应激诱导细胞凋亡过程中磷酸化的蛋白质是系统性红斑狼疮患者自身抗体产生的共同靶点

代谢标记。

Jurkat细胞以2×10的密度培养⁶细胞/ml，在含有以下物质的标记培养基中：45%RPMI 1640，45%RPMI 1640缺乏任一磷酸盐(GIBCO巴西雷亚尔)或蛋氨酸和半胱氨酸(GIBCO巴西雷亚尔)、2 mM谷氨酰胺（Mediatech，Inc.）、5%HI-FCS和5%HI-FCC，这些物质已在10 mM Hepes缓冲液中透析至平衡(西格玛化学公司。密苏里州圣路易斯）。³²P标记的正磷酸盐或³⁵S标记的蛋氨酸和半胱氨酸（杜邦新英格兰核电站（马萨诸塞州波士顿）以0.1 mCi/ml的浓度添加。除非另有说明，否则在37°C下培养细胞10–12小时，以使细胞在每次处理前达到稳定状态。

细胞裂解。

使用nonide P40（NP40）进行细胞裂解(西格玛化学公司。)裂解缓冲液（1%NP40，150 mM NaCl，50 mM Tris，pH 7.8，1 mM EDTA）。使用前立即用1mM钒酸钠补充NP40裂解缓冲液(西格玛化学公司。)以及1:100稀释的100×蛋白酶抑制剂混合物，通过搅拌过夜，将10 mg凝乳抑素、1.5 mg亮氨酸蛋白酶抑制剂、7 mg胃蛋白酶抑素a、850 mg苯甲基磺酰氟、500 mg苯甲脒和5 mg抑肽酶溶于50 ml乙醇中而制备。溶液通过过滤消毒并在室温下储存(21). 所有化学品均购自西格玛化学公司。添加1 ml裂解缓冲液后，将裂解液在冰上培养30分钟，在冷冻微型离心机（5402；Eppendorf Inc.，Hamburg，Germany）中以14000 rpm离心15分钟，然后立即将上清液用于每次实验。

紫外线照射。

将标记的Jurkat细胞放置在浓度为2×10的100×15 mm聚苯乙烯培养皿（Nunc，千橡，CA）上⁶细胞/ml，并以9 cm的距离照射（Stratalinker 2400；Stratagene Corp.，La Jolla，CA）12 s。照射后，在收获前将细胞在37°C下培养指定时间。

γ辐射。

将标记细胞置于50 ml锥形管中，并使用辐照器（Gammacell 1000；Nordion International，Kanata，Ontario，Canada）从铯137源以3300 rad的剂量照射。辐照后，将细胞置于37°C的培养皿中，并在收获前孵育指定的时间。

细胞激活。

用以下抗体处理标记的Jurkat细胞：抗Fas抗体7C11（由印第安纳州布鲁明顿印第安纳大学Michael Robertson提供），来自杂交瘤上清液，最终稀释度为1:500，抗CD3抗体（佛罗里达州希亚莱的Coulter Immunology）浓度为5μg/ml，然后是相同浓度的山羊抗小鼠抗体（宾夕法尼亚州西格罗夫市杰克逊免疫研究实验室）。细胞在收获前在37°C下培养指定时间。

