一种新的14千道尔顿蛋白与晚期内体/溶酶体隔间上的有丝分裂原活化蛋白激酶支架Mp1相互作用

抗体

针对谷胱甘肽制备了多克隆抗p14抗血清S公司-p14的转移酶（GST）融合蛋白。针对肽Kp532（CVSDRDGVPVIKVANDSAPEHALR，氨基酸24-46，小鼠MP1，序列数据可从GenBank/EMBL/DDBJ获得，登录号：。{“type”：“entrez-notide”，“attrs”：{“text”：”AF082526“，”term_id“：”3549604“，”term_text“：”AF0082526“}}AF082526型)以及根据制造商的说明在Affi-Gel矩阵（Bio-Rad实验室）上纯化的亲和力。识别myc表位的多克隆抗体来自Gramsch实验室。双磷酸化ERK1/2或MEK1/2的特异性抗体购自新英格兰生物实验室公司Anti-His₆抗Xpress抗体来自Invitrogen，抗CD107a（LAMP-1）抗体来自BD PharMinen。实验室中产生了多克隆抗GST抗体。Alexa 488™、Alexa 568™、Cy3™和德克萨斯州红色标记的二级抗体分别来自Molecular Probes、Amersham Pharmacia Biotech和Jackson ImmunoResearch Laboratories。LysoTracker™、Red DND-99和EGF-罗丹明来自分子探针。抗-EEA1(Rubino等人，2000年)和抗Rab11(Ullrich等人，1996年)抗体是Marino Zerial博士（德国海德堡欧洲分子生物学实验室）慷慨捐赠的。

细胞均质化和膜制备

将EpH4细胞均质化，并在均质缓冲液（250 mM蔗糖、3 mM咪唑、pH 7.4、1 mM EDTA，包含蛋白酶抑制剂混合物、10μg/ml抑肽酶、1μg/ml胃蛋白酶抑制素、10μ/ml亮氨酸肽和1 mM Pefabloc固体化合物）（博林格）中制备核后上清液（PNS），如前所述(格伦伯格和戈尔维尔1992;Fialka等人，1997年;Pasquali等人，1997年). 如前所述，连续蔗糖梯度用于分离不同的膜室(Fialka等人，1997年). 通过0.1M Na萃取从整体膜蛋白中分离外周膜蛋白₂一氧化碳_三，pH值11.0(Fujiki等人，1982年).

2DGE和肽序列测定

蛋白质斑点的2DGE和微测序按照其他地方的详细说明进行(Fialka等人，1997年;Pasquali等人，1997年;Fialka等人，1999年).

间接免疫荧光

EpH4、HeLa和Caco-2细胞用4%多聚甲醛在细胞骨架缓冲液（10mM Pipes，pH 6.8，150mM NaCl，5mM EGTA，5mM葡萄糖，5mM MgCl）中固定₂)用洗涤缓冲液（细胞骨架缓冲液，50 mM NH）三次洗涤淬火至少30 min₄Cl），并用添加了0.3–0.5%Triton X-100的细胞骨架缓冲液进行渗透。对标本进行间接免疫荧光处理，安装在Mowiol（Hoechst）上，最后使用Axioplan2显微镜（蔡司特）进行观察。对于共焦显微镜，样品安装在50%的甘油中，4%n个-细胞骨架缓冲液中的没食子酸丙酯（Sigma-Aldrich）。使用徕卡TCS NT共焦显微镜获得共焦图像，并在使用惠更斯软件（Scientific Volume Imaging）测量的点扩散函数进行反褶积后，使用Imaris和共定位软件包（Bitplane AG）进行处理。

蛋白酶K处理PNS

在室温下，用增加浓度的蛋白酶K（0.01–10μg/ml；GIBCO BRL）处理EpH4细胞中等量的PNS（～0.5μg/μl蛋白质）20分钟。通过添加100 mM PMSF停止反应。未消化的膜材料以100000的价格造粒克免疫印迹分析蛋白质。

