(C类)或者，用IRS-1抗体对裂解产物进行免疫沉淀，并通过免疫印迹法监测IRS-1与PI3K-p85α的关联（上面板）。为了确保负载相等，通过蛋白质印迹分析30μg用于免疫沉淀的裂解物的总IRS-1、PI3K-p85α和GAPDH水平（下图）。显示了两个独立实验的代表性斑点。(D类)在肝切除术后3小时采集Nrf2基因敲除小鼠和野生型对照动物的肝脏样本。用IRS-1抗体免疫沉淀裂解液。通过蛋白质印迹分析沉淀中是否存在PI3K（p85α亚基）。沉淀物中IRS-1水平的分析作为对照。此外，在免疫沉淀前分析裂解液中IRS-1、PI3K（p85α亚单位）、p-Akt和GAPDH的水平（输入：下图所示的western blots）。显示了三个实验中的代表性斑点。
讨论
Nrf2：肝细胞中一种重要的氧化还原调节因子
在本研究中，我们证明了Nrf2在肝脏再生中的新作用。这种转录因子的缺乏会导致正常肝脏，尤其是受损肝脏的氧化应激增强。因此，除了NF-κB(Schwabe和Brenner，2006年)，Nrf2是肝细胞内氧化还原平衡的另一个主调节器。Nrf1也参与肝脏ROS解毒。在肝脏发育过程中，它是肝细胞存活所必需的(陈等, 2003). 此外，成年肝脏中缺乏Nrf1的小鼠显示肝细胞中ROS水平升高。他们还出现严重脂肪变性和自发性肝癌(徐等, 2005)，在Nrf2缺乏小鼠中未观察到该表型。因此，Nrf1和Nrf2显然是肝细胞中重要的氧化还原调节因子，具有部分重叠，但也具有各自不同的功能。在未来，确定肝脏中两种转录因子丢失的后果将是有趣的。
氧化应激导致受损肝脏胰岛素/IGF-1抵抗
Nrf2基因敲除小鼠肝脏中的氧化应激增强伴随着严重的肝再生缺陷。鉴于本研究中所述的结果和先前发表的数据，我们提出了一个Nrf2在肝再生中作用和机制的模型，如图所示.
Nrf2在受损肝脏中的作用示意图。Nrf2诱导ROS解毒酶的表达，从而阻止ROS的积累。其缺乏导致氧化应激，导致IRS-1和-2的酪氨酸磷酸化降低，很可能是通过ROS激活的JNK和其他可能的Ser/Thr IRS激酶。由于IRS-1的酪氨酸磷酸化是PI3K激活所必需的，因此Akt和下游靶点的磷酸化减少。
Nrf2缺乏会降低正常肝脏和肝切除术后ROS脱毒酶的表达，导致肝细胞氧化应激(). 我们对培养的原代肝细胞进行的实验表明，ROS直接导致胰岛素/IGF信号的损伤以及随后PI3K-Akt通路的抑制(和). 这一结果与脂肪细胞的最新数据相一致，脂肪细胞的数据表明活性氧在胰岛素抵抗中起因果作用(侯斯蒂斯等, 2006). 值得注意的是，慢性氧化应激（已经存在于Nrf2缺乏小鼠的非损伤肝脏中）似乎是表型异常的主要原因。因此，在损伤后的几个小时内，即Nrf2靶基因上调之前，就可以看到胰岛素/IGF信号传导的缺乏(). Nrf2基因敲除小鼠原代肝细胞中胰岛素介导的Akt活化受损进一步加强了这一假设，而这些小鼠未经ROS预处理。这些结果提供了Nrf2缺乏、慢性氧化应激和胰岛素/IGF-1抵抗之间的联系。
