尽管直接尝试确定导致肺损伤和功能丧失的因素，但哮喘的病因仍不清楚。潜在的呼吸道炎症导致可变的气流限制和气道对各种刺激的高反应性，通常会因过敏原而加剧(1)、呼吸道感染(2)或环境因素（例如空气污染物，如臭氧或烟草烟雾）(三). 局部细胞因子和趋化因子基因表达(4)，分泌低分子量炎症介质(5)以及特定白细胞类型的招募(6)都被证明是重大事件。与病理学发展的正相关表明，该过程涉及多种细胞类型和分子信号级联。此外，遗传易感性的复杂遗传模式证明了该疾病的多基因性质(7).
哮喘的许多病理生理表现与细胞因子和趋化因子介导的嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的气道浸润有关。反过来，白细胞流入与肺功能障碍的发展有关，即使在哮喘的名义病例中也是如此(8). 事实上，浸润的程度通常与疾病的严重程度相关(8). 肺过敏性疾病的抗原诱导小鼠模型已被证明在肺部炎症通路的基因解剖中特别有用。通常，这些模型包括用特定抗原（例如卵清蛋白）致敏，然后通过空气给药相同的抗原(9). 雾化过敏原治疗的致敏小鼠出现以CD4为主的气道腔白细胞浸润+淋巴细胞和嗜酸性粒细胞。这些小鼠还出现哮喘的许多病理学变化，包括气道高反应性（AHR）1杯状细胞增生，粘液分泌过多(10).
导致气道炎症、嗜酸性粒细胞浸润和AHR的细胞信号仍不清楚。淋巴细胞和肥大细胞被认为是哮喘抗原致敏小鼠模型中AHR的需求。缺乏T和B淋巴细胞的SCID小鼠在卵清蛋白致敏后，气道嗜酸性粒细胞增多症或AHR均未发生(11). CD4的耗竭+用抗CD4抗体或MHCⅡ类基因敲除处理的淋巴细胞可消除抗原致敏小鼠的嗜酸性粒细胞气道浸润和AHR(12). 相反，CD8的消耗+抗CD8抗体的T淋巴细胞对肺嗜酸性粒细胞浸润无影响，但可消除AHR(13,14). 然而，最近的研究使用β2-尽管MHC I表面分子和CD8丢失，但缺乏微球蛋白的小鼠对AHR没有影响+单元格(15). 最后，对肥大细胞缺乏小鼠的研究（W/Wv（v）)表明肥大细胞在嗜酸性粒细胞气道浸润或AHR中均不需要(16).
总之，抗原致敏和激发小鼠模型暗示T淋巴细胞是炎症反应的关键组成部分。随后的研究侧重于T细胞产生的白细胞介素H（H）2个亚型。IL-4和T的必要性H（H）IL-4缺乏小鼠在抗原致敏和激发时，未能诱导气道嗜酸性粒细胞浸润或AHR，从而证明2细胞(16). IL-5缺陷小鼠的卵清蛋白致敏和挑战表明，这些动物也不会出现嗜酸性粒细胞气道浸润或AHR(17). 这些使用雾化抗原激发的细胞因子基因敲除研究表明，IL-4和IL-5是炎症级联反应的重要组成部分，最终导致嗜酸性粒细胞气道浸润和哮喘的病理生理学改变。
表达IL-4或IL-5的转基因小鼠对这些T细胞的作用没有提供更多的见解H（H）细胞因子在肺部炎症病理发展中的作用。IL-4已在几种细胞和组织类型中体外表达(18–20)包括呼吸道上皮的Clara细胞(21). 尽管血清IL-4水平较高，但非肺细胞型中这种细胞因子的表达不会产生肺扰动。相反，IL-4的肺特异性表达(21)确实导致了病理性肺部变化，但令人惊讶的是，这些变化只是名义上的，与人类疾病没有特别的相关性。体外表达IL-5的转基因动物研究仅限于非肺细胞和组织类型(22–25)这些报告的结果也表明，没有一只动物出现肺部异常。然而，在最近的这些研究中(22)我们的研究小组已经表明，一些IL-5效应器功能似乎依赖于细胞和组织特异性表达。根据对哮喘患者的临床观察，该结论具有潜在的重要意义，即高水平IL-5表达的细胞浸润肺部（例如，参见参考文献26).