免疫沉淀和Western Blot分析。

用25μl 50%的蛋白a–Sepharose溶液预处理一次裂解液(法玛西亚（位于瑞典乌普萨拉）和5μg兔抗鼠（RAM）IgG（宾夕法尼亚州西格罗夫市Jackson ImmunoResearch Labs.）接种1小时，然后用蛋白A–Sepharose进行两次预处理过夜。沉淀实验中使用了小鼠单克隆抗体（5μg）和5μg RAM，或仅使用3.5-5μl患者血清。收集所有Brigham and Women's Hospital Arthritis Center（马萨诸塞州波士顿）患者的血清，这些患者的血清样本在8个月内提交给Brigham&Women's医院临床免疫实验室，并将其保存在−20°C下，直至使用。健康对照组患者的血清是由P.Fraser（Brigham and Women’s Hospital）赠送的。P.J.Utz通过图表审查确认了诊断和血清特征。在PBS中添加1%BSA（Intergen Co.，Purchase，NY）至总体积500μl，并在4°C冷藏室中旋转2–24小时后，进行免疫沉淀。沉淀的比较显示，长达72小时的培养时间之间没有差异。在冷冻Eppendorf微型离心机中以14000 rpm离心15 s，用添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒的NP40裂解缓冲液洗涤三次，用9%的2-巯基乙醇在SDS加载缓冲液中重新悬浮，煮沸5 min，并在SDS–聚丙烯酰胺凝胶上电泳，以获取沉淀(22). 蛋白质转移到硝化纤维素（Schleicher&Scheull，Keene，NH）进行蛋白质印迹实验，或转移到聚偏二氟乙烯（PVDF），（杜邦–新英格兰核电站)用于磷酸氨基酸分析，并按照指示暴露于放射自显影或进行蛋白质印迹分析(23). 小鼠单克隆抗体4D7，抗bcl-2(法尔敏根（加利福尼亚州圣地亚哥）以1:1000的稀释度进行吸波研究。用3%的BSA在4°C的PBS中隔夜封闭硝化纤维印迹。用与辣根过氧化物酶结合的随机存取存储器显示条带(Amersham公司。（伊利诺伊州阿灵顿高地），在PBS中1%BSA中稀释1:7500，并根据制造商的说明使用增强化学发光进行开发(Amersham公司。).

磷酸分析。

将电泳后转移到PVDF中的免疫沉淀物用水彻底冲洗，暴露以进行射线照相，并用剃须刀片切除适当的条带。如所述，将放射性标记带进行酸水解(24)，但二维电泳是在14°C而不是4°C下进行的。

DNA片段化。

在与使用放射性标记细胞的平行实验中，使用上述触发器诱导未标记Jurkat细胞发生凋亡。在指定的时间收集细胞，并以1000 rpm离心5分钟。通过添加500μl DNA裂解缓冲液（20 mM Tris，pH 7.4，5 mM EDTA和0.4%Triton X-100），并在冰上孵育15 min，混合数次，对细胞颗粒进行裂解。在4°C、14000 rpm下离心5分钟后，用25苯酚：24氯仿：1-异戊醇混合物提取上清液(GIBCO巴西雷亚尔). 接下来，将100μl 5 M NaCl和500μl异丙醇添加到每个试管中，然后在−70°C下培养过夜。样品解冻并在14000 rpm下离心5分钟，用70%乙醇清洗一次，然后在Speed-Vac中干燥。将颗粒重新悬浮在30μl含有0.1 mg/ml RNase A的Tris-EDTA缓冲液中(西格玛化学公司。)并在37°C下培养30 min。添加10μl加载缓冲液后，在0.8%琼脂糖凝胶上分离每个样品中的10μl，相当于每车道100万个细胞，并在紫外线下通过溴化乙锭染色进行可视化。

自身抗原磷酸化伴随细胞凋亡，但不伴随T细胞受体刺激。

结果如图所示。​图11表明自身免疫血清优先沉淀Fas连接反应中磷酸化的蛋白。为了确定这些蛋白在Fas结扎以外的刺激触发的凋亡过程中是否也被磷酸化，选择患者血清用于沉淀³²P-标记的Jurkat裂解物，由受到不同时间的凋亡刺激或激活刺激的细胞制备。动力学分析表明，Fas结扎后1到2.5小时内诱导了自身抗原的磷酸化（图。​（图22 A类)，伽玛射线照射后2.5到4.5小时之间（图。​（图22 B类)，以及紫外线照射后1到2.5小时之间（图。​（图22 C类). 无论凋亡触发因素如何，单个自身抗血清都会沉淀出类似的磷酸蛋白骨干。相反，使用与CD3反应的单克隆抗体结扎T细胞受体复合体，这是一种诱导IL-2生成并增强这些细胞增殖的刺激物（数据未显示），在本实验过程中，既没有诱导新的蛋白质磷酸化，也没有诱导DNA片段化（图。​（图22 天和​和3三 天). 来自无自身免疫性疾病个体的对照血清没有从凋亡裂解物中沉淀磷酸蛋白，也没有从CD3刺激细胞制备的裂解物中析出磷酸蛋白（图。​（图2，2,A–D,正确的). 还测定了凋亡或激活刺激诱导的DNA断裂动力学。如图所示。​图3，三,A–D，无论凋亡刺激如何，DNA片段化的开始与自身抗原的磷酸化大致一致。

