白细胞介素-13选择性刺激和激活转化生长因子β诱导组织纤维化₁

巴尔。

麻醉后，进行胸骨正中切开，通过钝性解剖暴露气管。将22号导管插入气管，通过向气管内滴入1 ml PBS并轻轻吸气进行BAL。这重复了两次。收集每只动物的BAL样品并进行离心分离。对颗粒进行差异细胞计数，上清液在使用前储存在−20°C。

组织学评估。

如前所述进行组织学评估25 33 34简而言之，处死动物，进行胸骨正中切开，用无钙无镁PBS完成右心灌注，以清除肺血管内间隙。然后整体取出心脏和肺，用中性缓冲福尔马林固定至压力（25 cm），在福尔马林中孵育过夜，嵌入石蜡中，切片并染色。苏木精和伊红、马洛里三色和天狼星红染色在位于康涅狄格州纽黑文的耶鲁大学研究病理实验室进行。

可溶性TGF-βII型受体-Fc和抑肽酶治疗。

使用可溶性TGFβR-Fc（sTGFβ-R-Fc）评估TGF-β的作用。该TGF-β拮抗剂含有一种可溶性TGF-？II型受体，与人IgG的Fc片段相连。该构建物的生成方案以及体外和体内功效已在前面进行了描述35 36每隔一天腹腔注射IL-13转基因小鼠（+）和同窝对照小鼠PBS（2 mg/kg），持续8周，从小鼠4周龄开始。使用等效剂量的混合人IgG作为对照。

从ICN公司购买牛肺抑肽酶（6618 KIU/mg）。从小鼠4周龄开始，每天腹腔注射IL-13转基因（+）小鼠和同窝对照（500μg/小鼠），连续4周。按照与溶媒对照相同的时间表给予等量PBS。

信使核糖核酸分析。

如我们实验室之前所述，使用逆转录（RT）-PCR和核糖核酸酶保护试验评估mRNA水平33 37在这些实验中，根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（生命技术公司）获得总的肺RNA，然后使用DNase I（Ambion，Inc.）进行治疗。在RT-PCR分析中，0.5μg RNA被反转录到cDNA和基因特异性引物(表)用于放大每个目标部分的选定区域。根据已公布的序列设计了反应中使用的引物和最佳条件。根据制造商的说明，使用从Promega购买的Access RT-PCR试剂盒，在25μl体积内进行整个反应。所有引物均在耶鲁寡核苷酸合成实验室合成。为了验证在每个RT-PCR反应中添加了等量的未降解RNA，使用β-肌动蛋白作为内部标准。扩增的PCR产物用1.2%琼脂糖-溴化乙锭凝胶电泳检测，电子定量，并通过核苷酸测序确认。根据制造商的说明，使用RiboQuant体外转录试剂盒（BD PharMinen）进行核糖核酸酶保护试验。

TGF-β1的定量。

免疫反应性TGF-β水平₁和TGF-β₂根据制造商的说明（研发系统），使用细胞因子特异性商业ELISA试剂盒进行测定。

免疫组织化学。

TGF-β免疫染色₁在石蜡包埋的组织上进行，这些组织用Streck组织固定剂或中性缓冲4%福尔马林固定。切片后，组织被重新水化，内源性过氧化物酶被H淬火阻断₂O（运行）₂甲醇和组织在微波炉中在柠檬酸盐缓冲液（10 mM，pH 6.0）中处理9分钟（每3分钟3次循环）。用Dako阻断剂（Dako）预阻断15分钟后，多克隆兔抗TGF-β₁抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）以1:100的稀释度施用。在旨在观察是否有合适的肽竞争抗体结合的实验中，抗TGF-β₁用小鼠TGF-β预孵育抗血清₁（R&D Systems）在将其应用于组织之前，以1:1摩尔比放置2小时。在4°C下培养过夜后，用PBS/0.1%吐温20冲洗组织，并使用Envision（Dako）过氧化物酶偶联抗兔二次试剂30分钟。然后清洗玻片，使用3,3′二氨基联苯胺5分钟，并用苏木精对组织进行复染。

