神经元钙传感器恢复素的膜结合——带电羧基末端的调节作用

摘要

背景

许多在信号转导中起关键作用的蛋白质携带共价连接的脂肪酸基团。这些翻译后修饰促进了膜的结合，参与了蛋白质从细胞质到膜的转运，或在蛋白质构象变化过程中充当变构调节剂[1-4]. 在许多信号蛋白中发现的一种常见修饰是肉豆蔻酰基，这是一种共价连接到氨基末端Gly残基的C14长脂肪酸链。在许多蛋白质中，肉豆蔻酰基团改变其相对于多肽链的位置或方向，从而参与肉豆蔻酰的开关机制[2-4]. 该开关可由外部信号触发，例如磷酸化、GTP-或Ca²⁺-绑定[5]. 带有肉豆蔻酰基团的短肽的系统研究以及与酪氨酸激酶等蛋白质的比较型钢混凝土揭示了蛋白质与膜的高亲和力结合（即低离解率）需要静电和疏水力的结合[6,7]. 虽然疏水作用来自肉豆蔻酰基团，但静电驱动力来自蛋白质中的正电荷和脂质双层中酸性磷脂的负电荷的相互作用。在型钢混凝土激酶是一簇带正电的氨基酸，位于前15个氨基酸末端，靠近肉豆蔻酰基团，从而允许src激酶与磷脂膜的高亲和力相互作用。另一个研究良好的例子是肉豆蔻酰化丙氨酸丰富的C激酶底物，称为MARCKS，它含有一簇由150个氨基酸从氨基末端肉豆蔻醇基团中分离出来的碱性残基[8-11].

回收素，a Ca²⁺-属于神经元钙传感器（NCS）蛋白组的结合蛋白在感光细胞中起钙传感器的作用[12]. 它含有两种功能性钙²⁺-结合位点（EF-hand 2和3），而第一和第四EF-hand不结合Ca²⁺微摩尔或亚微摩尔[Ca²⁺]. 回收蛋白也在其氨基末端和钙处进行肉豆蔻酰化²⁺-游离（apo）形式的回收蛋白将肉豆蔻酰尾巴埋在疏水口袋中。相反，Ca²⁺-结合形式将肉豆蔻酰尾部暴露到溶剂空间或磷脂双层中[13-15]. 两个Ca的顺序结合²⁺对第三和第二EF-hand进行了彻底调查[16-18]一些结构研究有助于对钙的机械理解²⁺-分子水平上的肉豆蔻酰开关[14,15,19-22]. 10年前就已经认识到，与src-激酶与膜的结合相比，恢复素与膜的连接较弱[23]. 它的表观K_D类（或EC₅₀)对于脂质膜在2.6×10之间^-5和10^-4M（M）[17,23]，略低于肉豆蔻酸甘氨酸的吉布斯自由结合能（测定为10^-4M（M）[6])因此，这表明回收蛋白与膜的静电相互作用的贡献很小，但很重要。

恢复素在肉豆蔻酰尾部附近的氨基末端缺乏一簇正电荷；相反，它的羧基末端含有一簇带电残基。一项固态核磁共振研究表明，当肉豆蔻酰化的Retrovirin附着在脂质双层上时，羧基末端的正电荷不会与磷脂相互作用[22]，但从生物化学研究中得出了不同的结论，即带电荷的羧基末端参与了回收蛋白与膜的静电相互作用[24]. 最近使用截断恢复形式（Rc^2–190)已经证明，缺乏这种高电荷蛋白质区域会改变钙²⁺-恢复素的亲和力以及由此产生的其他钙²⁺视紫红质激酶的膜结合和抑制等依赖性性质[25]. 因此，该区域被认为是钙的内部调节剂²⁺-灵敏度。

加利福尼亚州²⁺-恢复素与生物膜的依赖性结合也受脂质组成的影响。例如，富含胆固醇的膜，因为它们也存在于棒外段制剂的耐洗涤剂膜贴片中，有助于恢复素的膜结合[26].

