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《实验医学杂志》。2002年1月7日；195（1）：15–22。
数字对象标识：10.1084/jem.20011341
预防性维修识别码：PMC2196016型
PMID：11781361

反复注射肿瘤坏死因子α成熟的树突状细胞诱导抗原特异性保护小鼠自身免疫

毛里求斯门格斯,1 苏珊·罗纳,1 Constanze Voigtländer公司,1 海克·辛德勒,2 尼科尔·库库奇,1 克里斯蒂安·博格丹,2 克劳斯·埃尔布,三 杰罗德·舒勒,1和曼弗雷德·卢茨1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

成熟的树突状细胞（DC）被认为可以诱导T细胞免疫，而不成熟的DC可以诱导T淋巴细胞耐受。在这里，我们描述了注射用肿瘤坏死因子（TNF）-α（TNF/DCs）成熟的树突状细胞可在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中诱导抗原特异性保护。TNF-α的成熟诱导DC上高水平的主要组织相容性复合物II类和共刺激分子，但它们仍然是弱的促炎细胞因子产生者。注射一次这种带有自身抗原性肽脉冲的TNF/DCs可以改善EAE的疾病评分。这在未成熟DC或用脂多糖（LPS）加抗CD40成熟的DC中无法观察到。连续三次注射来源于野生型的肽脉冲肿瘤坏死因子/树突状细胞导致了肽特异性主要是白细胞介素（IL）-10产生的CD4的诱导+T细胞和EAE的完全保护。体内阻断IL-10只能部分恢复对EAE的敏感性，这表明IL-10在EAE预防中具有重要但并非唯一的作用。值得注意的是，这种保护作用是肽特异性的，因为用无关肽脉冲的TNF/DC不能预防EAE。总之，本研究描述了TNF-α的刺激导致不完全成熟的DC（半成熟DC），其在体内诱导产生肽特异性IL-10的T细胞并预防EAE。

关键词：树突状细胞、EAE、耐受性、IL-10、TNF

引言

树突状细胞*发展分为未成熟和成熟两大阶段。未成熟树突状细胞作为免疫系统对炎症刺激（如TNF-α）或微生物产物（如LPS）作出反应的前哨细胞存在于外周组织中。这些信号诱导树突状细胞成熟并迁移到次级淋巴器官，在那里它们现在表现为成熟树突状细胞核，表达高水平的MHC II和协同刺激分子，从而实现有效的T细胞启动(1). 进一步的DC-T细胞串扰（例如，通过CD40-CD154相互作用）导致DC完全成熟、细胞因子产生和Th1或Th2极化(2). 然而，这些刺激在刺激DC成熟和细胞因子产生方面也表现出不同的性质(三,4)，这最终可能有助于T细胞活化、Th1/2极化甚至T细胞耐受的不同水平。

位于外周组织（如表皮朗格汉斯细胞）中的未成熟DC是较差的T细胞刺激物，因为它们只表达中等水平的MHC II(5)没有或非常低水平的共刺激分子，如B7-1、B7-2、细胞间粘附分子（ICAM）-1和CD40(6). 当我们生成这样的MHC II时低的/B7公司负/低来自小鼠骨髓（BM）的未成熟树突状细胞，将其用于抗原递呈给异基因T细胞，诱导T细胞无能(7,8). 外周血单核细胞产生的人未成熟DC在体外诱导产生IL-10的调节性T细胞(9)和体内(10). 因此，T细胞与未成熟树突状细胞的相互作用被认为通过诱导T细胞无能或产生IL-10的调节性T细胞而导致T细胞耐受，而成熟树突形细胞则诱导T细胞免疫。

最近，这一观点受到了以下观察结果的挑战：当用成熟刺激物治疗时，树突状细胞可以产生IL-10(11——13)从而产生耐受性。体内实验表明，产生IL-10的DC可抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE；参考文献14和15)或调节对鼻内注射抗原的耐受性(16). 然而，大多数IL-10介导的效应也可能是由于旁观者抑制，因此可能不是抗原特异性的。