原位杂交。

肺组织在甲醛中固定并加工成石蜡。切割5μ切片，脱蜡，在37°C下用蛋白酶K（20μg/ml）处理20分钟，然后在室温下用0.1 M三乙醇胺/0.25%醋酸酐（pH 8.0）处理10分钟，然后用PBS冲洗₁探针（包含小鼠TGF-β的片段₁碱基对1027–1465之间的序列；GenBank Accession，NM-011577）被置于T7和T3启动子位点之间的pBluescript II KS噬菌体中间（Stratagene）。生成正反义RNA探针，用地高辛RNA标记试剂盒（Roche）标记，在65°C下变性，以6 ng/μl的速度添加到商用杂交缓冲液（Ambion）中，并在52°C下与组织培养杂交混合物过夜。然后在室温下用4×SSC清洗两次组织5分钟，在37℃下用2×SSC洗涤两次组织10分钟，并在37℃用RNase A（10μg/ml）培养45分钟。然后在室温下在2×SSC中进行2次10分钟清洗，在50°C下在0.2×SSC内进行3次20分钟清洗。通过用碱性磷酸酶（Roche）标记的地高辛羊抗体隔夜孵育，然后用制造商描述的4-硝基四氮唑氯/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP/NBT）检测探针。

TGF-β生物测定。

为了测量BAL液中TGF-β的生物活性，我们使用了用含有TGF-β响应性人纤溶酶原激活物抑制剂（PAI）-1启动子的构建体永久转染的水貂肺上皮细胞，该启动子与荧光素酶报告基因融合（TMLC，来自纽约州纽约大学医学中心John Munger的礼物）。将这些细胞接种到12孔组织培养板（10⁵每孔每毫升细胞数），加入补充有10%FCS的DMEM中，并让其附着5小时。然后将其洗涤并在含有200μl BAL液体和800μl分析培养基（DMEM与2.5%FCS）的混合物中培养三次。在存在和不存在TGF-β特异性中和抗体饱和量的情况下进行这些培养₁，转化生长因子-β₂，或TGF-β_三（研发系统）。根据制造商的说明，在16小时后使用荧光素酶测定系统（Promega）测量这些细胞中的荧光素酶活性。TGF-β的生物活性₁（转化生长因子-β₁生物活性）被定义为在没有和存在抗TGF-β的情况下培养的相同细胞的荧光素酶活性的差异₁.

Western Blot分析。

使用Centricon 10浓缩器（Amicon）将BAL液体浓缩五倍。在还原条件下，在15%SDS-PAGE凝胶上分离等量的试验样品和对照样品，并转移到PVDF膜（密理博）。然后用5%脱脂干乳封闭膜，用PBS/0.1%吐温20清洗三次，并在室温下在1:200稀释的兔多克隆抗TGF-β中孵育1小时₁，抗TGF-β₂，或抗TGF-β_三抗体（圣克鲁斯生物技术公司）。在用PBS/0.1%吐温20洗涤后，用辣根过氧化物酶结合的驴抗兔抗体（Amersham Pharmacia Biotech）将其培养1小时，再在PBS/0.1%吐温20中重新洗涤，并使用ECL Western blot检测系统（Amersham Pharmacia-Biotech）检测蛋白带。

胶原蛋白测定。

根据制造商的说明，通过使用Sircol胶原蛋白检测试剂盒（Biocolor）定量可溶性胶原蛋白总量来测定肺胶原蛋白总量。简言之，将肺在含有1mg胃蛋白酶（Sigma-Aldrich）/10mg组织残留物的5ml 0.5M乙酸中匀浆。将每个样品在4°C下搅拌培养24小时。离心后，分析100μl每种上清液。然后将1 ml与胶原蛋白特异结合的Sircol染料试剂添加到每个样品中并混合30分钟。离心后，将颗粒悬浮在试剂盒中的1 ml碱性试剂（0.5 M NaOH）中，并使用分光光度计在540 nm处评估光密度。将测试样品中的值与制造商提供的胶原蛋白标准溶液获得的值进行比较，这些胶原蛋白标准液用于构建标准曲线。