为了验证与哮喘患者相关的许多病理是由肺特异性表达IL-5独特引起的这一假设，我们创建了转基因小鼠，使用一种特征明确的肺特异性调节元件来驱动成年动物上皮中的表达，该小鼠在气道腔中组成性表达IL-5(27). 我们报道，由此产生的转基因小鼠发生了病理生理学变化，包括嗜酸性粒细胞侵袭支气管周围间隙、上皮肥大、杯状细胞增生和粘液分泌增加。这些小鼠也有证据表明，嗜酸性粒细胞在气道腔内的募集水平与哮喘患者相当。此外，在没有抗原诱导炎症的情况下，这些小鼠对乙酰甲胆碱的激发仍表现出AHR。因此，仅肺特异性表达IL-5就可以重现许多与过敏性呼吸道疾病相关的病理生理条件。
材料和方法
转基因小鼠的产生。
含有5.5-kb IL-5 cDNA/基因组融合基因的BamHI限制性片段(22)被克隆到质粒pNNO3的BglII位点（马萨诸塞州剑桥市Biogen R.Tizzard的馈赠品）。含有大鼠Clara细胞分泌蛋白CC10启动子区的2.3-kb BamHI片段(27)（密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院J.Gitlin的一份礼物）被克隆到该质粒多连接子的上游BamHI位点。通过NotI消化从质粒序列中切除该转基因构建物，并将其注射到F杂交后代的胚胎中1（CBA/CaJ×C57BL/6J）雌性和C57BL/6J雄性。从尾部DNA的基因组Southern印迹中鉴定出转基因阳性创始动物。转基因动物的后续世代是近交系C57BL/6J回交的结果。这里报告的动物被饲养在一个特定的无病原（SPF）动物设施中的微隔离笼中。动物群内的哨兵笼检测病毒抗体和已知小鼠病原体均为阴性。
RNA分离和Northern Blot分析。
如前所述，分离总RNA并进行甲醛-淀粉Northern印迹(28).
组织原位杂交。
多聚甲醛固定肺石蜡切片采用原位杂交反应35如前所述的S标记IL-5反义RNA探针(29).
收集支气管肺泡灌洗液和血清以测定IL-5水平。
向动物（i.p.）注射致死剂量的氯胺酮（600 mg/kg体重）和木聚嗪（30mg/kg体重），并将其置于立体解剖显微镜下。暴露气管，插入套管并用缝线固定。用1ml等分冰镇PBS和0.2%胎牛血清清洗肺部四次。常规回收3.6–3.8 ml滴注的灌洗液（转基因动物和野生型动物的回收率没有差异）。将回收的支气管肺泡灌洗液离心（4°C下1000 rpm，10 min）以去除细胞，将上清液等分部分冷冻在干冰上，并在-80°C下保存，直至使用。外周血（300–500 mm三)被割破了尾巴。让血液在室温下凝块30分钟，通过离心（4°C下1000 rpm，10分钟）回收血清，冷冻在干冰上，并在−80°C下储存，直到使用。使用制造商描述的小鼠细胞因子ELISA试剂盒测量IL-5和IL-4水平（Endogen公司，马萨诸塞州波士顿）。
血液学分析：血液学标准，细胞旋转和涂片准备，细胞计数和差异。
从尾源血液中进行微红细胞压积。如前所述制备血膜和骨髓刷涂片(22). 使用Shandon Cytospin 3（Shandon Scientific LTD，Cheshire，England）制备从胶原酶处理的肺或回收的BAL液中分离的细胞的胞浆。用Leukostat染色的玻片进行细胞差异分析（Fisher Diagnostics，费希尔科学公司宾夕法尼亚州匹兹堡）或赖特污渍。嗜酸性粒细胞的特异性鉴定通过对次级颗粒中含有的耐氰过氧化物酶的代表性载玻片进行染色来证实(28)或用嗜酸性粒细胞颗粒蛋白特异性抗血清进行差异染色。通过血细胞仪对总细胞计数进行量化，并与通过微分的细胞类型百分比一起用于计算特定细胞数。
组织组织学。
在切除之前，用0.5毫升10%磷酸盐缓冲福尔马林给肺部充气，并在室温下固定过夜。将固定组织样本嵌入石蜡中，并在经TESPA处理的载玻片上制备切片（4-6μm），用于免疫荧光或酸洗片用于组织化学染色。
肺细胞的分离和分化。
如前所述，通过胶原酶处理灌注肺制备细胞悬液(14).
气道抗原致敏和挑战。
如前所述，用雾化鸡卵清蛋白对小鼠进行致敏和激发(30).
肺切片的免疫荧光。
将福尔马林固定石蜡包埋组织的连续切片置于经TESPA处理的载玻片上。使用二甲苯/乙醇/水梯度将切片脱蜡，在0.1%胰蛋白酶、0.1%CaCl（pH 7.5）中处理30分钟，用水冲洗干净，并在4°C的PBS、10%山羊血清、0.1%叠氮化钠中隔夜（>12小时）封闭。封闭的组织切片在PBS中冲洗，然后使用兔预出血血清（稀释1:20）或抗小鼠嗜酸性粒细胞颗粒主要碱性蛋白（mMBP）血清（稀释1:10）。添加一级抗体后，将载玻片在37°C的加湿室中培养45分钟。用PBS清洗载玻片（每个3×5 min），并在室温下用0.1%Chromotrope 2R（J.T.Baker，Phillipsburg，NJ）在PBS中封闭30 min。用2–3次PBS变化冲洗切片，并用FITC-结合抗兔IgG（稀释1:40；西格玛化学公司。（密苏里州圣路易斯）在37°C下保持30分钟。载玻片在PBS中清洗（每个3×5 min），并使用90%甘油、10%PBS和0.1%的混合物安装盖玻片对-苯二胺(西格玛).
