bHLH转录因子Mist1是维持外分泌胰腺细胞组织和腺泡细胞特性所必需的

薄雾1^击倒对手胰腺组织腺泡细胞组织破坏

为了确定Mist1蛋白的假定作用，对小鼠的腺泡细胞形态进行了检查，其中薄雾1等位基因被替换为LacZ公司(薄雾1^击倒对手). 来自的后代的基因型分析薄雾1^LacZ公司交配显示了单个遗传位点孟德尔遗传的典型基因分布（野生型，26.6%；薄雾1^LacZ公司, 48.6%;薄雾1^击倒对手, 24.8%). Mist1蛋白的缺失和基因表达薄雾1-免疫组化证实为空小鼠(图3，A和B)Western blot和逆转录酶PCR分析（未发表数据）。薄雾1^击倒对手与野生型和杂合子同窝小鼠相比，小鼠的出生尺寸、体重和进食习惯正常（未公布数据）。这些小鼠的胰腺组织表达的消化酶水平与野生型小鼠相似，这表明Mist1对外分泌胰腺的初始形成或消化酶的表达并不重要。然而，对3米大婴儿的胰腺组织进行更仔细的检查薄雾1-空白动物表明存在腺泡细胞特有的显著结构缺陷。

野生型小鼠胰腺外分泌切片的苏木精和伊红染色显示了明确的组织间和细胞内水平(图3C） ●●●●。这与薄雾1^击倒对手动物中几乎没有观察到假定的腺泡，腺泡细胞高度紊乱。细胞核没有位于基底，并且没有观察到野生型动物中存在的ER和ZG之间的明显边界(图3D） ●●●●。极性缺失薄雾1^击倒对手腺泡细胞伴有空泡化，伴有细胞和核异型增生。环氧树脂切片的甲苯胺蓝染色(图3、E和F)羧肽酶A（CPA）免疫组化(图3，G和H)确认电池极性丢失薄雾1^击倒对手老鼠。在正常的腺泡细胞中，ZG向腺泡中心聚集，而在腺泡中心完全失去顶端定位薄雾1^击倒对手老鼠(图3，E与F相比）。这种组织变化导致细胞核完全被ZG包围(图3H） ●●●●。胰腺组织来自薄雾1^击倒对手时间点早于3m的小鼠也表现出ZG积累和细胞极性的持续缺失（未公布的数据）。

薄雾1^击倒对手小鼠发生具有严重胰腺损伤特征的胰腺损伤

分析薄雾1^击倒对手老年动物的腺泡组织表明，随着时间的推移，Mist1的缺乏会导致组织结构越来越严重。在9-10米年龄段，这种表型表现为腺泡细胞的逐渐退化。在12米处，很容易观察到外分泌组织特有的局灶性病变(图4B） ●●●●。这些病变最初表现为腺泡细胞，其酶水平明显较低，管腔周围轻微扩张。进展性病变表现为圆形结构，表现为腺泡或导管扩张(图4C） ●●●●。在表现出广泛损伤的小鼠中，腺泡组织数量显著减少，同时其他类型的细胞大量聚集(图4D） 包括导管细胞、星状细胞（见下文）和白细胞（未发表的数据）。胰腺内的小区域也有酶表达的急剧下降(图4J） ●●●●。重要的是，胰腺的内分泌成分在薄雾1^击倒对手小鼠，表明观察到的组织损伤是外分泌胰腺特有的(图4K） ●●●●。空白小鼠的胰岛素和胰高血糖素水平相对正常，血糖水平不受影响（未公布的数据）。这些观察结果表明薄雾1^击倒对手小鼠仅限于正常表达Mist1的细胞（例如腺泡细胞）。有趣的是，胰腺组织的相对湿重米斯特1^击倒对手小鼠与野生型小鼠没有显著差异。

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图4。

薄雾1-null小鼠在12岁时出现胰腺外分泌损伤。（A–H）为了揭示组织的整体形态，冷冻切片用亚甲蓝（A–D）或β-半乳糖组织化学染色，并用核固红（E–H）复染。野生型同窝仔表现出典型的腺泡细胞组织（A）。相反，胰腺组织薄雾1^击倒对手小鼠表现出渐进性恶化，导致整个外分泌组织（B-D）受损。最初，病变包含假定的腺泡组织（箭头），维持薄雾1基因位点（β-gal阳性）（F）。最终，在病灶内观察到圆形导管样结构（C）。含有β-半乳糖阳性细胞的假定导管的出现（G，箭头所示）表明腺泡细胞可能已形成导管细胞表型。In～10%薄雾1^击倒对手小鼠，大部分胰腺组织丢失（D），很少薄雾1-LacZ–表达剩余细胞（H）。（I–K）中的外分泌组织薄雾1-空动物被选择性地作为创伤目标。严重受累动物的胰腺组织（I）显示外分泌组织（J）极度破坏，同时保留胰岛和胰岛素表达（K）。箭头在各个序列段上标记相同的位置。星号表示CPA和胰岛素阴性的大面积区域。