Picosirius红色染色和评价。

胶原蛋白含量采用皮克西氏红染色法进行评估。之所以选择这种方法，是因为它准确地反映了用羟脯氨酸测定评估的器官胶原蛋白含量38 39并可对局部胶原积聚区域进行专门评估。在这些化验中，肺切片被天狼星红染色，如前所述40为了检查肺实质，用原始放大倍数为2倍的Olympus BH-2显微镜在偏振光下检查组织。放大后，几乎可以用4-6个视野采集整个肺切片进行分析。使用G3 Macintosh（Apple Computer）中iXTV视频捕获卡（IXMICRO）附带的DXC-970MD Sony摄像机，使用该卡附带的软件进行图像采集。图像被捕获为灰度TIFF编码的视频剪辑。这些在NIH Image中打开并平均以减少噪音。然后对图像进行二维滚动球背景减法，以使背景均匀。用手勾画出薄壁组织区域的轮廓，以排除气道和大血管，然后进行阈值分割。然后记录白色与总像素的数量。白色像素的总数与检查的总像素的比值是胶原蛋白密度的反映。

为了检查气道纤维化，采集了原始目标为4倍目标的图像。只分析了椭圆形或圆形且位于中央支气管血管鞘外的气道。每个场都被采集为常规彩色图像和偏振图像。在NIH Image中打开图像。使用彩色图像勾勒出气道轮廓，以确定面积和短轴。在偏振图像中勾勒出相同的气道，并进行阈值处理以确定白色像素的数量。数据表示为胶原面积与总气道面积。

TGF本地化-β ₁IL-13转基因小鼠。

了解TGF-β的机制₁采用诱导、免疫组织化学和原位杂交（ISH）方法定位并确定TGF-β的位置₁转基因（−）和转基因（+）动物的肺部生产。转化生长因子-β₁转基因动物肺内气道上皮细胞中的蛋白质和mRNA很明显。一些肺泡巨噬细胞中TGF-β、mRNA和蛋白水平也较低(图4和图5和数据未显示）。IL-13转基因（+）小鼠肺部巨噬细胞TGF-β显著增加₁mRNA和蛋白很明显。TGF-β水平较低₁mRNA和蛋白也可在II型肺泡上皮细胞、气道上皮细胞中表达，偶尔也可在这些转基因（+）动物的嗜酸性粒细胞中表达(图4和图5和数据未显示）。在这些免疫组织化学评估中，我们的一级抗体与TGF-β的预孵育₁肽有效地废除了TGF-β的检测₁在这些组织中(图4). 在ISH中，未观察到感测探针的显著染色(图5). 这证明了这些方法的特殊性。因此，肺巨噬细胞是TGF-β的主要生成和储存场所，而气道和肺泡上皮细胞以及嗜酸性粒细胞是TGF--β的较少生成和储存部位₁IL-13转基因（+）动物的肺部。

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图4

转化生长因子-β的免疫组织化学定位₁.免疫组织化学法定位TGF-β的位点₁WT转基因（−）小鼠和CC10-IL-13转基因（+）动物（2-3个月龄）。上皮转化生长因子-β₁可以在转基因（−）动物中观察到（A，原始放大倍数：20倍）。巨噬细胞转化生长因子-β₁增加（C，原始放大倍率：20倍和E，原始放大倍数：40倍，黑色箭头），肺泡Ⅱ型上皮细胞（F，原始放大倍率：40×，白色箭头）和嗜酸性粒细胞（F、40倍，蓝色箭头）TGF-β₁在IL-13转基因（+）动物中可以被识别。在所有情况下，与TGF-β肽预孵育可消除TGF-₁染色（B和D，原始放大倍数：20倍）。