在这里，我们研究了在小鼠EAE模型中用TNF-α成熟的DC的耐受性。这些肿瘤坏死因子/树突状细胞产生少量炎性细胞因子，无IL-12 p70和IL-10。然而，在重复注射后，它们会诱导产生IL-10的T细胞和特异性抗原来预防EAE。我们进一步表明，TNF/DCs预防EAE的能力部分依赖于IL-10，并提供数据表明，未成熟DC或LPS+抗CD40成熟DC无法实现这一点。

材料和方法

生成不同的BM-DC。

DC由C57BL/6或IL-10衍生的BM细胞生成−/−小鼠（C57BL/6回交；参考17). 培养物补充高剂量的GM-CSF（200 U/ml；TEBU/PeproTech）或所述的GM-CSF产生细胞系的10%上清液(18). 对于DC成熟，用TNF-α（500 U/ml；TEBU/PeproTech）或LPS（1μg/ml；Sigma-Aldrich；大肠杆菌，0127:B8）在小鼠尾静脉静脉注射前，添加或不添加抗CD40（克隆3/23或HM40，5μg/ml；BD-PharMinen）以及或不添加10μM MOG肽（见下文）。为了生成未成熟DC，在20 ng/ml IL-10（BD PharMinen；参考19). 用于ELISA细胞因子检测的DC培养物在细菌质量24孔板（BD-Falcon）中进行，以避免DC通过细胞转移激活。

FACS公司®分析，单元格排序。

用5μg/ml纯CD40、CD80、CD86 mAb（BD PharMinen）或未稀释N418（CD11c）、NLDC-145（CD205）、MHC II（M5/114）和YN1/1.7.4（CD54）杂交瘤上清液对BM-DC进行染色，然后用10μg/ml羊抗鼠IgG和IgM-FITC（Southern Biotechnology Associates，Inc.）或抗仓鼠Ig-FITC（BD PHARMinen），并用CD11c-PE（均为BD-PharMinen）在冰上复染30分钟，然后用FACScan™（Becton Dickinson）进行分析。

在用磁珠进行细胞分选之前，用0.83%wt/vol氯化铵在37°C的水中处理脾细胞5分钟，以溶解红细胞。为了从脾脏结缔组织中释放DC，用1mg/ml胶原酶III（沃辛顿）、100U/ml DNase I（Sigma-Aldrich）处理单细胞悬浮液30分钟，并用20mM EDTA（Sigma-Aldrich）处理5分钟，如所述(20). 用于浓缩CD4+根据公司手册（Dynal），使用磁性CD4-Dynabeads对T细胞进行阳性选择后，进行分离珠程序。纯度一般>90%。浓缩CD11c+根据制造商的说明，我们使用了CD11c-共轭磁珠（MACS；Miltenyi Biotech）。那里的富集度通常为40-50%。

ELISA法。

在指定时间，使用IL-12 p70、IL-12 p 40、IL-10、IL-2、IL-4和IFN-γ（BD-PharMinen）的ELISA试剂盒在培养上清液中检测脾细胞产生的细胞因子。24、48、72和96小时后取脾细胞再刺激上清液，立即冷冻或测试。为了检测树突状细胞产生的IL-10、IL-12 p40和IL-12 p 70，在分析上清液之前，将细胞与指示刺激物或50 ng/ml佛波酯醋酸盐（PMA；Sigma-Aldrich）加500 ng/ml离子霉素（Sigma-Aldrich）培养24 h。