为了确定胰腺病变中腺泡细胞的命运，对单个胰腺切片进行检查LacZ公司表达式。如所示图4，E–H，这些病变内的细胞似乎代表了具有导管细胞表型的腺泡细胞。最初，β-gal的表达仅限于腺泡细胞(图4F） ●●●●。然而，随着病变形成变得更加显著LacZ公司在推测的导管结构中的细胞中观察到表达(图4G） ●●●●。最终，病变变得广泛，只有少数细胞继续表达β-半乳糖(图4H） ●●●●。

分析米斯特1^击倒对手具有CK-20特异性抗体的胰腺组织(图5，A和B)CK-7（未发表的数据）证实，这些小鼠在整个组织中形成广泛的导管细胞积聚。CK染色伴随CPA（未发表的数据）和淀粉酶表达下降(图6). 许多细胞同时表达β-gal和CK-20(图5，C–E），表明腺泡细胞可能恢复为导管细胞表型。米斯特1^击倒对手胰腺组织中结蛋白和波形蛋白阳性细胞的数量也显著增加（未公布的数据），并出现表达平滑肌肌动蛋白（SMA）的细胞(图5G） ●●●●。许多SMA阳性细胞存在于小血管壁内，并显示血管扩张薄雾1^击倒对手胰腺组织。然而，也有许多不属于血管的单个细胞。SMA在这些细胞中的表达表明，它们是活化的星状细胞，促进胶原蛋白沉积增加，是几种胰腺疾病的特征(Haber等人.,1999). Gomori三色染色证实结缔组织增加(图5H） 表明这些动物的外分泌胰腺也发生了纤维化。活化的星状细胞和增加的导管组织的存在表明薄雾1^击倒对手腺泡组织显示出明显的胰腺损伤。

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图5。

内部病变薄雾1 ^击倒对手 胰腺组织中的细胞与薄雾1位点和导管细胞标记物。（A和B）CK-20特异性抗体的免疫组织化学显示野生型动物体内导管组织的正常积聚（A）。相比之下薄雾1^击倒对手胰腺在外分泌组织中含有大量的导管细胞（B，箭头所示）。使用CK-7抗体可获得相同的染色模式（未公布的数据）。插图显示这些动物的正常胰岛素阳性胰岛。（C–E）CK-20和β-半乳糖染色显示，在同一细胞中，腺泡和导管特异性标记物明显共存。填充箭头和开放箭头分别指向CK-20阳性细胞内的β-gal阳性和阴性细胞核。（F–H）野生型（F）和空白（G）组织切片上SMA的免疫组织化学。SMA的表达仅限于野生型小鼠的血管。然而，在空白组织中观察到多个SMA阳性细胞，其中显示一个特殊的损伤（H）。更高的放大倍数（插图，与DAPI一起显示）表明这些细胞可能代表小血管（实心箭头）和星状细胞（空心箭头）。用Gomori三色（H）染色空白切片也可以发现在许多纤维化病变中发现大量的结缔组织（绿色，箭头）。

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图6。

中的病变薄雾1^击倒对手小鼠含有同时表达导管和腺泡细胞标记的细胞。（A–C）淀粉酶（A）和CK-20（B）染色显示腺泡和导管特异性标记物在同一细胞中共表达（在C中结合）。插图显示一个特定腺泡的放大倍数较高，该腺泡同时表达CK-20和淀粉酶。（D–I）在0.7μm光学切片分辨率的类似病变上的共焦显微镜证实了淀粉酶（D和G）和CK-20（E和H）的共表达。可以观察到细胞表达淀粉酶（开放箭头）、CK-20（蓝色箭头）或两种细胞标记物（白色箭头）（F和I）。G–I显示D–F中突出显示的区域的放大倍数较高。F中的箭头表示特定病变的边缘。病灶外的细胞主要是淀粉酶阳性的腺泡细胞。