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图5

TGF-β的ISH₁ISH用于确定TGF-β的位点₁转基因（−）和IL-13转基因（+）小鼠（2-3个月龄）的mRNA表达。上皮转化生长因子-β₁mRNA在转基因（−）动物中可以被检测到（A，原始放大倍数：10倍）。增强型巨噬细胞（黑色箭头）和II型肺泡上皮细胞（白色箭头）TGF-β₁在IL-13转基因（−）小鼠（C，原始放大倍数：40倍）和转基因（+）小鼠（E，原始放大倍率：40倍。在B（原始放大倍数：10倍，转基因[−]）、D（原始放大倍率：40倍，转基因[−]）和E（原始放大倍率：40×，转基因[+]）中可以看到没有用感测探针染色。

IL-13对TGF的影响-β ₁激活。

转化生长因子-β细胞因子与转化生长因子-β一起作为生物无活性部分产生₁二聚体与其前肽、潜伏相关肽（LAP）结合。它们在激活后发挥组织作用，这是一个复杂的过程，可能涉及体内的蛋白质水解，并在局部酸化后发生在体外的生物液中41 42 43 44 45因此进行了研究，以确定TGF-β₁IL-13转基因（+）小鼠在BAL液中以生物非活性或自发激活的形式产生。这是通过比较TGF-β₁使用TMLC/PAI-1启动子为基础的荧光素酶生物测定法对转基因（−）和转基因（+）小鼠BAL液中的生物活性进行测定，该方法仅对激活的TGF-β部分产生反应。如图所示图6，显著的TGF-β₁未经处理或经酸处理的转基因小鼠BAL液不具有生物活性。相比之下，令人印象深刻的自发TGF-β水平₁IL-13转基因（+）动物未经处理的BAL液中存在生物活性(图6A） ●●●●。潜在TGF-β₁由于酸化显示TGF-β水平显著增加₁转基因（+）动物BAL液的生物活性(图6B） ●●●●。综合来看，这些研究表明IL-13增加了TGF-β的生成并激活₁在小鼠肺部。

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图6

自发和总TGF-β₁转基因（−）和转基因（+）小鼠BAL液中的生物活性。BAL液取自WT转基因（−）动物和IL-13转基因（+）（IL-13 TG）小鼠。TGF-β水平₁在酸活化之前（A，自发活性）和之后（B，总活性），使用如材料和方法中所述的用含有驱动荧光素酶报告基因的PAI-1启动子的构建体永久转染的水貂肺细胞来评估这些流体中的生物活性。所记录的值代表每类至少四只动物的平均值±SEM*P（P）<0.001与WT。

IL-13对TGF-β相关过程的调节₁激活。

接下来进行的研究旨在阐明IL-13激活TGF-β的机制₁在转基因（+）小鼠的肺部。TGF-β的多种复杂机制₁激活已在前面描述过。包括涉及CD36和血小板反应蛋白-1的途径46 47尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA及其抑制剂PAI-1）41 43 46 48 49，αVβ6整合素44，潜伏TGF-β-结合蛋白（LTBP）-150、CD44和MMP-951为了确定这些途径在IL-13转基因小鼠中是否被激活，我们定量了转基因（−）和转基因（+）动物肺部中编码这些途径关键元素的mRNA水平。在转基因（−）和转基因（+）动物的全肺RNA中，发现编码CD36、thombospondin-1、β6整合素和PAI-1的mRNA水平相似(图7). 相反，发现编码LTBP-1的mRNA水平显著下降，编码uPA、MMP-9和CD44的mRNA含量显著增加(图7).

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图7

IL-13对TGF-β相关过程的调节₁激活。从2–3个月的转基因（−）和转基因（+）小鼠中获得全肺mRNA。通过RT-PCR评估编码所述部分的mRNA水平。每条车道代表一种动物。每个动物的基因型都在图的顶部注明。