核糖核酸酶保护试验。

通过指示的刺激在DC中诱导细胞因子RNA的产生4、7和24小时，并按照制造商的说明使用RPA试剂盒（BD PharMinen）进行检测。

EAE诱导、DC治疗和其他因素。

在C57Bl/6小鼠中使用MOG肽35-55（Sigma Genosys）来诱导EAE。简单地说，将50μg MOG肽（或在一个实验中额外50μg OVA 323–339肽）皮下注射到50μl PBS中，PBS在50μl CFA中乳化，然后用10 mg/ml结核分枝杆菌（H37Ra，Difco/BD PharMinen）进一步富集。此外，在第0天和第2天腹腔注射200 ng百日咳毒素（List/Quadratech）。在我们的小鼠中诱发EAE的发生率为90%，但EAE发病日期在第8-11天或第14-17天之间有所不同，具体取决于MOG肽的批次。因此，在每个实验中都包括一个未经治疗的对照组。根据以下分数评估瘫痪情况：1=全尾，2=后肢，3=完全背部，4=前肢（即完全瘫痪，这些小鼠被杀死）。注射DC（2–2.5×106（静脉注射）刺激后4小时，肽脉冲（见上文）一次或重复，如图图例所示。大鼠抗鼠IL-10R单克隆抗体（由比利时布鲁塞尔布鲁塞尔大学M.Goldman提供）和同型对照单克隆抗体作为细胞工厂（Integra Biosciences）中的浓缩物制备，并在EAE诱导前（第0天）与DC相同的日子（第−7、−5、−3天）以每只小鼠0.5毫克当量的剂量腹腔注射此外，在第-1天和第1天。

结果

用TNF-α刺激可诱导DC成熟，但细胞因子产量低。

为了研究典型DC刺激之间的可能差异，我们用TNF-α、LPS或LPS加抗CD40治疗小鼠BM产生的DC 24小时。未经处理的BM-DC通常由未成熟和自发成熟DC的异质混合物组成(18)未用于进一步分析。为了进行比较，我们通过在BM-DC培养基中添加IL-10来生成特定的未成熟DC(19). 未成熟DC不表达成熟标记物（CD205、CD25），MHC II和共刺激分子CD80、CD86和CD40水平较低(图1a） ●●●●。相反，在成熟树突状细胞上，所有这些标记物均上调，但在用TNF-α、LPS或LPS加抗CD40刺激后相对较高(图1a） ●●●●。除了CD40在LPS加抗CD40刺激的树突状细胞上的表达稍高外(图1a） ●●●●。

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DC的表面表型和细胞因子产生与TNF-α一起成熟。（a） C57BL/6小鼠在有IL-10的情况下产生DC，直到第8天，以抑制其成熟，或在没有IL-10的条件下，再加上TNF-α或抗CD40加LPS的额外刺激过夜。FACS公司®分析显示CD11c的指示标记（直线）或同型对照（虚线）的表达+生命之门内的细胞。直方图中的数字表示标记的平均荧光值减去同型值。（b） 将DC在24孔板中培养至第8天。然后，在不转移的情况下用TNF-α、抗CD40、LPS或其组合刺激细胞24小时，然后用ELISA检测上清液中的细胞因子含量。（c） 如图所示，在第8天刺激树突状细胞，24小时后收获树突状细胞核。通过核糖核酸酶保护试验检测mRNA表达水平。（a）的数据代表了六个以上的数据，而b和c的数据分别代表了三个具有类似结果的独立实验。

然而，不同刺激DC之间细胞因子的产生差异显著。IL-12 p70和IL-10的产生完全依赖于LPS刺激，单用TNF-α治疗后无法检测到(图1b） ●●●●。IL-12 p40的基本水平由所有类型的DC产生，但LPS强烈增强。此外，在6和16小时（未显示）后通过逆转录（RT）-PCR或4和7小时（未示）或24小时后通过RPA在TNF/DC中未检测到IL-10的mRNA(图1c） ●●●●。IL-1β和IL-6的mRNA水平在TNF-α或LPS单独作用下成熟的DC培养物中较低，但在LPS加抗CD40刺激的培养物中显著升高(图1c） ●●●●。

这表明DC成熟刺激的质量主要取决于细胞因子的产生水平，而不是表面标记的表达。因此，我们比较了细胞因子虚弱的TNF/DC（半成熟或不完全成熟），细胞因子坚强的LPS/CD40/DCs（完全成熟）和未成熟DC在自身抗MOG肽脉冲后影响EAE的能力。