活性氧对IGF-1R/IR信号传导的抑制作用是通过活性氧激活激酶介导的，而激酶又在丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化IRS-1和-2。由于IRS与受体和PI3K分离，导致胰岛素/IGF抵抗（由Zick，2005年;森野等, 2006). 这种机制很可能也是Nrf2缺陷肝细胞胰岛素/IGF-1抵抗的原因，因为在Nrf2基因敲除小鼠培养的原代细胞中，IRS-1和PI3K之间的联系以及随后对胰岛素反应的Akt激活被抑制，而IR磷酸化正常发生(). 因此，活性氧的抑制作用明显发生在受体下游，最有可能发生在IRS-1和/或IRS-2。负责的IRS激酶之一可能是JNK，它被激活以响应ROS(文丘拉等, 2004;卡马塔等, 2005). 与此假设一致，我们发现损伤肝脏中JNK的激活增强(). JNK可以在Ser307磷酸化IRS-1（人类IRS-1中的Ser312），从而通过胰岛素或IGF-1受体抑制其在Tyr608（人类IRS1中的Tyr612）的磷酸化(阿吉雷等, 2002). 通过这一机制，JNK是胰岛素抵抗的重要介导者体内(平须美等, 2002). 尽管在我们使用市售抗体的实验条件下，我们无法检测肝脏中IRS-1的Ser307磷酸化，但在Nrf2敲除小鼠的肝切除肝脏中，IRS-1的Tyr608和IRS-2中相应位点的磷酸化显著降低()GO还阻止了人HepG2肝癌细胞系中该位点的胰岛素介导的磷酸化（数据未显示）。
除JNK外，其他IRS激酶可能参与抑制Nrf2缺陷肝脏中的胰岛素信号传导。我们的体内结果(补充图3B)反对另一种主要IRS激酶IKK-β的作用(蔡等, 2005)-，但可能涉及其他激酶，例如蛋白激酶Cζ和其他(Zick，2005年)尚待确定。IRS的丝氨酸/苏氨酸磷酸化与负责的激酶无关，似乎可能与Nrf2基因敲除小鼠受损肝脏中的瞬时胰岛素/IGF抵抗有关。
与对照组相比，Nrf2基因敲除小鼠受损肝脏中的酪氨酸磷酸化，尤其是IR也严重降低(). 这种差异不太可能是Nrf2基因敲除小鼠配体可用性降低所致，因为两种基因型小鼠肝脏中IGF-1的mRNA水平相似(补充表1). 在缺乏Nrf2的动物中，IGF-1蛋白的血清水平略有降低，但在这两种基因型的动物中都存在高浓度(补充图2C). 肝切除术后血清胰岛素水平显著下降(Michalopoulos和DeFrances，1997年)表明胰岛素与受损肝脏中IGF-1R/IR受体磷酸化增加无关。相反，IGF-1可能在肝切除术后从结合蛋白中释放，并特别激活两种基因型小鼠的IR。然而，Nrf2基因敲除小鼠IRS-1和-2磷酸化状态的改变（丝氨酸/苏氨酸增强和酪氨酸磷酸化降低）减少了它们与受体的联系(布洛赫·达姆蒂等, 2006). 这可以使受体更容易受到抑制性磷酸酶的影响，尤其是体内.
胰岛素/IGF-1抵抗损害受损肝脏中抗凋亡和促细胞信号通路的激活
我们认为胰岛素/IGF-1信号的减少至少是再生缺陷的部分原因。这一假设与IGF-1R缺乏动物的延迟肝再生相一致(Desbois-Mouthon公司等, 2006). IR活化受损和IRS-1酪氨酸磷酸化降低可能是Akt和p38磷酸化降低的原因，因为IRS-1的Tyr608磷酸化对这两条信号通路的激活至关重要(Cheng和Feldman，1998年;布洛赫·达姆蒂等, 2006).
