磷脂酰肌醇4,5-二磷酸和Arf6-调节膜交通

PIP累积₂-表达Arf6 Q67L和PIP5激酶的细胞中的阳性空泡

接下来，我们研究了PH-GFP在表达Arf6、Q67L组成活性突变体的细胞中的分布。由于缺乏对膜交通阻断的发生和性质的明确描述，先前对表达Arf6 Q67L的细胞表型的理解受到了阻碍。这些细胞有点突起，尽管并不特别富含F-actin(Radhakrishna等人，1996年)并且经常呈现出扭曲的细胞形态。此外，Arf6的免疫荧光定位在这些细胞中难以分辨(Peters等人，1995年;Radhakrishna等人，1996年). 我们评估了PIP的分布₂在44小时转染后表达Arf6 Q67L的细胞中，发现PH-GFP清楚标记了这些细胞中不同的膜结构(图3)液泡，特别是大簇中的液泡，被肌动蛋白包裹，位于细胞内，用荧光凝集素标记固定细胞的细胞表面（如图所示图3)或者使用脂质染料DiI，在活细胞中（未公布的数据）并没有标记这些结构。这些肌动蛋白涂层的PH-GFP标记结构也在其他类型的细胞中观察到，包括BHK（未发表的数据）和Cos细胞（参见图8)然而，诱导PIP₂-阳性液泡对Arf6是特异性的，而Arf1没有发现。组成活性Arf1突变体Q71L的表达，该突变体稳定地与高尔基复合体结合并导致高尔基形态改变(Zhang等人，1994年)，未诱导PIP的形成₂-阳性液泡也没有PH-GFP结构标记高尔基复合体（未发表数据）。

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图3。

组分活性Arf6诱导PIP的积累₂-阳性的肌动蛋白包被液泡。将Arf6 Q67L和PH-GFP转染HeLa细胞44 h，然后用Arf6抗体固定并探测（顶部），用指骨肽（中部），或用Alexa 594结合刀豆球蛋白A（底部）对表面进行染色。棒材，10μm。

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图8。

PIP 5-激酶和PIP的作用模型₂Arf6调节膜流量。在正常生长条件下（组成，下半部分），膜从管状内体运输，并在Arf6-GTP依赖步骤中与质膜融合，激活PIP 5激酶。从质膜内化后，Arf6上的GTP被水解，生成Arf6-GDP，允许PIP₂要降低的级别。膜与再循环内体融合，然后返回PM完成循环。当GEF活性升高时，如在EFA6（刺激的，上半部分）的过表达中，或在将血清添加到血清饥饿的细胞中时，形成突起。这导致膜被摄取到动态PIP中₂-由于Arf6-GTP可以转化为Arf6-GDP，因此可以快速翻转的阳性大松果体₂水平降低，并通过再循环内体进行分类。然而，Arf6Q67L或PIP 5激酶的表达导致PIP的积累₂内胚体相互连接并融合，形成大液泡膜结构（虚线箭头），阻止膜再循环回PM。

液泡膜积累了完整的和外周膜蛋白，这些蛋白通过未转染细胞中的Arf6内体进行运输。如图所示图4在Arf6 Q67L表达诱导的PH-GFP标记结构中，MHC I、β1-整合素和斑球蛋白（γ-catenin）均富集。也可以观察到这些蛋白在不表达Q67L的细胞中的正常分布(图4). 相反，转铁蛋白受体在表达Q67L的细胞中的分布与未转染细胞中的类似，并且这些空泡结构中没有转铁蛋白接收器，这与之前观察到的HeLa细胞中氯氰菊酯涂层和Arf6调节的内吞再循环系统的区别相一致(Radhakrishna和Donaldson，1997年).