确认胰腺外分泌单个细胞内导管和腺泡细胞特异性标记物的共表达薄雾1^击倒对手小鼠、CK-20特异性抗体和淀粉酶在冷冻切片上共定位。常规荧光显微镜显示病灶周围淀粉酶的表达，病灶内许多细胞也表达淀粉酶(图6A） ●●●●。CK-20的表达在整个病变中增加(图6B） ，几个细胞似乎同时存在这两个标记(图6C） ●●●●。为了证实这种共表达模式，在0.7μm厚的光学切片上进行了共焦显微镜检查。如所示图6，D–ICK-20和淀粉酶在病变内的许多细胞中很容易同时表达，而野生型动物的细胞从未同时表达这两种标记物(图1，C–H）。同时表达CK-20和淀粉酶的细胞的鉴定表明，这些细胞可能代表了腺泡和导管细胞表型之间的过渡状态。

细胞组织中蛋白质的丢失

检测胰腺腺泡细胞紊乱的潜在原因薄雾1^击倒对手对小鼠粘附连接形成相关蛋白进行分析。粘附连接复合体被认为是通过维持细胞间相互作用和稳定细胞骨架来调节细胞极性的重要介质(Petzelbauer等人., 2000). 在1米的年龄，薄雾1^击倒对手动物的β-catenin表达水平正常(图7A） ●●●●。然而，5米大薄雾1^击倒对手小鼠的表达显著下降，到12m时β-catenin显著减少。γ-和α-连环蛋白（未发表的数据）也观察到这种表达的逐渐丧失，但E-钙粘蛋白没有(图7B） 这表明catenin蛋白家族受到Mist1缺失的特异性影响。尽管胰岛和导管细胞保持适当的水平和蛋白的定位，但12个月龄组织的免疫组织化学分析进一步证实了这些结果，其中腺泡细胞中未观察到β-catenin(图7，C–D）。紧密连接蛋白ZO-1的分析表明，它维持在适当的水平，蛋白定位于腺泡细胞的假定顶端边界(图7、E和F). 然而，ZO-1染色也显示了扩张的导管，这是米斯特1^击倒对手胰腺组织，在腺泡细胞簇中心描绘扩张管腔的边界。尽管紧密连接仍在继续形成，但catenin表达的缺失可能是肿瘤严重程度增加的原因薄雾1^击倒对手表型和腺泡细胞表型的最终丢失。

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图7。

累进损失β-连环蛋白与腺泡细胞紊乱增加有关薄雾1 ^击倒对手 老鼠。（A） 野生型（+/+）和薄雾1^击倒对手（−/−）小鼠的β-catenin表达逐渐减少薄雾1^击倒对手腺泡组织。（B） β-catenin表达缺失薄雾1^击倒对手12米大的老鼠，而薄雾1^LacZ公司小鼠（+/-）β-catenin水平正常。E-cadherin的表达在薄雾1^击倒对手老鼠。（C–F）β-catenin的丢失是腺泡组织特有的薄雾1^击倒对手老鼠。外分泌组织薄雾1-空白小鼠的β-catenin蛋白完全缺失（与C和D相比），而胰岛（I，插图）和导管细胞（箭头）继续表达正常的β-catanin水平。对ZO-1特异性抗体（E和F）的类似分析表明，在薄雾1^击倒对手老鼠，尽管周围的管腔严重膨胀（箭头）。

米斯特1^击倒对手小鼠慢性胰腺损伤模型

评估薄雾1^击倒对手作为胰腺损伤模型的小鼠，分析了成年胰腺组织的蛋白质提取物中几种消化酶的表达(图8A） ●●●●。Western blot分析显示1米龄野生型和薄雾1^击倒对手老鼠。然而，在随后的时间点（4米和12米），淀粉酶的表达略有但持续下降。对CPA的类似分析显示，野生型和薄雾1^击倒对手动物。然而，薄雾1^击倒对手小鼠还含有一种活性胞内形式的酶。CPA（前羧肽酶）的非活性前体以47 kD迁移，是野生型小鼠中发现的唯一形式。活性CPA不应出现在腺泡细胞内，在33 kD时迁移，并且在检查的所有时间点都能发现薄雾1^击倒对手动物。电子显微照片同样揭示了细胞组织中的超微结构缺陷，并证实了单个细胞器的细胞内消化，支持了早期酶激活的潜在结果薄雾1^击倒对手腺泡细胞(图8、B和C). 观察到细胞器很容易相互融合，线粒体经常被降解(图8B） ，腺泡细胞含有大的自噬小泡(图8C） ，所有这些都是细胞经历广泛的细胞内降解的标志。最后，为了扩展薄雾1^击倒对手从小鼠到其他动物模型，我们还检测了胰腺损伤诱导后已知上调的几个基因的表达模式(Iovanna等人., 1991;Dusetti等人., 1996;Mallo等人., 1997). 正如所料监管机构/PSP,PAP1/RegIII、和第8页基因在薄雾1^击倒对手胰腺组织(图8D） ●●●●。