双混合屏幕

根据制造商的筛选协议，使用Matchmaker Gal4 two-hybrid System 2（CLONTECH Laboratories，Inc.）进行双混合筛选。诱饵构建物是通过PCR从英国人类基因组绘图项目资源中心（I.M.A.G.E.Consortium CloneID 681056）获得的原始克隆中生成的(Lennon等人，1996年)使用引物引入EcoRI位点NH₂-各片段的末端和PstI位点COOH-末端，并随后将这些片段克隆到pAS2-1中（CLONTECH Laboratories，Inc.）。由此产生的嵌合蛋白由融合在框架中的Gal4 DNA结合域与全长蛋白NH组成₂-p14的末端片段（氨基酸1-48），或两个不同的COOH末端片段（C1，氨基酸43-125；C2，氨基酸80-125）。在滴定适当的3-氨基-1,2,4-三唑浓度以抑制背景His3活性后，将不同的诱饵结构引入酵母菌株HF7c中，测试其自主活化，然后使用克隆到pACT2的小鼠胚胎Matchmaker cDNA文库筛选相互作用的多肽（CLONTECH Laboratories，Inc.）。pAS2-1 C2结构体对3-氨基-1,2,4-三唑具有自激活抗性，因此未用于进一步筛选。

构建和转染

在NH处包含三个myc标记的p14和MP1的标记版本₂通过使用引入适当限制性位点（p14）的引物的PCR或通过将阳性pACT2克隆之一（MP1）直接克隆到pBluescript SK载体中来构建蛋白质的末端，所述pBluescript SK载体包含三个前有Kozak序列的myc序列(Kozak 1999年)那是我们实验室建造的。由此产生的嵌合蛋白（myc）的编码序列_三-p14和myc_三-MP1）被克隆到表达载体pREP10（Invitrogen）中，产生正或反义myc_三-p14构造，pUB6/V5-His（COOH-终端V5-Hi标签的框架外）（Invitrogen）。通过引入编码人类K-ras最后21个氨基酸的连接子序列，构建了CAAX标记的p14(Choy等人，1999年)在p14 cDNA的COOH末端，替换STOP密码子。真正的p14和p14–CAAX都是在His的框架中克隆的₆/Xpress-tag到pEF4/HisC（Invitrogen）以产生NH₂-末端标记的X-p14和X-p14–CAAX表达载体。通过将p14的编码序列克隆到pEGFP-C1中来构建EGFP–p14（CLONTECH Laboratories，Inc.）。根据制造商的建议，通过使用脂质体增强剂（GIBCO BRL）将不同的构建物转染细胞，并最终选择相应的稳定转染剂。

在pGEX6P3（Amersham Pharmacia Biotech）或pET28（Novagen）中构建重组蛋白。

免疫沉淀

转染细胞在PBS中刮取，并通过快速冷冻-解冻循环和超声处理进行溶解。1600离心后克，上清液在IP缓冲液中稀释（10 mM Hepes，pH 7.4，137 mM NaCl，4.7 mM KCl，0.65 mM MgSO₄，1.2 mM氯化钙₂、1%Triton X-100、2 mM NaF、20 mMβ-甘油磷酸和蛋白酶抑制剂（用于细胞均质）。在使用UltraLink™固定化蛋白A（Pierce Chemical Co.）进行预处理后，使用免疫前血清或多克隆抗myc抗体和UltraLink™固定蛋白A或蛋白A单独作为附加阴性对照物，对产生的上清液进行免疫沉淀。用IP缓冲液洗涤三次后，样品在加载缓冲液中煮沸并在SDS-PAGE上进行解析。

甘油密度梯度

通过10万PNS离心浓缩EpH4细胞的总膜克，重新悬浮在提取缓冲液中（20 mM Hepes/KOH，pH 7.0，100 mM KCl，1 mM DTT，1%Triton X-100，2 mM NaF，20 mMβ-甘油磷酸，以及上述蛋白酶抑制剂的混合物），并在冰上提取30分钟。不溶性物质在17000下成丸克将所得上清液（含有p14和MP1）加载到连续甘油梯度（提取缓冲液中为5–35%）的顶部。梯度在270000处离心克在SW41转子中过夜（贝克曼·库尔特）。然后，收集600μl组分，沉淀蛋白质并通过12.5%SDS-PAGE和免疫印迹分析。对于梯度校准，我们使用蛋白质混合物（1μg/μl BSA、4.5 S、2μg/微升醛缩酶、7.3 S、2微克/微升过氧化氢酶、10.0 S和1微克/μl甲状腺球蛋白、19.5 S，在均质缓冲液中），其分布在SDS-PAGE后通过考马斯染色检测。