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图4。

Arf6 Q67L的过度表达会将通过Arf6腔室而非转铁蛋白受体的蛋白质捕获到PIP中₂-阳性液泡。用Arf6 Q67L和PH-GFP转染HeLa细胞，并用MHC I、β1-整合素、血小板球蛋白和转铁蛋白受体抗体进行检测，如图所示。棒材，10μm。

PH-GFP标记聚集在表达Arf6 Q67L的细胞中的空泡表明PIP参与₂因此在Arf6功能中是一种I型PIP5激酶。人类PIP 5-激酶α（小鼠PIP 5-酶β的同源物）的过度表达单独导致细胞含有空泡结构，与表达Arf6 Q67L的细胞中形成的空泡结构没有区别。用PH-GFP标记的液泡被肌动蛋白包被并位于细胞内(图5)这些空泡也在表达PIP5激酶的Cos细胞中形成（参见图7). 激酶活性对于空泡的形成是必要的，因为PIP 5激酶突变体D270A的表达缺乏激酶活性(Mejillano等人，2001年)，未诱导其形成（未发表的数据）。在表达人PIP 5激酶的细胞中诱导的液泡，这些细胞标记有MHC I抗体、整合素和斑球蛋白，但没有转铁蛋白受体抗体（未发表的数据），类似于观察到的Arf6 Q67L表达(图4). PIP 5激酶诱导的液泡似乎发生在Arf6激活的下游，因为显性负Arf6的表达并没有阻止液泡的形成（未发表的数据）。此外，在抗体几乎检测不到的低表达水平下，PIP 5激酶对细胞形态没有影响，但可以与野生型Arf6协同形成突起结构（未发表的数据）。与人类PIP 5-激酶α的结果相反本田等（1999）是人类PIP 5-激酶β的同源物，虽然它与Arf6协同形成突起，但在诱导空泡结构方面效果较差（未发表数据）。

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图5。

PIP5激酶的过度表达诱导PIP的积累₂-阳性的肌动蛋白包被液泡。用PIP5激酶和PH-GFP共转染HeLa细胞44 h，固定并用myc公司抗体检测PIP5激酶（顶部），用指骨肽（中部），表面用Alexa 594结合刀豆球蛋白A染色（底部）。棒材，10μm。

PIP2空泡是内胚衍生的

为了进一步表征在表达EFA6和Arf6 Q67L的细胞中观察到的液泡的性质，我们检查了这些结构是否可以由细胞表面的膜承载。由于MHC I是Arf6内体途径的标志物(Radhakrishna和Donaldson，1997年)，我们用抗体内化30分钟来测试表面MHC I是否能进入细胞并传递到PIP₂液泡。在表达EFA6的细胞中，在许多PIP中观察到MHC I抗体₂-在表达20和44小时时观察到阳性空泡和大松果体(图6). 在表达Arf6 Q67L的细胞中，发现MHC I抗体被加载到小PIP中₂-20小时转染后细胞内体结构阳性(图6). 然而，在44小时时，在表达Arf6 Q67L的细胞中没有观察到MHC I的摄取，其中大液泡膜明显。应该注意的是，在20小时时，一些含有大量大液泡结构的细胞没有吸收抗体，这表明随着内膜的积累，细胞停止内化膜。尽管Arf6途径的内吞作用在这一晚期明显被阻断，但在这些空泡结构中观察到内源性（稳态）MHC I(图4)可能在转染早期被内化。这些观察结果表明，EFA6诱导的液泡很容易被来自PM的MHC I标记，而Arf6 Q67L诱导的液泡可以在转染早期被表面抗体标记，但不能在转染后期被标记。