p38激活减少的作用()再生缺陷与最近一项研究的结果一致，在该研究中，用p38抑制剂对大鼠进行系统治疗可抑制肝部分切除术后肝细胞的细胞周期进入(徐等, 2006). 另一方面，c-Jun基因敲除小鼠中p38磷酸化的增强和延长导致增殖减少和死亡率增加(斯谛普虐克等, 2006)这表明需要严格控制受损肝脏中该信号蛋白的水平/活性。
最重要的是，Nrf2基因敲除小鼠在损伤后早期表现出Akt激活的强烈降低(,和). 因此，Akt靶向GSK-3β、p70/S6激酶和Bad的磷酸化也被降低(). 因为后者对细胞增殖和生存至关重要(劳勒和阿莱西，2001年)，观察到的其激活异常可能进一步导致Nrf2敲除小鼠的肝脏再生延迟。
Nrf2：改善肝再生和治疗胰岛素抵抗的新靶点
总之，我们的结果首次证明了Nrf2在组织修复中的关键作用。他们还揭示了与肝脏中Nrf2缺乏相关的氧化应激会导致肝切除术后短暂的胰岛素/IGF-1抵抗。虽然肝切除术后几天内Nrf2靶基因的表达增加表明Nrf2至少部分激活，但对ARE报告小鼠的初步研究(约翰逊等, 2002)研究表明，Nrf2仅在受损肝脏的一小部分肝细胞中激活。此外，在患病肝脏中，Nrf2的激活可能不足。因此，Nrf2的药理激活，例如通过合成三萜类或鸟苷(哈诺塞克等, 2001;海尔等, 2005;利比等, 2005)这可能是一种有希望的新策略，可以改善急性或慢性肝损伤患者的再生。最后，Nrf2活化能否用于胰岛素抵抗的治疗值得探索。
材料和方法
动物
Nrf2基因敲除小鼠(Chan和Kan，1999年)根据联邦指导方针，对野生型同窝仔进行饲养。动物实验已获得瑞士苏黎世当地兽医局的批准。
二次三分之一肝切除术
雄性小鼠（8至10周龄）通过腹腔注射氯胺酮（100μg/g体重）/甲苯噻嗪（5μg/g重量）进行麻醉，并接受三分之二肝切除术(Steiling公司等, 2003). 手术后，向小鼠注射丁丙诺啡（Temgesic；瑞士伯尔尼Essex Chemie AG；0.1μg/g体重）。在受伤后的不同阶段，他们被一氧化碳安乐死2吸入，收获剩余肝脏。将未受伤小鼠的静息肝脏和手术中切除的肝脏作为对照。对于假手术，如上所述对小鼠进行麻醉，打开腹部，短暂地将肝叶从腹腔中取出，但随后将其放回原位。
肝细胞分离、细胞培养及GO和胰岛素治疗
通过静脉注射戊巴比妥（Eutha 77；Essex Chemie AG；2.5 mg/10 g）杀死雄性小鼠（8至10周龄），戊巴比妥溶解在含有1000 IE肝素/ml的等渗盐水中。通过两步胶原酶（Sigma；0.5 mg/ml）灌注法分离原代肝细胞(嗯？等, 2004)然后通过离心纯化（200克)Percoll（德国布伦瑞克阿默沙姆）的等密度净化。细胞被涂布在涂有胶原蛋白R（德国海德堡Serva；0.2 mg/ml）的培养皿上，培养皿置于Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM；4500 mg/l葡萄糖；Sigma）中，补充10%胎牛血清（瑞士奥尔施维尔BioConcept），100μg/ml卡那霉素，密度为4×104/厘米2然后将培养基改为含有卡那霉素的无血清DMEM。在无血清培养基中培养16小时后，分析GST活性或用于DCF测量。在信号实验中，他们需要断奶16小时，然后用100 nM胰岛素治疗15–30分钟，并通过免疫印迹法或免疫沉淀法进行分析（参见补充数据有关程序和抗体信息的说明）。
为了确定氧化应激的影响，用GO（Sigma；50或100 mU/ml）预处理血清饥饿的小鼠原代肝细胞2小时，用预加热的PBS冲洗两次，然后用100 nM胰岛素（Sigma-）在DMEM中处理15或30分钟，并采集进行western blot分析。
流式细胞术
培养的肝细胞负载2,7-二氯荧光素二乙酸酯（H2DCF-DA）（100μmol/l；分子探针）30分钟。该细胞渗透性化合物转化为非荧光产物（H2DCF）经胞内酯酶脱乙酰化后氧化为高荧光二氯荧光素（DCF）。对细胞进行胰蛋白酶化，用PBS洗涤，并在FACSCalibur流式细胞仪（BD Bioscience，San Jose，CA）上进行分析。
盐酸二氢乙硫胺染色
用2μm盐酸二氢乙啶（DEH）（分子探针）在37°C下对新鲜切割的冷冻肝脏切片（7μm）进行30分钟染色，并通过荧光显微镜进行分析。
GST活动分析
将培养的原代肝细胞或肝组织在100 mM磷酸钾（pH 7）中溶解，其中含有2 mM EDTA，并测定蛋白质含量。在含有100 mM磷酸钾（pH 6.5）、0.1%Triton X-100（v/v）、1 mM谷胱甘肽和1 mM CNDB的缓冲液中测定对1-氯-2,4-二硝基苯（CNDB）（Sigma）的酶活性。在340 nm的分光光度计中测量谷胱甘肽/CNDB共轭物的形成。
统计分析
使用Prism4统计程序进行统计分析。P（P）-值是双尾的，使用Mann–Whitney公式计算U型-测试。