AHR的测量。
采用非侵入性方法通过乙酰甲胆碱气雾剂诱导气流阻塞来评估气道反应性(31). 该程序估计小鼠的总肺气流（即上呼吸道和下呼吸道的气流总和）。将清醒小鼠置于全身体积描记器（PLY 3115型；Buxco Electronics Inc.，Troy，NY）中，获得分钟体积、潮气量、呼吸频率和增强停顿（Penh）。用该系统对小鼠进行无限制和耐受的重复测量。使用连接至前置放大器模块（CHA 0150型）的传感器（型号TRD 5700）测量腔室压力，并使用System XA软件（型号SFT 1810）进行分析。腔室压力用于测量吸气（或呼气）期间胸腔扩张（或收缩）和从腔室中排出（或增加）的空气量之间的差异。该函数相对于时间的微分产生了一个假流量值，该值与胸腔容积和鼻流量变化率之间的差异成正比。将小鼠置于每个腔室中2 min，根据制造商的建议，通过使用以下公式测量Penh来评估肺气流阻塞：Penh=（[Te/0.3RT]−1）×（2PEF/3PIF），其中Penh=增强停顿（无量纲），Te=呼气时间（s），RT=放松时间（s，PEF=呼气峰流量（ml/s），PIF=吸气峰流量（ml/s）。收集呼吸模式2分钟，从30次呼吸（或30秒，以先发生者为准）中得出每个变量的平均值。记录峰值Penh值。通过将小鼠暴露于盐水中1分钟，然后递增剂量（2.5–320 mg/ml）的雾化甲胆碱（型号CN-25 Collision MRE型喷雾器；BGI，Inc.，Waltham，MA），并在激发后监测呼吸模式2–3分钟，来测量甲胆碱的反应性。绘制了剂量反应数据，乙酰甲胆碱的剂量足以使Penh（ED）加倍200)通过对数线性插值导出。该程序在60分钟内完成。
结果
在肺上皮中组成性表达IL-5的转基因小鼠的产生。
利用大鼠CC10基因的启动子创建了在肺上皮表达IL-5的转基因小鼠(27)以及之前描述的IL-5的cDNA/基因组融合(22). 三个独立的品系（NJ.1659，NJ.1723，NJ.1726）最初在转基因拷贝数、外周血细胞数和肺组织学方面进行了表征。所有三种小鼠的白细胞计数都升高，包括外周嗜酸性粒细胞增多，肺支气管周围细胞增多。每个品系的转基因拷贝数不同（NJ.1659[1]、NJ.1723[10]、NJ.1726[15]），并且通常与观察到的病理范围相关。在此基础上，选择NJ.1726转基因小鼠系，进一步研究肺上皮表达IL-5的病理生理效应。
将NJ.1726小鼠回交至C57BL/6J（+/+）至少四代。所有报告的数据均来自3-8个月大的小鼠。转基因动物的活产和断奶后代数量与（+/+）小鼠相当。此外，转基因在雄性和雌性幼崽中遗传相同，表明存在常染色体插入。NJ.1726小鼠的表观发病率和预期寿命与转基因阴性同窝小鼠相比没有变化。Northern blot分析表明，转基因动物中IL-5的表达仅限于肺部，在所检测的任何野生型组织中均未检测到（图。). 此外，对NJ.1726成人肺的原位杂交显示，IL-5表达的主要部位包括较大气道的Clara细胞（数据未显示）和肺腺泡的近端部分（即传导气道和气体交换区之间的过渡区）以及组织学特征、数量和位置表明其为肺泡上皮II型细胞的细胞（图。). 这种表达遍及整个肺，与大鼠CC10基因在成年大鼠肺中的表达模式一致(32).