Arf6通过PIP 5-激酶发挥作用

我们的结果与早先的报告一致，该报告显示PIP 5激酶是Arf6的一个重要下游效应器。研究人员本田等（1999）体外鉴定Arf蛋白是PIP5激酶的激活剂，体内研究也表明PIP5蛋白激酶是Arf6在细胞中功能的介导者(本田等，1999年). 这里的观察结果表明，PIP 5激酶的过度表达可以诱导与激活的Arf6相同的形态学变化，并且这些效应不会被Arf6显性阴性突变体的表达所阻断，这表明PIP 5蛋白激酶确实作用于Arf6-GTP的下游。PIP5激酶的高水平表达可能导致PIP增加₂因此，没有显性负Arf6的影响。此外，在我们的研究中，PIP 5激酶与野生型Arf6的低水平表达（在两种情况下均无任何单独作用）协同诱导突起，类似于AlF诱导的膜积聚。这里提供的形态学数据和生物化学证据本田等（1999）提示Arf6-GTP可以结合并激活细胞中的PIP5激酶，导致局部PIP升高₂。

过度表达的PIP 5激酶定位于PM，在Arf6再循环室中观察到低水平表达，特别是当CD阻止再循环时。此外，PIP 5蛋白激酶定位于这些膜与Arf6的核苷酸状态无关（未发表的数据）。我们的数据表明，PIP 5-激酶活性负责介导通过Arf6途径的运输，并且PIP 5-激酶活性的水平由Arf6的核苷酸状态调节。

先前关于PIP5-激酶过表达的报道集中在肌动蛋白细胞骨架的变化，如发育迟缓的肌动蛋白丝的形成(Shibaski等人，1997年)，微绒毛(松井等人，1999年)、应力纤维(山本等人，2001年)肌动蛋白火箭推动的胞外和胞内小泡(Rozelle等人，2000年). 我们重点研究了PIP5激酶表达对细胞膜的影响，并认为早期研究和我们的报告中PIP5酶的作用可能相关。我们偶尔观察到PIP飙升₂-在表达PIP5激酶的细胞中，作为微柱状突起从PM伸出的标记小泡(图7D类；视频4可在http://www.jcb.org/content/vol154/issue5)就像那些Rozelle等人（2000年）。有趣的是，Schafer等人（2000年）现已报道，向细胞内微量注射Arf6 Q67L可诱导内吞囊泡上肌动蛋白彗尾的形成。这些快速膨胀的内体可能是液泡形成和膜交通受阻之前的早期步骤。事实上，它们可能会相互融合，生成液泡，我们可以在HeLa和Cos细胞的后期看到液泡的形成。

Arf6生成PIP的细胞功能₂

Arf6调节PIP的能力₂关键PM蛋白的水平和调节贩运可能为涉及PM结构变化的几个细胞过程服务。在表达Arf6 Q67L或PIP 5激酶的细胞中观察到与细胞粘附相关的蛋白质被困在Arf6空泡中(图4)在24–40小时后对这些细胞的粘附和形态产生影响，导致基底上的足迹减少（未发表的数据）。Zhang等人（1998）有报道称，巨噬细胞中Fc介导的吞噬作用需要Arf6功能。组成活性和显性阴性Arf6突变体均阻断吞噬作用，表明Arf6必须完成GTP-GDP循环才能实现颗粒内吞。与此和我们的数据一致，PIP的生成和删除₂最近已经证明对吞噬作用至关重要。项目实施计划₂吞噬杯下方的水平在内化前短暂增强，然后在颗粒被吞噬时通过刺激PLC恢复正常PM水平(Seastone等人，1999年;Botelho等人，2000年). 结合我们的研究，这表明必须激活Arf6和PIP5激酶才能增加PIP₂然后灭活以促进PIP₂为了发生内化的吞没阶段而移除。此外，一些研究表明包括PIP在内的各种磷脂酰肌醇的转换₂在大胞饮症期间(Amyere等人，2000年;Malecz等人，2000年)，提高了Arf6在这一过程中发挥作用的可能性。最后，PIP的形成和融合之间有一个有趣的相似之处₂我们系统中的小泡和PIP的作用₂在酵母液泡融合过程中，PIP₂液泡栓系和融合时需要(Mayer等人，2000年). 在这两种情况下，由于小泡的结合和融合，形成了较大的液泡。

在分子水平上，PIP的形成和周转₂可以促进许多蛋白质的募集和活性。确实是PIP₂和PIP_三已经证明，既可以招募也可以调节调节膜交通的蛋白质的活性，例如Arf GEF和GT水解激活蛋白(托克尔，1998年). 因此，PIP的生成₂通过控制参与这些过程的蛋白质的募集和活性，在特定位点快速清除后可能提供一种时空调控机制(Martin，1998年).