通过重复注射TNF-DC预防EAE的肽特异性。

通过各种方法产生的未成熟树突状细胞已被证明能诱导T细胞无能或调节性T细胞，并能在小鼠中以耐受性方式发挥作用(8,21,22)，老鼠(14)，和人类(10). 因此，我们通过持续存在IL-10来生成未成熟DC(19)，用自身抗MOG肽35-55对其进行脉冲处理，并在EAE诱导前3天将其静脉注射到小鼠体内。然而，EAE评分不受这些不成熟DC的影响(图2a） 或MOG-脉冲DC与LPS和抗CD40共同成熟(图2b） ●●●●。此外，三次注射MOG/LPS/CD40/DCs也不能预防EAE（未显示）。令人惊讶的是，在EAE诱导前3天、5天（未显示）或7天单次注射MOG-脉冲TNF/DC可改善疾病进程(图2c） 三次注射彻底预防了这种疾病。EAE的预防依赖于用MOG肽装载TNF/DCs，而未装载的TNF/DC未观察到这种情况(图2d） 或用不相关的OVA肽刺激TNF/DC。

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重复注射TNF/DCs保护EAE DC小鼠的同时用MOG肽脉冲并用TNF-α处理4h（MOG/TNF/DC），在PBS中洗涤，并用2.5×106每组3-4只C57BL/6小鼠静脉注射细胞1次或3次。对照组小鼠未注射DC（未经治疗）。最后一次/唯一一次DC注射后3d诱导EAE，并观察小鼠瘫痪情况。（a） 注射在IL-10存在下产生的未成熟DC，用MOG肽脉冲，并在EAE诱导前3天注射，不具有保护作用。（b） 用LPS加抗CD40成熟的DC和用MOG肽脉冲并在EAE诱导前注射的DC没有保护作用。（c） 在EAE诱导前7天，单次注射MOG脉冲和TNF-α成熟DC可以改善疾病。（d） 在EAE诱导前第−7、−5和−3天注射三次MOG脉冲TNF/DC，但不注射未脉冲TNF/DC，可完全保护小鼠免受EAE的伤害。（e） OVA/TNF/DC无法抵御EAE。作为肽特异性对照，在EAE诱导前的第−7、−5和−3天注射三次OVA脉冲TNF/DC，或不治疗小鼠。在本实验中，在第0天将OVA肽与MOG肽一起在CFA中额外乳化。a–d的数据分别代表了三个具有相似结果的独立实验。

TNF/DCs诱导抗原特异性IL-10产生CD4+T细胞。

为评估三次注射MOG/TNF/DCs或MOG/LPS/CD40/DCs的小鼠完全抑制EAE的机制，在第0天取出脾脏，用MOG肽或无关OVA肽重新刺激，并在24、48、72和96小时后分析培养上清液中的细胞因子含量。三次注射MOG/TNF/DCs后，检测到的主要细胞因子是IL-10，而只有少量IFN-γ，没有IL-2或IL-4(图3a） ●●●●。初步数据表明TGF-β1也不存在（未显示）。相反，三次注射MOG/LPS/CD40/DCs主要诱导IFN-γ，但没有诱导IL-2、IL-4或IL-10，表明诱导了Th1反应，这可以解释为什么这些DC在Th1介导的EAE中没有保护作用。

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反复注射TNF/DCs诱导肽特异性CD4+T细胞产生IL-10，IL-10部分参与EAE保护。（a） TNF/DCs从重新刺激的脾细胞中诱导产生IL-10的细胞。C57BL/6小鼠在−7、−5和−3天接受三次MOG脉冲TNF/DCs或LPS/CD40/DCs静脉注射。在第0天用10μM MOG肽或10μM非相关OVA肽重新刺激这些小鼠的脾细胞。在24、48、72和96小时后取细胞上清液，并通过ELISA检测其细胞因子含量。（b） DC注射诱导的脾细胞产生的IL-10来源于CD4+CD3（CD3）+T细胞，但不是CD11c+DC。C57BL/6小鼠在−7、−5和−3天接受三次MOG脉冲TNF/DC注射。对这些小鼠的脾细胞进行CD4分类+和CD11c+细胞在第0天，然后用PMA和离子霉素刺激24小时，然后用ELISA检测上清液中的IL-10含量。来自CD4+富集细胞97%共表达CD3，污染细胞CD11c+CD4内的细胞+细胞数为0.8～1.4%。（c） 对EAE的保护部分依赖于IL-10。在第−7、−5和−3天（3×）向C57BL/6小鼠（每组3-4只）注射三次MOG/TNF/DCs，并在第0天诱导EAE。在与TNF/DCs相同的日期，以及在第-1天和第1天，向小鼠腹腔注射抗IL-10R单克隆抗体或同种单克隆抗体。对照组小鼠未经DC预处理，也未注射单克隆抗体。（a）的数据代表三个实验，b和c的数据代表两个具有类似结果的独立实验。