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图3

自身抗原磷酸化与凋亡Jurkat细胞中DNA断裂的发生相一致或提前。Jurkat细胞被触发发生凋亡，并在指定时间采集。每个时间点代表总共100万个细胞。按照材料和方法中的描述制备DNA，在0.8%琼脂糖凝胶上分离，并在紫外线照射前用溴化乙锭染色进行可视化。(A类)抗氟治疗；(B类)伽马辐射；(C类)紫外线照射；(天)抗CD3治疗。从最初接触到每次刺激的时间（以小时为单位）显示在每条车道的顶部。分子大小标记的相对迁移（以千碱为单位）显示在每个面板的右侧。

除了凋亡期间自身抗原的磷酸化外，所选的磷酸蛋白似乎会迅速去磷酸化，然后在动力学分析过程中以可复制的方式重新磷酸化（第17页和第23页；图。​图22 B类，条车道1–4). 几种自身抗原，尤其是pp34、pp23和pp17的基础磷酸化水平在每个实验中都有所不同（例如，患者1，图。​图2，2,A–D)，并且似乎与标记时细胞的初始密度有关，密度较小（可能更活跃）的细胞标记更均匀（我们未发表的观察结果）。

自身抗原的磷酸分析。

由于酪氨酸激酶和丝氨酸/苏氨酸激酶都与Fas介导的凋亡信号有关(16,17,19,25,27–30)，我们对所有七种磷蛋白自身抗原进行了磷酸分析。在每种情况下，磷酸化仅限于丝氨酸残基（图。​（图4，4,A–G)，暗示一种或多种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶参与这些自身抗原的磷酸化。

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图4

在Fas介导的凋亡过程中，自身抗原仅在丝氨酸残基上磷酸化。Jurkat细胞被标记为³²用抗Fas单克隆抗体7C11处理过的正磷酸盐，并在2.5小时后用NP40裂解缓冲液溶解。然后用自身免疫血清沉淀蛋白质，在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到PVDF中，并进行放射自显影。单个磷酸蛋白定位在膜上，切除并进行酸水解。在放射自显影分析之前，在水平方向的pH 1.9缓冲液中用双向电泳分离磷酸，然后在垂直方向的pH 3.5缓冲液中分离磷酸。单个蛋白质对应于表中所述的蛋白质​表11如下：(A类)患者1，pp200；(B类)患者1，第54页；(C类)患者7例，第46页；(天)患者11例，第42页；(E类)患者3例，pp34；(如果)患者8例，pp23；和(G公司)患者11，第17页。磷酸标准迁移用圆圈标记如下：磷丝氨酸(pS公司)，磷酸苏氨酸(pT公司)，磷酸酪氨酸(pY型).