本工作的目的是研究1）回收蛋白的膜结合如何受到脂质成分的影响2）静电相互作用如何最终促进回收蛋白的薄膜结合，3）回收蛋白带正电的羧基末端如何影响任何膜结合。我们测试了回收蛋白与不同油脂混合物的结合，其中带电分子与不带电分子的比率不同。此外，我们使用了recoverin Rc的截断突变^2–190缺乏用于脂质结合实验的WT形式的高电荷羧基末端。

结果

疏水和静电相互作用有助于肉豆蔻酰化回收蛋白与脂质的结合

通过挤压技术制备具有不同脂质组成的脂质体，并用于平衡离心分析，以测试肉豆蔻酰化WT回收蛋白的结合（图。​（图1）。1). 当比较不同的脂质混合物时，结合回收素的量差异显著；当使用由PE、PC或PE-PC组成的纯脂质层时，其含量相当低。将带电磷脂（PS）引入到脂质混合物中，略微增加了结合WT回收量；然而，纯PS脂质体与PE、PC和PE-PC的结合较低。相反，胆固醇的存在导致结合回收率的增加（图右侧的两个柱）。​图1），1)这与之前关于胆固醇对恢复素膜结合作用的观察结果一致[26]. PS将负净电荷引入到脂质混合物中。当我们系统地增加PS在脂质混合物中的百分比时，膜结合回收蛋白的量不断增加，在PS的60%时达到最大值（图。​（图2，2，填充圆）。PS的进一步增加导致结合恢复素的量急剧下降。我们从这些数据得出结论，少量但显著的静电相互作用有助于肉豆蔻酰化恢复素与膜的结合。

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图1

肉豆蔻酰化野生型维甲酸酯与不同脂质或脂质混合物的结合如方法部分中所述，通过平衡离心分析法分析回收素与脂质混合物的结合。脂质混合物的组成如下：PE，100%（w/w）磷脂酰乙醇胺；PC，100%（w/w）磷脂酰胆碱；PE-PC，50%（w/w）磷脂酰乙醇胺，50%（w/w）卵磷脂；PE-PC-PS，25%（w/w）磷脂酰乙醇胺，25%（w/w）卵磷脂，50%（w/w）磷脂酰丝氨酸；PS，100%（w/w）磷脂酰丝氨酸；PE-PC-Ch，25%（w/w）磷脂酰乙醇胺，25%（w/w）卵磷脂，50%（w/w）胆固醇；PE PC Ch Ps、20%（w/w）磷脂酰乙醇胺、20%（w/w）磷脂酰胆碱、50%（w/w）胆固醇、10%（w/w）磷脂酰丝氨酸。

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图2

肉豆蔻酰化回收蛋白与不同PS含量的脂质混合物的结合WT恢复素（填充圆）和Rc的绑定^2–190如方法部分所述，通过平衡离心分析法对脂混合物（开环）进行分析。PS的含量调整如下。0%PS:50%（w/w）磷脂酰乙醇胺，50%（w/w）磷脂酰胆碱；10%PS:45%（w/w）磷脂酰乙醇胺，45%（w/w）磷脂酰胆碱；20%PS:40%（w/w）磷脂酰乙醇胺，40%（w/w）磷脂酰胆碱；30%聚苯乙烯、35%（w/w）磷脂酰乙醇胺、35%（w/w）卵磷脂；40%聚苯乙烯：30%（w/w）磷脂酰乙醇胺，30%（w/w）磷脂酰胆碱；50%聚苯乙烯：25%（w/w）磷脂酰乙醇胺，25%（w/w）磷脂酰胆碱；60%聚苯乙烯：20%（w/w）磷脂酰乙醇胺，20%（w/w）磷脂酰胆碱；80%聚苯乙烯：10%（w/w）磷脂酰乙醇胺，10%（w/w）磷脂酰胆碱；100%PS.绑定WT与绑定Rc的比率^2–190分别为1.5（0%PS）、2.0（30%PS）、2.7（60%PS）和1.4（100%PS）。