DNA操作和瞬时转染

EFA6通过PCR从马拉松人类胎脑cDNA文库（CLONTECH Laboratories，Inc.）中克隆，然后穿梭到pFLAG-cmv6（Sigma-Aldrich）中，将FLAG表位放在NH上₂蛋白质的末端。通过测序证实EFA6序列正确。将野生型和突变型Arf6基因从pXS穿梭到pCDNA3.1中。在两种载体中使用Arf6基因获得了相同的结果。myc公司-标记的人类I型PIP 5-激酶α如前所述(Rozelle等人，2000年). 从PLCδ1克隆到pEGFP-N1的PH结构域用作PIP的高亲和力标记₂如前所述(瓦尔奈和巴拉，1998年). 该融合蛋白可与可溶性肌醇1,4,5-三磷酸结合(Hirose等人，1999年); 然而，当膜结合时，它能特异识别PIP₂在磷脂酰肌醇中。在高表达水平下，PH-GFP可以干扰需要PIP的活动₂通过隔离(Raucher等人，2000年)我们观察到表达高水平PH-GFP的细胞中气泡增多。然而，此处所用嵌合体的低水平表达是PIP的一个有用指标₂分配(Botelho等人，2000年;Tall等人，2000年).

HeLa细胞生长在玻璃盖玻片上，并使用前面描述的磷酸钙方法进行转染(Bonifacino等人，1989年)或Fugene 6（罗氏）。通常，在添加DNA后的第二天（～20小时）或第二天，对细胞进行检查。

MHC I抗体内化

添加细胞之前，将含有MHC单克隆抗体（克隆W6/32）的血清培养基在37°C下预平衡30分钟。让细胞内化抗体30分钟，然后固定。为了掩盖与细胞表面结合的抗体，在不存在皂苷的情况下，用未偶联的山羊抗小鼠抗体探测细胞30分钟，然后短暂地重新固定。然后，在皂苷存在的情况下，用Alexa 594偶联的GAM进行探测，观察内化的MHC抗体。

显微镜

转染后20或44小时，按指示处理细胞，在室温下用2%甲醛在PBS中固定10分钟，然后用10%FBS和0.02%叠氮化物在PBS（PBS/血清）中冲洗。在室温下用稀释在含有0.2%皂苷的PBS/血清中的一级抗体培养细胞1小时，然后用PBS/血浆清洗（三次，每次5分钟）。然后用PBS/血清中稀释的荧光标记二级抗体加0.2%皂苷孵育细胞1小时，再次清洗，然后装在玻片上。请注意，在过夜（20小时）转染后出现表型。然而，当更多的细胞表现出表型时，细胞通常在44小时固定。使用63×1.3 NA PlanApo物镜在蔡司510激光扫描显微镜上拍摄图像。图形是使用Adobe Photoshop构建的^®5.5. 对于活细胞成像，Cos细胞被镀在Lab-tek覆盖玻璃室中，玻璃厚度为1号（Nunc）。隔夜培养细胞，第二天转染细胞，再过20小时后成像。在显微镜上观察培养箱时，加入25 mM Hepes（pH 7.4）以保持pH值。

我们感谢R.Weigert、N.Naslavasky、J.Lippincott-Schwartz、C.Jackson、P.Randazzo和E.Korn审阅了这篇文章。我们感谢E.Hellsten和R.Nussbaum分享未公开的数据。

H.L.Yin实验室的工作由美国国立卫生研究院拨款GM51112和GM61203以及美国心脏协会在德克萨斯州的一个附属机构赞助。