尽管体外刺激后未发现TNF/DC产生大量IL-10(图1、b和c)，我们分析了脾细胞悬浮液产生的IL-10是否由我们注射的DC、内源性DC或T细胞分泌。给小鼠注射三次TNF/DCs，在第0天对其脾细胞进行CD4分类+和CD11c+并用PMA和离子霉素刺激。已排序的CD11c+来自未经治疗和TNF/DC注射小鼠的DC在相同范围内产生少量IL-10(图3b） ●●●●。然而，分选的CD4分泌了更高水平的IL-10+CD3（CD3）+注射TNF-树突状细胞后的T细胞(图3b） ●●●●。未注射DC的小鼠T细胞不分泌IL-10。为了测试TNF/DC产生的潜在IL-10是否会影响EAE的预防，我们还注射了来源于IL-10的MOG脉冲TNF/DCs−/−老鼠。然而，野生型和IL-10−/−TNF/DC对完全预防EAE症状同样有效（未显示）。

总之，我们的数据表明重复注射TNF/DC和用MOG肽重新刺激脾细胞后IL-10的主要来源是CD4+CD3（CD3）+T细胞。

EAE的预防部分依赖于IL-10。

由于IL-10是重复注射TNF/DC后检测到的主要细胞因子，我们测试了IL-10在体内的阻断是否会影响EAE的保护作用。因此，我们向接受标准TNF/DC注射和EAE方案治疗的小鼠注射抗IL-10R单克隆抗体或同种对照单克隆抗体。在接受抗IL-10R的动物中，但没有使用同型对照单克隆抗体，对EAE的保护作用部分恢复(图3c） ●●●●。这些数据共同表明TNF/DCs诱导IL-10产生CD4+体内T细胞。当IL-10产生被抗IL-10R阻断时，保护作用被恢复，小鼠出现轻度EAE。这种抗IL-10R的部分作用可能预示着其他调节机制。

讨论

越来越多的证据表明，树突状细胞不仅对T细胞启动起决定性作用，而且也是维持体内自我耐受的关键因素。一般认为，未成熟的树突状细胞具有耐受性，而成熟的树突状细胞具有免疫性。这是基于在小鼠中进行的实验，其中某些物质或方案抑制DC成熟，而这种未成熟DC在体外诱导T细胞无能(8,19)并影响异基因移植(7,23). 这些未成熟DC的耐受性归因于共刺激分子的缺失或低水平表达。然而，最近的研究清楚地表明，协同刺激对于诱导T细胞无能是绝对必要的(24)以及生成调节性T细胞(25). 因此，表达较高数量MHC和共刺激分子的DC不一定具有免疫原性。我们发现有证据表明，DC成熟刺激物调节其细胞因子产生的质量和重复应用模式也可能是DC耐受性的决定性特征。

通过TNF-α、抗CD40或LPS传递的成熟信号在质量上显著不同，以刺激DC产生细胞因子(三,4)，当某一细胞因子存在不同的受体类型时，该细胞因子的作用可能会被进一步调节，如TNF-α通过其TNF-受体-2发挥耐受作用(26). 这里，树突状细胞成熟时有TNF-α保护，不受EAE的影响，但树突状公司成熟时有LPS和抗CD40抗体。与LPS/CD40/DCs相比，TNF/DCs的耐受能力与低促炎细胞因子生成相关。这在多大程度上与我们系统中的EAE保护相关，需要进一步调查。综上所述，TNF-α似乎诱导了DC的不完全成熟，其细胞因子的产生与DC的耐受性相关。