回收蛋白高电荷羧基端对其膜结合的影响

WT回收蛋白的高电荷羧基末端包含6个Arg残基和2个Glu残基，导致该多肽区域内的净电荷为+4(¹⁹¹问K（K）V（V）K（K）E类K（K）L（左）K（K）E类KK公司L（左）²⁰²). 恢复素Rc的截短突变体^2–190缺乏这种电荷簇及其三维结构和一些生物化学特性，我们之前已经报道过[25]. 我们进一步研究了该区域如何促进回收蛋白与磷脂的相互作用，以及该区域对上述静电效应是否重要。因此，我们测试了Rc的结合^2–190与WT恢复素相比，不同脂质表面的Rc结合^2–190与WT回收素与脂质的结合相比，PS含量增加的脂质混合物的结合显著降低（图。​（图2，2，打开的圆圈）。此外，Rc的百分比^2–190在PS含量的测试范围内，结合没有改变。这些数据表明，带电荷的羧基末端对回收蛋白与脂质混合物的结合有重要贡献。

为了进一步研究这种影响，我们将脂质混合物固定在传感器芯片表面，并通过SPR光谱监测蛋白质的结合和解离[27,28]. 用肉豆蔻酰化形式的恢复素（WT和Rc）获得的典型传感器图的叠加^2–190)如图所示。​图3a。3a年脂混合物的组成与杆外段膜中的类似，与之前使用的相同（40%w/w PE、40%w/wPC、15%w/w PS、5%w/w胆固醇）[17,23]. 肉豆蔻酰化恢复素形式的传感器图谱显示了我们之前报道的典型形状和振幅。Rc结合幅度^2–190显著低于WT恢复素的结合幅度。最近，我们将此效应归因于钙的减少²⁺-观察到的Rc亲和力^2–190（关于这一点的实验分析和讨论，请参阅[25]). 非肉豆蔻酰化WT回收素和Rc^2–190以更低但相等的振幅绑定到同一表面（注意图中不同的缩放比例。​图3b）。3亿). 然而，振幅主要由体折射率变化引起，并不代表Ca²⁺-回收蛋白形式与固定化脂质的依赖性结合[17].

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图3

回收蛋白形式与固定化杆外段脂质混合物结合的表面等离子体共振分析.（A）肉豆蔻酰化形式的WT回收蛋白（上痕量）和Rc^2–190以30μM的浓度以5μl/min的流速注入SPR运行缓冲液中。注入时间由顶部的黑色条指示。（B） 显示注射非淀粉样化形式WT回收素和Rc的传感器图^2–190进入系统。蛋白质浓度和条件与（A）相同。（C） 减去标记的传感器图得到的差分信号（实心曲线）卢比^2–190从传感器图重量如（A）所示。虚线表示差异曲线与描述非均相配体表面平行反应的模型的拟合（BIA估值4.1）。两个相应的缔合速率常数为：k_a1级= 2.29 × 10^三M（M）^-1秒^-1和k_a2类= 0.707 × 10^三M（M）^-1秒^-1解离速率常数为k_第1天=0.013秒^-1和k_第2天=0.0016秒^-1.

WT恢复素与Rc的结合^2–190不同的脂质表面

为了测试不同脂质对回收蛋白膜结合的影响，我们将不同的脂质混合物固定在传感器芯片表面，并测量了WT回收蛋白和Rc的肉豆蔻酰化和非肉豆蔻醇化形式的结合幅度^2–190.用肉豆蔻酰化WT和Rc获得的归一化振幅^2–190在纯PC或PC/PS混合物上产生不同的振幅（图。​（图4a）；4a类); 然而，WT/Rc的比率^2–190用含PS脂类测量的振幅与纯PC中的振幅相似（参见图的图例）。​图4）。4). 对含有PC/PE和PC/PE/PS的脂质混合物进行了类似的观察（图。​（图4b）。4b个). 获取图的结果。​图22因此，可以得出结论，羧基末端有助于与含有一定负净电荷的脂质混合物结合。然而，结合WT与结合Rc的比值^2–190在1.4和2.7之间，因此甚至低于用PC:PE表面获得的比率3.0（图。​（图4b）。4b个). 我们从这些结果得出结论，回收蛋白羧基末端的带电簇与回收蛋白与脂质膜相互作用的静电贡献无关。