使用选定的患者血清从凋亡裂解液中沉淀蛋白激酶活性。

应激激活的丝氨酸/苏氨酸激酶级联与凋亡细胞死亡信号有关(16,17,19,25,31). 这种级联反应中的个别激酶在一定程度上受到磷酸化的调节。因此，应激激活激酶可能直接被自身免疫性疾病患者的血清识别，或在细胞凋亡过程中被招募到先前存在的复合物中。为了测试这种可能性，将未经处理或抗Fas处理的Jurkat细胞的裂解物与个别患者血清沉淀，并进行所述的体外激酶分析(25). 选择了五份血清来包含最初使用体内标记的凋亡Jurkat细胞筛选出的所有七种磷酸蛋白（图。​（图11 A类和表​表1）。1). 此外，还包括一名健康对照患者和6号患者（其血清对Ro蛋白具有单特异性）的血清，以进行比较。图。​图55 A类显示4/5 ANA+患者血清（即患者3、7、8和11）沉淀一种激酶，与未经处理的细胞提取物相比，该激酶在凋亡细胞提取物中的活性增加。在本试验中，健康对照组患者和患者6缺乏激酶活性。磷酸蛋白在34 kD下迁移（图。​（图5，5，条车道4,6,8、和10)，23 kD（车道4,6,8、和10)和46 kD（车道6)在本试验中被鉴定。这些磷酸蛋白的相对迁移类似于图所示的体内磷酸化试验中确定的促性腺激素磷酸蛋白的迁移。​图11 答：。Fas结扎后激活激酶（使用患者7的血清沉淀）的动力学与图所示实验中的DNA片段诱导相关。​图55 B。在本实验中，在处理DNA片段和体外激酶活性之前，在抗Fas单克隆抗体的存在下培养Jurkat细胞指定的时间。在体外激酶试验中首次出现pp46是在90分钟时（图。​（图55 B类)而Fas结扎120分钟后首次观察到DNA片段（数据未显示）。pp46的磷氨基酸分析表明，pp46的体外磷酸化仅限于丝氨酸残基（图。​（图55 C类)，与图中所示的体内结果一致。​图44 C、。使用患者11的血清对pp34和pp23进行类似的动力学分析（图。​（图55 A类，条车道9和10)给出了类似的结果（数据未显示）。这些结果与图中所示的不太严格的时间过程一致。​图22和​和3，三提示在DNA片段化开始之前，患者7和11的免疫沉淀物中存在Fas刺激激活的丝氨酸/苏氨酸激酶。

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图5

自身免疫血清从凋亡的Jurkat裂解物中沉淀丝氨酸激酶活性。在无抗Fas抗体（奇数道）或有抗Fas药物（偶数道）的情况下培养的Jurkat细胞在2.5小时后溶解在NP40裂解缓冲液中，并使用来自指定患者的3.5μl血清沉淀。将单个沉淀物在30°C下进行体外激酶反应30分钟，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到硝化纤维素中，并进行放射自显影暴露2分钟(A类)体外激酶反应。根据图顶部所示患者编号得出的血清与表中所述患者相对应​表1。1面板右侧显示了分子尺寸标记的相对迁移（单位：千道尔顿）。(B类)Fas结扎后的激酶活化动力学，如使用患者7血清制备的免疫沉淀物进行的体外激酶反应所测。从最初接触抗Fas的时间（以分钟为单位）显示在每条车道的顶部。pp46的位置用面板左侧的箭头指示。(C类)体外磷酸化46-kD蛋白的磷氨基酸分析。磷酸标准物的迁移用圆圈标记如下：磷丝氨酸(pS公司)，磷酸苏氨酸(第页)，磷酸酪氨酸(第页).

作者感谢P.Anderson和M.Streuli实验室成员的见解和有益的评论；V.Shifrin、Q.Medley、S.Porcelli和S.Schlossman对手稿进行了批判性审查；Brigham&Women's Hospital Clinical Immunology Laboratory、P.Fraser和J.Jackson提供患者血清；N.Kedersha和M.Robertson分别提供抗bcl-2和抗Fas（7C11）；和J.Reed为bcl-2和新过度表达Jurkat细胞的礼物。

这项工作得到了美国国立卫生研究院向布里格姆妇女医院风湿病和免疫学分部（P.J.Utz）提供的T32 AI07306培训拨款的部分支持；关节炎基金会（P.J.Utz和P.Anderson）；国家卫生研究院资助AI33600和CA67929（P.Anderson）；以及皮博迪基金会。安德森是美国白血病学会的学者。