最近的研究描述了能够产生IL-10从而控制自身免疫的DC类型，如预防EAE所示(14,15)或诱导粘膜耐受(16). 对于后者，已经证明产生IL-10的DC表达成熟表面标记物的特征以及它们诱导产生IL-10的调节性T细胞。这些小鼠数据似乎与人类数据不同幼稚构成性表达IL-10 mRNA的单核细胞衍生DC(27)以及低量IL-10蛋白，可通过抗CD40或LPS刺激进一步诱导(13). 虽然在其他研究中，这些未成熟的单核细胞衍生DC没有研究IL-10的产生，但它们与小鼠的数据类似，诱导了IL-10产生的T细胞(9,10). 值得注意的是，处于所谓未成熟状态的DC已经表达了大量MHC II和共刺激分子，因此更像是不完全成熟/半成熟的TNF/DC，而不是我们在本研究中使用的未成熟IL-10/DC。DC在体外和体内诱导产生IL-10的调节性T细胞的要求似乎是DC成熟度和它们产生IL-10的能力的一定程度。然而，当我们从IL-10生成TNF/DC时−/−他们通过T细胞诱导小鼠产生IL-10并阻止EAE（未显示）。

虽然单次注射TNF/DCs可以改善EAE，但需要三次注射才能获得完全保护，这表明抗原递呈的重复性很重要。在体外富集或扩增调节性T细胞似乎需要重复刺激(9)，但单次注射在体内已经有效(10)，表明DC的成熟状态更重要，重复可能只会增强单次注射所显示的效果。

尽管调节性T细胞诱导抑制活性似乎需要抗原特异性刺激，但通过IL-10、TGF-β或细胞-细胞接触介导的效应也可以通过旁观者抑制发挥作用(28,29). 在其他研究中预防EAE(14,15)或诱导粘膜耐受(16)通过产生IL-10的DC，不包括具有无关肽的对照，以显示抗原特异性。在这里，我们发现TNF/DCs诱导肽特异性预防EAE，这不是由于旁观者抑制，因为OVA脉冲的TNF/DC不能影响EAE。外来和自身抗原之间的免疫学区分，体内危险和无害的影响，对维持DC的自我耐受水平尤为重要。因此，诱导产生IL-10的T细胞的TNF-DC呈递抗原的成熟阶段可能代表了一种与免疫生理学相关的耐受机制。

与体外生成的肿瘤坏死因子/树突状细胞最相似的体内对应物是淋巴管中的“被掩盖的细胞”，它们迁移到外周淋巴结，运输组织抗原(30)或凋亡细胞(31)最后表示皮肤衍生DC的一个可区分子集(32). 在所有这些报告中，隐匿细胞和皮肤衍生DC都表现出显著成熟的形态（隐匿！）和表面表型（MHC II高的CD80型+CD86型+CD40型+). 由于在健康的稳态条件下可检测到两种类型的隐匿细胞和皮肤衍生DC，它们可能会积极诱导对引流淋巴结和脾脏中的外周组织抗原的耐受(33,34). 诱导稳态DC迁移的信号尚不清楚。TNF-α可能参与耐受性体内平衡。除了潜在的耐受性作用(26)，它还促进DC迁移(35)，诱导抗原处理(36)上调CC趋化因子受体（CCR）7，引导DC进入引流淋巴结的T细胞区(37). 因此，TNF-α将满足促进次级淋巴器官稳态迁移和耐受性抗原提呈的先决条件。

总之，我们表明，TNF-α而非LPS加抗CD40刺激DC可诱导DC不完全成熟（半成熟）。重复注射这种TNF/DC能够诱导肽特异性IL-10产生CD4+体内T细胞和预防小鼠EAE。这种肽特异性TNF/DC的产生也可能导致针对人类自身免疫性疾病的策略的发展。

致谢

我们感谢亚历山大·斯坦卡瑟尔（Alexander Steinkasserer）和阿明·本德（Armin Bender）对手稿的批判性阅读，感谢米歇尔·戈德曼（Michel Goldmann）和海纳·科纳（Heiner Körner）提供试剂和小鼠。

这项工作得到了爱尔兰根大学ELAN-Fonds（AZ 98.07.42.1）、德意志大学Forschungsgemeinschaft（SFB 263）和Else Kröner-Fresenius基金会的支持。

脚注

* 本文中使用的缩写：BM，骨髓；树突状细胞；EAE，实验性自身免疫性脑脊髓炎。

工具书类

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文章来自实验医学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社