肺特异性IL-5基因表达。（+/+）和NJ.1726的Northern印迹(Tg（千克）)用随机脉冲探测组织RNA32P标记的IL-5 cDNA。每条通道含有15μg总RNA1、骨髓；车道2、肝脏；车道三，肺；车道4，脾脏。用溴化乙锭染色的18S小核糖体亚单位的照片显示了每个通道中是否存在RNA。
NJ.1726小鼠肺上皮IL-5转录物的定位。从克隆到质粒载体pBluescript KS（+）中的白细胞介素-5 cDNA（Honjo的一种礼物）合成了一个白细胞介素反义RNA探针。当感测探针与相邻切片杂交时，没有检测到信号（数据未显示）。结核，终末细支气管；AD公司，牙槽管；AS公司，牙槽间隙；BALT公司，支气管相关淋巴组织。条形，25μm。
通过ELISA评估BAL液和血清中的IL-5水平（表). 两个隔间的IL-5（+/+）水平均处于或低于检测水平（⩽5pg/ml）。相反，NJ.1726小鼠BAL液中的IL-5水平显著升高（269 ng/总灌洗）。气道高水平表达的一个明显结果是IL-5被转移到血管中，使血清IL-5为～1700 pg/ml。在NJ.1726小鼠的BAL液中检测不到IL-4（即⩽5 pg/ml）。此外，对（+/+）和转基因动物内源性肺细胞因子和趋化因子基因活性的Northern blot比较表明，NJ.1726小鼠的肺中IL-4、RANTES、MCP-3和eotaxin保持在较低和/或几乎无法检测到的水平（数据未显示）。
表1
>IL-5蛋白水平及其对外周血和股骨骨髓细胞的影响
| 鼠标*
| | 红细胞压积 | | BAL中的IL-5 | | 血清IL-5 | | 单元数/mm三血液（×10−3) | | 细胞数/股骨（×10−6) |
|---|
| | | | 总计 | | 莱姆 | | 单声道 | | Eos公司 | | Neu公司 | | 总计 | | 埃里 | | 莱姆 | | Eos公司 | | Neu公司 |
|---|
| | | |
ng/总灌洗量
| |
微微克/毫升
| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
| +/+ | | 55.3 (4.6)4
| | 未注明。 | | 未注明。 | | 9.9 (3.0)4
| | 6.1 (3.9) | | 1.2 (0.5) | | 0.2 (0.1) | | 2.5 (1.0) | | 27.8 (4.9)4
| | 11.0 (2.4) | | 5.9 (0.9) | | 0.7 (0.8) | | 10.1 (5.1) |
| 新泽西1726 | | 54.3 (4.3)4
| | 269 (37)4
| | 1696 (449)4
| | 41.4 (16.3)4
| | 18.8 (10.6) | | 2.6 (1.0) | | 17.3 (8.7) | | 2.7 (1.5) | | 30.3 (3.8)4
| | 4.1 (1.6) | | 3.8 (0.6) | | 15.2 (1.8) | | 7.3 (3.9) |
IL-5诱导的骨髓细胞群变化和外周嗜酸性粒细胞增多症的发生。
肺中IL-5过度表达和血清水平升高对造血的影响如表所示.NJ.1726小鼠的白细胞（WBC）计数相对于（+/+）（约四倍）适度升高，超过41000个/mm三这种增加主要是由于外周血嗜酸性粒细胞增多（2比42%），尽管所有其他类型的白细胞绝对数增加。然而，与（+/+）小鼠相比，NJ.1726股骨骨髓细胞数保持不变。骨髓细胞总数缺乏变化掩盖了细胞组成的根本变化。嗜酸性粒细胞相对于（+/+）增加了20倍以上，占转基因骨髓细胞的50%。相比之下，成红细胞数量显著减少（60%减少）。然而，这种减少并没有影响红细胞压积测定的外周血红细胞计数（55.3对54.3），这可能反映了红细胞生成从骨髓转移到髓外部位（例如，脾脏，未发表的观察结果）。
IL-5的气道表达导致肺部组织病理学改变。
对成人组织进行的系统大体和显微镜检查显示，除了轻度脾肿大外，肺部仅发现IL-5过度表达的病理表现。最显著的异常包括支气管相关淋巴组织（BALT）扩张(33)白细胞对支气管周围间隙的浸润。这些变化的严重程度差异很大，与图的苏木精/伊红（H/E）切片中的（+/+）相比显示。,a–c。BALT聚集体（以单核细胞为主）被淋巴上皮包围，将其与气道管腔分离。所有接受检查的NJ.1726动物都出现了这些肺部变化(n个= 11). 大多数（54%）显示BALT在所示范围内增加（图。,b条和c（c）). 出于尚不清楚的原因，约27%的3-8月龄动物表现出这种病理学的极端形式（图。
c（c）). 白细胞的积聚与几乎所有大气道周围淋巴组织的扩张有关。这种扩张往往非常严重，导致受影响的气道明显关闭或接近闭塞（图。
c（c）,箭头). 这种极端表型的出现是随机的，不会隔离到特定的鼠笼或鼠群内的位置，也不会缩短转基因动物的寿命。图。