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图8。

薄雾1 ^击倒对手 小鼠表现出胰腺损伤的生化和分子标志物。（A） 前CPA（47 kD）的Western blot分析显示活化CPA酶（35 kD）积累，特别是在薄雾1^击倒对手动物（箭头）。（B和C）在薄雾1^击倒对手老鼠。在B中，观察到假定的溶酶体与线粒体融合（箭头所示）。在每个腺泡细胞内可以看到许多被消化的线粒体，自噬细胞体通常在薄雾1^击倒对手样本（C，箭头）。（D） 北方杂交用于检测监管机构/PSP和PAP1/RegIII4米和8米年龄段的基因表达。在这两种情况下，在薄雾1^击倒对手老鼠。在中检测到类似的增加第8页转录水平薄雾1^击倒对手小鼠与野生型产仔交配。肝RNA样本作为阴性对照。

RNA分离和Northern杂交

胰腺RNA根据Han等人（1987）修改类似于Chirgwin等人（1979年）按照制造商的说明，使用Trizol（GIBCO BRL）从肝脏中分离RNA。对于Northern blot分析，30μg总RNA在1.0%琼脂糖/甲醛凝胶上电泳，使用10×SSC印在Hybond膜（Amersham Pharmacia Biotech）上，并在50%甲酰胺、5×SSPE、2×Denhardt溶液和0.1%SDS中在42°C下杂交18 h。杂交后，在65°C的温度下，在溶液I（2×SSC，0.1%SDS）中清洗印迹2次，每次5分钟，在溶液II（1×SSC、0.1%SDS）中清洗两次，每次10分钟，在溶剂III（0.1×SSC和0.1%SDD）中清洗2次，共5分钟。Northern杂交探针包括全长第8页cDNA，一个400-bp的片段CCK配置总成cDNA，一个450-bp的片段PAP1/RegIII编码区，以及RegI公司/PSP公司编码区域。

抗体

抗体从商业和个人供应商处获得。主要抗体包括胰高血糖素（1:1000；Dako）、胰岛素（1:1000，Incstar）、淀粉酶（1:1000、Calbiochem）、CPA（1:1000）、β-catenin（1:2000；Sigma-Aldrich）、PTF1-p48（1:250；得克萨斯大学西南医学中心R.MacDonald赠送的礼物，德克萨斯州达拉斯）、PDX1（1:400；H。Edlund，西班牙乌梅大学；以及1:5000，来自田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学中心C.Wright的礼物，VAMP2（1:500；来自加拿大多伦多病童医院W.Trimble的礼物），IP_三R1和IP_三R2（1:20；纽约州雪城纽约州立大学上游医疗中心R.Wojcikiewicz赠送的礼物）和Mist1（1:250；Pin等人., 2000). 使用的单克隆抗体对SMA（1:100；Sigma-Aldrich）、ZO-1（1:100，Chemicon）、vimentin（1:20；Sigma Aldrich_三R3（1:1000；BD转导实验室）。除从Vector Laboratories购买的生物素化抗兔抗体外，所有二级抗体均来自Jackson ImmunoResearch Laboratory。

作者感谢J.Mitnick博士提供电子显微照片，D.Martin博士和普渡癌症中心转基因小鼠核心设施协助创建薄雾1^LacZ公司小鼠，A.Bonvissuto和A.Kowalik用于组织切片和组织学。此外，我们感谢M.白金汉、L.Van Kaer、C.Wright、W.Trimble、R.Wojcikiewicz和H.Edlund提供了宝贵的试剂。我们还要感谢R.MacDonald、P.Wellauer、C.Wright、D.Bockman、E.Kazackos和P.Schneider在审查前对工作的批判性评估。

这项工作得到了美国国立卫生研究院（DK55489，AR41115）和普渡大学癌症中心向S.F.Konieczny提供的资助。C.L.Pin得到了加拿大医学研究委员会博士后奖学金和儿童健康研究所的运营拨款的支持。