在P55 Tnf受体水平将促炎因子与肿瘤坏死因子（Tnf）的免疫抑制特性解耦联

免疫接种。

抗原在含有1 mg/ml的CFA（Sigma-Aldrich）中乳化结核分枝杆菌H37Ra。用每只小鼠含50μg H37Ra的CFA中30μg牛髓磷脂碱性蛋白（MBP；Sigma-Aldrich）足垫免疫9天后，从小鼠（7-11周龄）分离的腘淋巴结中检测T细胞启动。在用30μg MBP或50μg OVA（Sigma-Aldrich）尾基免疫小鼠后的指定时间点，在每只小鼠含有100μg H37Ra的CFA中检测小鼠脾脏中的T细胞“记忆”。或者，在IFA中用30μg MBP进行二次脚垫免疫后5天，在一次尾基免疫后11–15周，在腘淋巴结中检测T细胞“记忆”。

T细胞增殖测定。

在指定的时间点评估总LN或脾细胞的T细胞增殖反应。红细胞裂解后，在平底96孔板中以7×10的密度培养细胞⁵每口井。培养基由补充5%FCS的DMEM（血清）组成，我-谷氨酰胺和抗生素。在存在或不存在指示浓度的抗原的情况下，在37°C下培养三硅酸盐培养物。52小时后，用1μCi的[甲基]对培养物进行脉冲处理-^三H] TdR（Amersham Pharmacia Biotech）处理18 H。然后在玻璃纤维过滤器上收集细胞并加入[甲基]-^三H] 用液体闪烁计数法测定TdR。结果表示为刺激指数（抗原刺激培养物的cpm/单独培养基的cpm）。

EAE的归纳和评估。

在雌性B6.TNF中诱导EAE^−/−，B6.p55^−/−和对照C57BL/6小鼠或B6129p55p75^−/−和B6129 F₂用大鼠MOG肽（MOGp35-55，MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK；Sigma-Aldrich）免疫小鼠后。每只小鼠在两侧接受150μg MOGp35-55的小鼠，用总计1 mg H37Ra（Difco Laboratories）乳化。在免疫时和48小时后腹腔注射指定剂量的百日咳毒素（PTx；Sigma-Aldrich）。定期监测小鼠的临床症状，并按照0-5:0的评分标准进行评分，无临床疾病；1、尾部麻痹；2、截瘫（一条或两条后肢不完全瘫痪）；3、截瘫（一条或两条后肢完全瘫痪）；4、截瘫伴前肢无力或瘫痪；5、濒死或死亡的动物。为获得EAE的组织学证据，取下大脑和脊髓，将其浸泡在冰镇的4%磷酸盐缓冲多聚甲醛中3小时，并包埋在石蜡中。制作了5μm厚的脑和脊髓切片。脱髓鞘和炎症程度通过鲁索尔固蓝染色和核固红复染进行评估。所有切片均使用标准的亮场光学系统进行检查，并使用数码相机（3CCD PowerHAD；索尼）采集图像。

髓鞘特异性T细胞反应的回归与p55 TNFR功能无关。

免疫性T细胞失活被认为发生在脾脏生发中心20为了检测TNF对自身免疫的回归是否依赖于p55 TNFR的存在和/或正确的脾结构，我们使用了p55 TNFR-deficient小鼠，与TNF相似^−/−小鼠16生发中心的形成也有缺陷21.MBP免疫B6129.p55^−/−小鼠表现出MBP启动缺陷(图1b） ●●●●。然而，令人惊讶的是，与B6129.TNF形成了鲜明对比^−/−小鼠，MBP特异性T细胞反应在B6129.p55中得到有效控制^−/−小鼠，免疫后49天与B6129小鼠相似(图1b） ●●●●。然而，在免疫后77天，B6129.p55中的MBP特异性T细胞反应^−/−小鼠总体水平较低，但始终高于B6129.TNF中的小鼠^−/负极(图1b） ●●●●。MBP-特异性T细胞回归的TNFR依赖性在B6129.p55p75中得到证实^−/−小鼠，类似于B6129.TNF^−/−小鼠，也未能灭活免疫后49天检测到的MBP-特异性T细胞反应（数据未显示）。总之，这些发现表明，TNF对MBP特异性T细胞的灭活与生发中心的形成或p55 TNFR的功能无关，因为它在B6129.p55中不受影响^−/−小鼠。