d日高倍镜下显示细支气管和周围白细胞。除了上皮肥大外，淋巴细胞浸润还与支气管上皮的扰动和一些细支气管粘膜下上皮区的增厚有关。
肺组织病理学改变伴随着肺上皮IL-5的表达。(一)野生型(b–d段)NJ.1726和(e（电子）)一只从T细胞表达IL-5的转基因小鼠（品系NJ.1638[22]）在明亮视野显微镜下用苏木精和伊红染色。b条和c（c）是NJ.1726小鼠表型变异的代表性照片。中的箭头c（c）表明一只NJ.1726小鼠的气道几乎被支气管周围淋巴组织的扩张所堵塞。BALT集合的高倍视图(d日)更详细地显示了与这些区域相关的其他组织病理学。e（电子）表明尽管T细胞特异性表达IL-5可将血清水平提高至400-800 pg/ml，但未发生肺部改变，因此NJ.1726小鼠发生的病理是肺特异性IL-5表达的结果。B类，细支气管；光伏肺血管；AS公司，牙槽间隙；BALT公司，支气管相关淋巴组织。条形图：(a–c,e（电子）)200微米；(d日)50微米。
NJ.1726肺部相关的白细胞浸润直接由肺上皮中IL-5的特异性表达引起。图。
e（电子）是来自年龄匹配的转基因动物肺的代表性H/E切片，该转基因动物从T细胞特异性启动子组成性表达IL-5（转基因系NJ.1638[22]）。这些小鼠的血清IL-5高达800 pg/ml；然而，如本文所示，动物没有表现出任何显著的肺部病理（即支气管周围白细胞的增加或BALT的扩张）。
对NJ.1726肺的额外组织学分析表明，由于气道中IL-5的表达，也发生了其他变化。用阿尔西安蓝（pH 2.5）染色检测弱酸性硫酸化粘蛋白的肺切片显示，（+/+）动物的上皮杯状细胞相对较少（图。
一). 相反，NJ.1726小鼠杯状细胞的数量、分布和染色强度增加。这些增加在大支气管上皮中很明显（图。
b条)以及更小更远端的细支气管（图。
c（c）). 马森三色染色（图。,d–f日)结果表明，NJ.1726肺BALT扩张区常伴有胶原沉积（蓝色染色细胞外糖蛋白）和支气管上皮肥大。细支气管和周围BALT的高倍镜显示，上皮肥大涉及纤毛细胞和粘液分泌细胞（图。
（f）,箭头). 有趣的是，所有这些额外的组织病理学变化都与BALT扩张的严重程度无关。几乎所有NJ.1726小鼠都观察到杯状细胞增生、上皮肥大和局部胶原沉积，似乎与IL-5气道表达密切相关。
气道IL-5的表达可诱导杯状细胞增生、上皮肥大和胶原沉积。(a–c)野生型Alcian蓝（pH 2.5）染色(一)和NJ.1726肺切片显示大支气管(b条)和一个更小更远端的细支气管(c（c）). 深蓝色染色区域是含糖蛋白（粘蛋白）的杯状细胞。(d–e日)野生型石蜡切片的Masson三色染色(d日)和NJ.1726(e（电子）和（f）)肺部。深蓝色染色的细胞外物质是胶原蛋白。中的箭头（f）表明支气管上皮肥大。不良事件，气道上皮；B类，细支气管；光伏肺血管；AS公司，牙槽间隙；BALT公司，支气管相关淋巴组织。条形图：(a–e)50微米；(（f）)25微米。。
肺特异性IL-5的表达导致嗜酸性粒细胞在支气管周围间隙积聚和气道内脏嗜酸性粒淋巴细胞浸润。
通过对灌注肺胶原酶处理后回收的细胞进行分析，确定肺实质浸润的总细胞数和成分。结果细胞计数和差异如图所示。
答：。与野生型相比，NJ.1726肺的总细胞浸润增加了四倍，并且以嗜酸性粒细胞为主（～50%）。嗜酸性粒细胞的分数增加与所有其他WBC类型的百分比下降同时发生。然而，如果考虑到NJ.1726肺实质细胞总数的增加，则所有白细胞种群的绝对数量相对于野生型增加。因此，除了实质嗜酸性粒细胞数量增加57倍之外，NJ.1726肺淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞的绝对数量实际上分别比野生型增加了1.8倍和2.1倍。
细胞差异和嗜酸性粒细胞特异性免疫荧光显示支气管周围显著浸润。(A类)NJ.1726小鼠胶原酶消化灌注肺(n个=4）和转基因阴性窝友(n个在评估肺实质细胞数之前，将=3）分散到单细胞悬浮液中。肺实质白细胞的总细胞计数如左侧的直方图所示。不同类型白细胞的相对数量（肺细胞差异）由Wright染色细胞离心制剂测定，如右侧直方图所示。这些数据表示为基于200个细胞的差异得出的每种细胞类型百分比的平均值（±SD）。单声道单核细胞和巨噬细胞；莱姆、淋巴细胞；Eos公司，嗜酸性粒细胞；Neu公司中性粒细胞；桅杆，肥大细胞。(B类)使用抗mMBP多克隆兔抗血清，通过免疫荧光将肺实质嗜酸性粒细胞定位。连续肺切片（4μm）用H/E染色(1,4、和6)，抗mMBP血清(2,5、和7)和预出血血清(三)观察肺组织学和嗜酸性粒细胞浸润。这些照片是NJ.1726小鼠肺部的连续组织切片(1–5)或（+/+）对照动物(6和7).B类，细支气管；光伏肺血管；AS公司，肺泡间隙；BALT公司，支气管相关淋巴组织。棒材：50μm。