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图4

将回收蛋白形式注射到涂有不同脂质混合物的流细胞中获得的SPR传感器图的标准化振幅.（A）WT恢复素（黑条）和Rc的肉豆蔻酰化和非肉豆蔻石酰化形式的结合^2–190（灰色条）通过使用纯PC和PC:PS（50:50）表面进行比较。蛋白质浓度为30μM。估计WT/Rc比率^2–190结合振幅分别为1.8（肉豆蔻酰化，PC）、2.2（肉豆蔻酰化，PC/PS）、0.9（非肉豆蔻酰化，PC）和2.0（非肉豆蔻酰化，PC/PS）。（B） 肉豆蔻酰化WT Retrovirin（黑条）和Rc的结合^2–190PC:PE（50:50）或PC:PE:PS（40:40:20）表面屈服比分别为3.0和2.3。蛋白质浓度为5μM。数据收集自2-6个实验。

如图所示，PC和PC/PS表面记录的非淀粉化恢复蛋白形式的传感器图在形状和振幅上相似。​图3b3亿并产生了非常低的标准化RU值（图的右侧。​图4a）。4a类). 虽然在非淀粉酸化的WT和Rc之间存在一些差异^2–190在PC/PS脂质混合物上（图。​（图4a），4a类)，归一化RU值落在SPR记录体折射率变化的典型范围内[17]因此，不考虑进一步分析。与含有PS的脂质混合物相比，胆固醇对WT回收蛋白的膜结合有更显著的影响（图。​（图1）。1). 使用PC:PE：胆固醇混合物作为脂质表面（图。​（图5），5)，我们比较了WT恢复蛋白的结合振幅和Rc的振幅^2–190振幅随着恢复素形式（7–50μM）数量的增加而增加。在所有情况下，WT恢复的归一化振幅均高于Rc获得的振幅^2–190，但WT/Rc^2–190该比率明显低于无胆固醇脂类的观察值（图。​（图44和​和5）。5). 我们从这些数据得出结论，胆固醇促进Rc的结合^2–190脂肪及其存在可以部分弥补带电羧基末端的缺失。

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图5

通过将恢复素形式注射到涂有PC:PE：胆固醇的流动细胞中获得的SPR传感器图的标准化振幅注射WT回收蛋白（黑条）和Rc^2–190（灰色条）以指示的浓度进入流动池。固定化脂质表面含有PC:PE：胆固醇的混合物（25:25:50）。结合率分别为1.45（7μM）、1.1（18μM），1.28（30μM）和1.14（μM）。所显示的数据是从2个实验中收集的，并且代表了一组不同的含胆固醇脂质的实验。含有0.2mM CaCl的运行缓冲液₂在所有情况下。

讨论

肉豆蔻酰开关触发可逆的蛋白-膜相互作用，并代表了一种控制蛋白质从细胞质到细胞膜以及反之亦然的机制。蛋白质与膜的可逆结合可以通过疏水和静电相互作用来控制[2,4]. 我们在这里报告了实验证据，表明脂类成分对结合到膜上的回收蛋白总量有显著影响（图。​（图11和​和2），2)，但膜结合最重要的分子组分是肉豆蔻酰基（图。​（图3），三)因为WT恢复素的非糖基化形式和突变Rc^2–190显示了与SPR实验中的体折射率变化几乎相同的低结合振幅（参见参考文献[17]以便对这一点进行彻底的讨论）。这些结果与我们和以前的其他报告一致，这些报告通过SPR光谱分析了恢复素与脂质双层的结合[17,23]和原子力显微镜技术[29]，但他们不同意Desmeules等人最近发表的一篇文章，Desmeules等人在分析中使用了单层和偏振调制红外反射吸收光谱[30]. 这些作者发现，肉豆蔻酰化和非肉豆蔻石酰化恢复素在钙存在和不存在的情况下与单层具有显著的结合性²⁺但钙的结合动力学较慢²⁺-自由形式。除了最近的研究中使用了脂质单层而非脂质双层外，我们没有对这些差异进行解释。我们可以排除SPR研究受到记录时间进程的限制。将蛋白质注入流动池和缓冲液流量可控制在1–100μl/min的范围内，从而产生不同的记录时间间隔。图中的传感器图。​图3三在600秒的时间间隔内以5μl/min的流速进行记录。所有记录表明，结合过程在蛋白质注射的时间过程中达到平衡（见图中的平台阶段）。​图3）。三). 因此，应该检测到较慢的绑定事件。