p55中MBP特异性T细胞反应的差异终止^−/−与TNF^−/−老鼠。

p55 TNFR与T细胞反应终止期间活化T细胞的凋亡清除有关三在没有TNF的情况下MBP-特异性T细胞反应异常延长可能表明T细胞凋亡缺陷。然而，初次免疫后，在B6129.p55中未观察到MBP-特异性T细胞反应性异常延长^−/−小鼠和MBP-特异性T细胞反应最终下降，即使在B6129.TNF中^−/−小鼠。为了研究在没有TNF或p55 TNFR的情况下终止MBP反应的机制，小鼠在CFA中接种MBP，并在11–15周后，当所有组小鼠对MBP的主要反应均已减弱时，在IFA中再次接种MBP(图1). 我们推断，如果MBP-特异性T细胞反应的终止涉及所有活化的MBP-特异性T细胞的凋亡清除，那么在再次激发后，我们将无法检测到T细胞对MBP的反应。B6129小鼠在再次激发5天后表现出强烈的MBP特异性反应(图2)，表明野生型小鼠中抗原特异性T细胞没有被删除，它们被不同的机制灭活，例如无能或耐受。B6129.55页^−/−和B6129.p55p75^−/−与B6129小鼠相比，小鼠表现出明显增加的MBP-特异性T细胞反应(图2)，表明缺乏T细胞凋亡（注意，缺乏p55 TNFR信号的小鼠的T细胞启动受到严重损害；图1)符合p55 TNFR的既定功能三与B6129小鼠类似，在缺乏p55 TNFR的小鼠中，除凋亡外的机制可能控制初级MBP反应，因为此时，在这些小鼠中不容易检测到初级T细胞反应(图1)尽管缺乏MBP-特异性T细胞凋亡(图2). 令人惊讶的是，与所有其他组的小鼠相比，B6129.TNF再次被激活^−/−小鼠未能在排出的LN中诱导任何可测量的T细胞反应(图2). 这些数据表明，在缺乏TNF或p55 TNFR的情况下，髓鞘特异性T细胞反应终止的不同机制，并表明p55 TNFR-在这一过程中具有TNF非依赖性作用。

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图2

B6129.p55中MBP-特异性T细胞应答终止的差异机制^−/−和B6129.p55p75^−/−与B6129.TNF^−/−小鼠。在CFA中用MBP尾座免疫小鼠，11–15周后，在IFA中MBP二次脚垫免疫5d后分离的腘LN中检测MBP特异性T细胞反应。每条曲线表示每个基因型的两只小鼠的刺激指数。显示了两个进行的一个代表性实验。

TNF中MBP的持续反应性^−/−小鼠破坏H-2的抗性^b条MBP诱导的小鼠EAE。

H-2小鼠^b条单倍型通常对MBP诱导的EAE具有抗性。与此一致的是，用30μg MBP对B6129小鼠进行CFA免疫，每只小鼠含有100μg H37Ra，而不联合服用PTx，未能诱导EAE的临床或组织学证据(图3c和图d、和表). 然而，令人惊讶的是，从免疫后4-5周开始，几乎有一半的B6129.TNF^−/−小鼠表现出EAE的临床证据，EAE发展为慢性非缓解性疾病（10/23，最大临床评分2），而B6129和B6129.p55^−/−保持健康（数据未显示）。MBP免疫B6129.TNF的整个脊髓组织学检查^−/−小鼠表现出广泛的炎症和脱髓鞘(图3、a和b）。即使在B6129.TNF中，炎症在组织学上也是明显的^−/−和B6129.p55p75^−/−无临床疾病并影响免疫动物的显著百分比的小鼠，而表现出明显脱髓鞘的小鼠较少(表). 相反，在B6129或B6129.p55中没有观察到炎症或脱髓鞘的组织学证据^−/−小鼠(表). 这些实验表明，由于TNF（但不是p55 TNFR）缺乏而无法控制或灭活MBP特异性T细胞反应，这有效地揭示了B6129小鼠对MBP诱导的EAE的抵抗。

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图3

MBP免疫的B6129.TNF中炎症和脱髓鞘的组织学证据^−/−小鼠。b6129.TNF公司^−/用CFA中的MBP免疫−（a和b）和B6129小鼠（c和d），9-15周后收集组织。分别用核固红和勒克索固蓝染色观察炎症和脱髓鞘。顶部面板中的箭头表示炎症；底部面板中的箭头表示另外的脱髓鞘；显微照片中的数字表示原始放大倍数。