使用嗜酸粒细胞颗粒蛋白mMBP的多克隆抗血清，通过免疫荧光证实嗜酸细胞浸润支气管周围间隙（图。
B类). 该多克隆抗血清是用从成熟外周血嗜酸性粒细胞分离的纯化mMBP免疫家兔而制备的(34). 抗血清的特异性通过放射免疫分析和与白细胞胞浆制剂中嗜酸性粒细胞的差异结合来确定（数据未显示）。成熟的嗜酸性粒细胞常见于NJ.1726小鼠的支气管周围间隙，并分布于整个肺实质（图。
B类,1–3). BALT周围嗜酸性粒细胞的集中灶也很常见（图。
B类,4和5). 扩张的支气管周围淋巴结和呼吸上皮几乎没有嗜酸性粒细胞。免疫荧光数据还表明，未检测到广泛的细胞外主要碱性蛋白区域，这表明在NJ.1726小鼠中观察到的病理生理变化不是嗜酸性粒细胞脱颗粒和阳离子蛋白沉积的结果。
肺特异性IL-5的表达也导致嗜酸性粒细胞向气道腔的不同募集。图。比较了（+/+）、NJ.1726和OVA致敏和激发（+/＋）小鼠BAL液中白细胞的总细胞数和组成。NJ.1726中BAL细胞总数相对于（+/+）（1.06×10）没有明显变化5与0.87×10相比5单元格）。转基因动物BAL中白细胞数量没有增加，这与哮喘患者的观察结果一致(35). 此外，这一比较还延伸到BAL中招募的细胞组成诱导的变化。NJ.1726小鼠BAL嗜酸性粒细胞的百分比增加（<1%对7%），达到与人类哮喘患者群体相似的水平(35). 该结果与从OVA致敏和激发（+/+）小鼠获得的BAL细胞的观察结果显著不同。在该小鼠模型中诱导的呼吸道炎症导致BAL细胞总数显著增加（约六倍），这是由于气道内嗜酸性粒细胞数量增加（占BAL细胞总量的60%以上）以及中性粒细胞和淋巴细胞数量少量增加所致。
NJ.1726小鼠的肺部改变并没有导致嗜酸性粒细胞浸润气道管腔。来自7个月龄野生型（+/+）肺的BAL细胞(n个=6），NJ.1726(n个=3），为了进行比较，用雾化OVA（雾化激发后2天评估的BAL细胞）致敏（i.p.）和激发的对照（+/+）动物显示为直方图，显示BAL细胞总数(左边)以及从Wright染色细胞离心制剂中测定的不同类型白细胞的相对数量（BAL差异）(正确的). 每种细胞类型的分数组成表示为200个细胞的差异得出的百分比。数据表示平均值±SD。Mφ，巨噬细胞；莱姆、淋巴细胞；Eos公司，嗜酸性粒细胞；Neu公司中性粒细胞；桅杆，肥大细胞。
肺中IL-5的表达导致AHR的发生。
AHR对胆碱能激动剂的反应是哮喘和其他呼吸系统疾病的生理扰动特征。为了将NJ.1726小鼠中IL-5诱导的炎症变化与这种反应联系起来，我们测量了气道对乙酰甲胆碱激发的反应性。NJ.1726小鼠或野生型动物暴露于不断增加浓度的雾化乙酰甲胆碱，并通过全身容积描记法测量AHR。转基因动物和对照动物的数据(n个=11（每组），作为重复单动物测量的方法收集，并以图形形式显示在图的左侧面板中。
答：。达到50%最大反应性（ED）的乙酰甲胆碱有效剂量200)显示为主要数据右侧的直方图。与野生型对照相比，NJ.1726小鼠对乙酰甲胆碱诱导的气流阻塞的阈值剂量较低。此外，NJ.1726小鼠在组平均剂量反应数据中或当个体NJ.1726 ED的平均值200将测量值与对照动物进行比较（分别为69和197 mg/ml）。我们的AHR测量结果显示，在所检测的动物队列中，乙酰甲胆碱浓度增加的反应几乎没有变化。我们还发现，转基因动物中乙酰甲胆碱诱导气流阻塞的阈值剂量几乎没有差异，这表明乙酰甲胆碱激发的AHR与NJ.1726小鼠BALT扩张的不同严重程度无关。AHR的增加仅限于肺特异性IL-5表达动物，在组成性表达高水平血清IL-5的转基因小鼠（系NJ.1638，[22]）中未观察到这种增加（图。
B类). 这些小鼠中AHR的缺乏表明，雾化乙酰甲胆碱不会对血清IL-5或外周嗜酸性粒细胞数量升高引起上呼吸道或下呼吸道的系统性扰动。白细胞计数高（>400000个细胞/mm三; ∼60%嗜酸性粒细胞）和NJ.1638小鼠组织中普遍存在的高水平嗜酸粒细胞（例如鼻通道）尤其重要，因为它们发生在缺乏广泛肺组织病理学的情况下。因此，从气道上皮表达IL-5的小鼠体内的AHR似乎与在这些动物中观察到的肺组织病理学（即下呼吸道变化）相关，而与IL-5在上呼吸道可能引起的潜在变化无关。
在没有抗原致敏和激发的情况下，AHR仅发生在肺特异性IL-5表达转基因小鼠中。NJ.1726小鼠的气道反应性(A类)和表达T细胞特异性启动子IL-5的转基因小鼠(B类)暴露于雾化乙酰甲胆碱后立即进行测量。在每种情况下，对年龄匹配（3-5个月）的转基因阴性窝友进行测量。对小鼠进行了两次评估，得出了每只动物的平均值。报告的值为组平均值±SD(n个= 11). 这些数据用于推导有效剂量200预计起飞时间200水平（即50%最大响应）如左侧直方图所示。ED公司200NJ.1726转基因小鼠组与对照野生型小鼠有显著差异(*P（P）⩽0.01).