uPA/丝氨酸蛋白酶在TGF-β中的作用₁激活。

由于IL-13转基因（+）动物中编码uPA的mRNA水平增加，因此进行了研究以确定uPA（或相关丝氨酸蛋白酶）是否在TGF-β的激活中起重要作用₁IL-13转基因（+）小鼠的肺部。在这些实验中，我们比较了自发生物活性和总TGF-β的水平₁在用纤溶酶/丝氨酸蛋白酶拮抗剂抑肽酶或适当的载体对照物处理过的转基因（+）小鼠的肺BAL液中。显著水平的自发活性或酸活化TGF-β₁在接受抑肽酶或溶媒对照的转基因（−）小鼠的BAL液中未发现(图8). 然而，抑肽酶确实完全消除了TGF-β的自发激活₁在来自IL-13转基因（+）小鼠的BAL液中(图8). 这种下降与总TGF-β水平的适度下降不成比例₁在相同的BAL流体中(图8). 这些研究表明，uPA样丝氨酸蛋白酶在IL-13诱导的TGF-β中起关键作用₁在体内系统中激活。

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图8

抑肽酶对IL-13诱导TGF-β的影响₁生物活性。BAL液是从1月龄至2月龄的转基因（+）小鼠中获得的，用抑肽酶（+抑肽酶）或载体对照进行治疗。自发（A）和酸活化（B）TGF-β₁将这些液体中的生物活性与WT转基因（−）窝鼠对照动物BAL液体中的活性进行比较。所示值代表每组至少四只小鼠的平均值±SEM。P（P）< 0.01.

MMP-9和CD44在IL-13诱导TGF-β中的作用₁激活。

当MMP-9出现在细胞表面CD44分子上时，可以激活TGF-β细胞因子51因此，确定MMP-9在TGF-β中的作用₁激活CC10-IL-13转基因（+）小鼠与MMP-9或CD44无突变的小鼠杂交。自发和总TGF-β₁然后比较具有WT和MMP-9或CD44基因座缺失的CC10-IL-13小鼠BAL液中的生物活性。自发生物活性TGF-β₁未在WT转基因（−）窝友对照动物或MMP-9或CD44无效突变动物的BAL液中发现(图9以及未示出的数据）。如上所述，具有自发生物活性的TGF-β₁在含有WT MMP-9基因座的CC10-IL-13转基因（+）小鼠未经治疗的BAL液中发现(图9). 有趣的是，MMP-9的无效突变导致自发活性TGF-β水平显著降低₁CC10-IL-13转基因（+）小鼠BAL液中(图9A） ●●●●。总的来说，来自CC10-IL-13/MMP-9的BAL液^−/−小鼠体内TGF-β含量为57±5%₁CC10-IL-13/MMP-9作为BAL液的生物活性^+/+动物(P（P）< 0.01). TGF-β的减少₁生物活性不是由于IL-13分泌或总TGF-β减少所致₁由于BAL IL-13和酸活化总TGF-β水平相似而产生₁在WT和MMP-9基因座为空的转基因（+）小鼠中发现(图9B和数据未显示）。CD44在MMP-9效应中也没有发挥重要作用，因为自发性激活的TGF-β水平相似₁在具有WT和CD44基因座为空的IL-13转基因（+）小鼠中发现（数据未显示）。这些研究表明MMP-9在IL-13诱导的TGF-β中起关键作用₁激活，但不在IL-13诱导的TGF-β刺激中₁在我们的转基因系统中生产。他们还证明这些TGF-β₁–在缺乏CD44的情况下可以看到MMP-9的激活作用。

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图9

MMP-9在IL-13活化和TGF-β诱导中的作用₁BAL液是从转基因（−）和转基因（+）CC10-IL-13小鼠获得的，WT（+/+）和空白(^−/−)MMP-9位点。自发（A）和总（B）TGF-β水平₁按照材料和方法中的描述，分别在酸活化前后评估这些BAL液的生物活性。所示值代表每组至少四只小鼠的平均值±SEM*P（P）< 0.01.

作者谨感谢提供所用试剂的调查人员和机构，以及苏珊·阿尔迪托和凯萨琳·贝蒂尔提供的出色的秘书和行政协助。

这项工作得到了HL-56389、HL-61904和HL-64242（给J.A.Elias）、HL-60539（给P.Noble）、HL-47328（给R.M.Senior）以及Alan和Edith L.Wolf慈善信托（给R.M Senior的）的资助。