TNF保护MOG敏感背景免受MOG诱导EAE的慢性影响。

为了解决TNF缺乏对易感背景的MOG免疫导致的自身免疫性疾病的影响，TNF^−/将−小鼠回交至C57BL/6小鼠至少六代，通过MOGp35-55免疫和PTx联合用药诱导EAE。与以前的报告一致7 8，临床症状的出现在B6.TNF中延迟了几天^−/−小鼠与C57BL/6小鼠的比较(图4a） ●●●●。然而，令人惊讶的是，尽管发病延迟，疾病总体减少，但在急性发作期恢复后，B6.TNF^−/−小鼠出现慢性进展型EAE(图4a） 与C57BL/6小鼠相比，C57BL/7小鼠仅保持轻微的缺陷(图4a） ●●●●。在单独的实验中，EAE是由MOGp35-55免疫诱导的，无需PTx联合给药，该方案仅在C57BL/6中诱导EAE，而在B6.TNF中不诱导EAE^−/−小鼠（见下文，图7). 尽管B6.TNF^−/−小鼠对疾病的急性发作不敏感，它们发展成晚期慢性传播形式，如图4a（未显示数据）。同样，p55p75^−/−具有MOG-抗性B6129背景的小鼠（129遗传背景赋予的抗性[13]），尽管对EAE急性发作完全不起作用(图4b） 与B6129 F相比，发展了晚期慢性进展型EAE₂对照小鼠(图4b） ●●●●。总之，这些实验表明，尽管在发病期间有益，但TNF缺乏与髓鞘导向的自身免疫病的晚期并发症相关。

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图7

在B6.p55中建立对MOG诱导的EAE的抗性^−/−和C57BL/6小鼠，但不在B6.TNF中^−/−MOGp35-55免疫后。用MOGp35-55免疫小鼠，在每只小鼠含1 mg H37Ra的CFA中诱导EAE。在免疫当天和48小时后，小鼠腹腔注射200 ng PTx。50天后，使用相同的方案再次诱导EAE。每条曲线代表每组的平均临床得分±SD。

增强的MOG-特异性T细胞“记忆”与较高数量的激活/记忆CD4相关⁺TNF中的T细胞^−/−老鼠。

检测MOGp35-55免疫B6.TNF对晚期慢性EAE的敏感性^−/−小鼠与MOG反应性增强有关，在EAE诱导后9-11周测量了对MOGp35-55的“记忆”T细胞反应。尽管C57BL/6小鼠的脾细胞在EAE诱导11周后仍保持了相当程度的MOG反应性，但在B6.TNF中MOGp35-55特异性T细胞“记忆”反应始终较高^−/−小鼠(图5a） ，这在B6.TNF中尤为明显^−/−未收到PTx(图5b） ●●●●。测试B6.TNF中MOG反应性是否增强^−/−小鼠与MOGp35-55特异性T细胞的不受控制的扩增有关，CD44的数量^你好CD45RB^洛CD4细胞⁺对B6.TNF脾脏中的T细胞进行定量^−/EAE诱导后9-11周，−和C57BL/6小鼠(图6). 值得注意的是，CD44^你好CD45RB^洛CD4细胞⁺未免疫B6.TNF的T细胞数量增加^−/−小鼠与对照C57BL/6小鼠的比较(图6). 更重要的是，CD44的数量^你好CD45RB^洛CD4细胞⁺MOGp35-55免疫B6.TNF后，T细胞显著增加^−/−小鼠，但更明显的是没有PTx联合用药(图6). 相反，CD44^你好CD45RB^洛CD4细胞⁺MOGp35-55免疫C57BL/6小鼠的T细胞数量不变，甚至减少(图6). CD44升高^你好CD45RB^洛CD4细胞⁺MOGp35-55免疫B6129.p55p75的脾脏中也观察到T细胞数量^−/−小鼠（42%CD44^你好，54%CD45RB^洛由B6129.p55p75制成^−/−小鼠与25%CD44^你好，44%CD45RB^洛在B6129小鼠中，CD4总量⁺EAE诱导后18周的T细胞）。这些数据表明，TNF影响活化/记忆T细胞的扩增或存活。

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图5

B6.TNF中增强的MOGp35-55特异性T细胞反应^−/−免疫后9-11周。在B6.TNF中诱导EAE^−/9-11周后，在总脾细胞中检测MOGp35-55免疫（a）或不联合PTx免疫（b）的−和C57BL/6小鼠以及T细胞对MOGp25-55的反应。每条曲线表示每个基因型的2-5只小鼠的刺激指数。显示了三个代表性实验中的一个。

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图6

CD44数量增加^你好CD45RB^洛CD4细胞⁺B6.TNF中的T细胞^−/−小鼠。在B6.TNF中诱导EAE^−/−和C57BL/6小鼠，通过MOGp35-55免疫，同时或不同时给予PTx，以及CD44和CD45RB表型⁺9–11周后，通过流式细胞术分析T细胞并与年龄匹配的未免疫小鼠进行比较。每个图描绘了从四到五只小鼠汇集的总脾细胞中的CD4、CD44和CD45RB表型。区域下方的数字代表CD44的百分比^你好或CD45RB^洛CD4细胞⁺T细胞，以总CD4的百分比表示⁺T细胞。总CD4的百分比⁺不同组脾脏中的T细胞没有显著差异。

这项工作得到了希腊研究和技术秘书处的部分支持，欧盟委员会授予QLG1-CT1999-00202和QLK6-1999-02203。