虽然恢复素的高电荷羧基末端与结合能的静电贡献没有直接关系，但它显然对一般的结合机制起着重要的调节作用。肉豆蔻酰化WT回收蛋白显示出复杂的双相缔合和解离相，由快相和慢相组成（图。​（图3）三)我们在之前的工作中分析过的[17,23]. 截短肉豆蔻酰化恢复素突变体Rc的结合^2–190混合活性氧脂质双层发生快速缔合和解离动力学。从图中的传感器图可以看出。​图3a3a年带电荷的羧基末端是慢相的分子决定因素。因此，我们减去了Rc^2–190WT传感器图中的传感器图产生图中的差分信号。​图3c，3立方厘米，其中解离相出现的速度要慢得多。然而，差分信号与单指数Langmuir结合模型的拟合结果并不令人满意，相反，最佳拟合是通过假设非均匀表面的平行结合模型获得的（BIA估值4.1）。当脂质体注射到Biacore系统中时，是否与L1传感器芯片融合并形成双层，或者它们是否主要固定为完整的球体，这仍然是一个尚未解决的问题（参见[28]). 因此，我们将我们的结果解释为，由于固有的异质性，回收蛋白以不同的动力学结合到固定化脂质。

然而，减法程序可以突出显示较慢的离解相来自带电的羧基末端。因此，带电荷的羧基末端将代表恢复素中的效应区，这与我们最近的假设一致，即带电荷的羰基末端是钙的内部调节剂²⁺-灵敏度[26]. 结合两种观察结果（本工作和[26])我们的结论是，回收蛋白的羧基末端是一个效应区，通过影响其钙来延迟回收蛋白从膜上的分离²⁺-灵敏度。这一结论的进一步结果是，Rc对恢复素目标视紫红质激酶的抑制效率较低^2–190与WT回收剂相比，因为回收剂在膜上的平均停留时间会减少。事实上，我们之前报道过[26]Rc对视紫红质激酶的抑制作用^2–190转移到较高的游离钙²⁺-浓度，因此抑制作用变得不那么有效。

具有大量带正电荷区域的簇也存在于恢复素直系物中，但不存在于其他NCS蛋白质中，如神经钙蛋白、VILIP和NCS-1（参见[24]). 另一种称为鸟苷酸环化酶激活蛋白（GCAPs）的NCS蛋白亚群的等位基因显示出不同的羧基末端，序列同源性较低，但至少有两种等位基因，GCAP2和GCAP3[31-33]有一簇正电荷。例如，牛GCAP2窝藏净电荷为+3的区域(¹⁹⁸RRK公司SAMF公司²⁰⁴)斑马鱼GCAP3包含净电荷为+3的区域(¹⁸¹天然气质量KKKK公司E类¹⁸⁸). 人类GCAP3的羧基末端更长，净电荷为+4[33]. GCAP中的这些区域是否作为其Ca的内部调节剂仍有待证明²⁺-敏感或参与与膜或靶蛋白的静电相互作用。

结论

肉豆蔻酰化回收蛋白与生物膜的短暂结合受疏水和静电相互作用控制。这一过程的主要驱动力是肉豆蔻酰基团插入脂质双层。静电相互作用并不起源于高电荷的羧基末端，尽管这一恢复蛋白区域对其膜结合总体来说很重要。它代表一个内部效应区，可能延长肉豆蔻酰化恢复素与膜相关的时间。因此，它确保了恢复素与其目标视紫红质激酶之间的充分相互作用。

方法

使用的缩写列表

磷脂酰胆碱；PE，磷脂酰乙醇胺；PS，磷脂酰丝氨酸；WT，野生型；卢比^2–190，截断恢复素突变体，SPR，表面等离子体共振

作者的贡献

IIS进行了脂质结合实验和SPR研究。VAC进行了突变体的制备、表达和纯化。IIS和KWK分析了数据。所有作者构思了该研究并参与了其设计。KWK编写了手稿的初稿，IIS和PPP帮助起草了手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。

致谢

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