值得注意的是，NJ.1726小鼠表现出的气道反应性是在没有炎症刺激（例如雾化抗原激发）的情况下实现的。相对而言，在原始转基因小鼠中观察到的AHR的增加与卵清蛋白致敏和激发的C57BL/6J哮喘小鼠模型中的观察结果相当（分别为三倍和三到五倍[我们的未发表的观察结果]）。
讨论
IL-5在肺部的特异性表达：类似过敏原诱导的呼吸道炎症的肺部变化。
肺部的炎症反应由细胞因子和趋化因子的表达介导，包括IL-5，主要来源于气道白细胞浸润(4). 我们通过在肺上皮中体外表达IL-5细胞因子，选择性地从气道复制IL-5的表达。虽然使用抗体特异性ELISA检测可以检测到NJ.1726小鼠中的IL-5表达，但尚不清楚这种体外产生的IL-5蛋白是否具有充分的生物活性。然而，由于对COS细胞中异位表达的IL-5的结构-功能研究表明，转染的细胞能够产生功能性IL-5（通过IL-5依赖性细胞系的增殖来测定）(36)，大多数细胞类型都可能产生完全活性的细胞因子。
在NJ.1726小鼠中观察到的显著变化是BALT扩张、杯状细胞增生、上皮细胞肥大、支气管周围嗜酸性粒细胞增多，以及嗜酸粒细胞向气道腔募集。肺中BALT区域主要由B细胞组成，并被认为是抗原摄取区域(33,37). 在NJ.1726小鼠中，这些区域主要由单核细胞（主要是淋巴细胞）控制，因此BALT的扩张可能是IL-5对现有B淋巴细胞群增殖作用的结果(22,38). 如果IL-5效应器的功能部分依赖于旁分泌机制，那么与大气道周围细胞数量相关的特定效应可能是这种调节回路的一种指示。淋巴组织扩张区域的出现在呼吸道疾病小鼠模型中很常见（例如，参见参考文献9)并且可以反映局部细胞因子基因表达。然而，这并不是人类疾病的主要特征，也许突出了啮齿类动物和灵长类动物之间潜在的免疫差异，这些差异反映在对肺部炎症刺激反应的生理差异上。除了对较大气道支气管周围淋巴结的不同影响外，还发生了其他组织学扰动，表明IL-5的慢性表达水平升高会导致肺部病理改变。这些扰动（即杯状细胞数量增加、白细胞聚集物中胶原沉积和气道上皮肥大）几乎发生在所有转基因动物中，是几种人类炎症性肺病（例如哮喘[26,39,40]和支气管肺曲霉病[41]）的一致特征与肺部IL-5水平升高相关。
在没有抗原致敏和激发的情况下，嗜酸性粒细胞浸润支气管周围间质和气道腔是转基因动物的一种诊断表型。由于野生型小鼠的过敏性I型超敏反应（即雾化吸入OVA激发）导致以嗜酸性粒细胞为主的大气道腔浸润，NJ.1726动物的BAL总细胞数没有大幅度增加，表明这些模型之间存在特定差异。除IL-5表达水平升高外，雾化OVA激发还可能导致其他信号（如趋化因子）的表达，这些信号对嗜酸性粒细胞活化和随后从支气管周围间隙迁移至关重要。
不同的TH（H）2细胞因子诱导不同的肺效应器功能：IL-4与IL-5。
两种显性T细胞在肺上皮中的异位表达H（H）目前已有2种细胞因子IL-4和IL-5的报道。使用大鼠CC10启动子表达IL-4会产生病理变化，导致淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞进入气道腔(21). 此外，与野生型对照组相比，IL-4的表达导致大气道上皮细胞肥大，并增加转基因肺的基线气道阻力。令人惊讶的是，所提供的数据还表明，肺中IL-4的表达对乙酰甲胆碱激发的AHR没有明显影响。
由于BAL液中测得的IL-4水平仅为NJ.1726小鼠IL-5水平的4%，因此很难以绝对值比较IL-4和IL-5气道表达的影响。然而，一些定性结论值得注意：(一)而转基因小鼠BAL中IL-4的存在诱导了白细胞气道腔浸润（相对于野生型的五倍），其中包括巨噬细胞（44%）和约等量的淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞（即15-20%），IL-5的表达水平高出23倍并没有改变BAL细胞的总数，只诱导了BAL嗜酸性粒细胞的增加。(b条)转基因小鼠中IL-4或IL-5的过度表达导致组织病理学肺部改变（例如，上皮肥大和BALT增加）。本文报道的IL-5转基因小鼠的组织病理学比观察到的IL-4病理学更明显；然而，这种差异可能是细胞因子相对水平的结果。(c（c）)与IL-4转基因小鼠不同，IL-5在气道管腔中的表达在没有抗原致敏和激发的情况下导致AHR。虽然乙酰甲胆碱激发的AHR也可能是NJ.1726小鼠中较高水平细胞因子表达的结果，但这种病理生理反应与IL-5转基因小鼠中观察到的较高程度的组织病理学相关。
IL-5与导致AHR的信号级联有关。
AHR是一种复杂的病理生理反应，已被证明是几种独立途径的结果。IL-5基因表达的作用、肺中嗜酸性粒细胞的积聚以及AHR的发展一直存在争议。在呼吸道炎症小鼠模型中，许多研究将IL-5的表达与嗜酸性粒细胞向肺部的募集联系起来(41,42); 然而，IL-5表达与AHR之间的相关性则存在更多问题。
在卵清蛋白致敏和激发后，IL-5缺陷小鼠不能发展为AHR和气道嗜酸性粒细胞增多症，这表明IL-5是必需的(17). 此外，经抗IL-5抗体治疗的野生型小鼠的卵清蛋白致敏和激发也导致了嗜酸性粒细胞向肺部的募集和AHR的发生(43). 相反，其他使用抗IL-5抗体的研究表明，嗜酸性粒细胞的气道浸润可以显著减少，而对AHR没有任何影响(11,44). 在最近的研究中，Corry等人(11)有报道称，尽管用IL-4抗体治疗小鼠可以模拟IL-4缺陷小鼠的反应，但用抗IL-5抗体治疗可以消除嗜酸性粒细胞气道浸润，但对卵清蛋白致敏反应的AHR没有影响。已经提出了一些解释来解决这些差异（例如，敏化方案的差异[43]和近交系小鼠变种[45]）；然而，最有可能的是，被动免疫方案可能不完全中和内源性IL-5。这一结论得到了卵清蛋白致敏和激发豚鼠的研究的支持，在这些豚鼠中，低水平的抗IL-5抗体抑制嗜酸性粒细胞浸润到气道，而不影响AHR，而高水平的抗IL-5抗体消除了嗜酸粒细胞募集和AHR(46). 然而，这种效应比肺部细胞对血清IL-5水平升高的反应更为复杂。来自几种非肺细胞类型的具有高血清IL-5水平的转基因动物没有表现出肺部病变（见图。
e（电子）; 22–24）和对乙酰甲胆碱激发反应的AHR测量表明，在没有抗原敏化和激发的情况下，这些小鼠也没有表现出支气管高反应性（见图。; 25, 47).
此处报告的数据表明，与OVA诱导的呼吸道炎症模型不同，NJ.1726小鼠中的AHR与BAL细胞数的变化有关，与哮喘患者群体中观察到的变化相当。这种现象发生在没有抗原敏化和激发的情况下，并且只发生在IL-5的主要来源是肺的转基因动物中。AHR也发生在所有NJ.1726小鼠中，与在这些动物中发现的BALT扩增的巨大差异不平行。该观察结果表明，AHR与BALT的变化无关，相反可能与所有转基因小鼠发生的组织病理学变化有关（例如，杯状细胞增生、上皮肥大和局部胶原沉积）。上述观察结果不能排除IL-5诱导的嗜酸性粒细胞效应器功能的可能性，这些功能是通过支气管周围浸润或招募的BAL细胞介导的，是AHR发生的因素；然而，在NJ.1726小鼠中对这种病理生理反应的诱导表明，肺特异性IL-5的表达是一个足够的炎症信号，可诱导AHR、嗜酸性粒细胞对气道腔的浸润以及肺组织病理学改变。在这一范式中，异位肺特异性IL-5表达再现了与哮喘炎症相关的部分但不一定全部信号。
虽然IL-5在肺部的表达会导致特定的病理生理变化，如AHR，但这些变化的绝对幅度小于许多哮喘患者的观察结果(48). 这表明，物种特异性的病理生理差异或患者群体中发现的病理学差异仅部分是由于IL-5效应器的功能，以及其他炎症信号（如趋化因子表达、IgE或肥大细胞）的存在，可能与IL-5协同作用(49–51)导致疾病症状加重。在NJ.1726小鼠中发现的肺IL-5表达与暴露于外源性炎症刺激的组合效应尚不清楚。这些实验特别有趣，因为它们有可能增强IL-5转基因小鼠中观察到的病理变化，并重现严重呼吸道疾病患者群体中的情况。