体外下拉试验

在PBS中通过超声处理制备含有重组蛋白的细菌裂解物。GST和GST融合蛋白与谷胱甘肽-脑葡萄糖（Amersham Pharmacia Biotech）结合，用PBS洗涤，并与含有His的裂解物孵育₆-在室温下标记重组蛋白20分钟。随后，清洗Sepharose-bound蛋白，将其重新悬浮在样品缓冲液中，并通过SDS-PAGE和免疫印迹进行分析。由于报道MP1与激酶不同亚型的体外相互作用中存在杂乱性(Schaeffer等人，1998年)，我们使用了从M.J.Weber（弗吉尼亚州夏洛茨维尔弗吉尼亚大学）获得的GST–ERK2构造。

电子显微镜

将表达EGFP–p14的Caco-2细胞在室温下固定在pH 7.35的0.1M磷酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛/0.1%戊二醛中1小时。然后用0.2M磷酸盐缓冲液洗涤，从培养皿中刮下，并在微离心机中沉淀。然后将细胞重新悬浮在温热的明胶中（磷酸盐缓冲液中为10%），并在微型离心机中以最大速度排斥。冷却后，用聚乙烯吡咯烷酮蔗糖在4°C下渗透明胶包埋细胞过夜，然后按所述进行冷冻切片(Liou等人，1997年). 根据公布的技术对超薄冰冻切片（60–80 nm）进行标记、染色和观察（Jeol 1010；显微镜和显微分析中心）(Parton等人，1997年).

p14与MP1的相互作用

为了研究p14的生物学功能，我们试图确定p14的潜在相互作用伙伴。因此，我们使用p14编码序列的不同部分（全长，NH）进行了两次混合筛选₂-末端和COOH末端片段）作为诱饵与Gal4 DNA结合结构域融合。对于每个构造，我们筛选了1.2–5.6×10⁵小鼠胚胎文库的独立克隆(表). 在阳性克隆中，有几个包含MP1的完整编码区，MP1是一种最近被鉴定为MAPK通路支架蛋白的蛋白质(Schaeffer等人，1998年). 我们获得了与所有三种不同诱饵结构相互作用的MP1克隆(表)这表明相对较小的p14蛋白的不同部分参与了与MP1的相互作用。或者，NH的小重叠₂-COOH终端结构（见材料和方法）可能在与MP1的交互作用中发挥中心作用。

用多种方法进一步证实了p14和MP1之间的相互作用。首先，在GST下拉试验中测试这两种蛋白质之间的直接相互作用。GST标记的p14能够直接与His相互作用₆-T7-MP1型(图8，车道2）。这种相互作用的特异性表现在His的失败₆-T7标记的MP1单独与GST相互作用(图8（第3和第4车道）和超能力₆-标记为p14以废除GST–p14/His₆-T7-MP1交互(图8，车道1）。此外，他的₆-标记的p14与GST弱结合–p14(图8，车道1），提高了自我关联的可能性。

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图8

体外p14和MP1之间的相互作用。重组GST标记的p14（通道1和2）、GST（通道3和4）或GST-ERK2（通道5和6）与重组His孵育₆-T7–单独标记MP1（车道2、3和5）或附加His₆-标记p14（泳道1、4和6）。Ponceau染色显示了底部面板中GST蛋白的数量。

酵母双杂交试验和体外下拉试验中的直接相互作用证明了这两种蛋白质形成复合物的能力。接下来，我们测试了这种复合物是否也能在体内形成。为此，我们构建了表达myc标记的p14或MP1版本的HeLa细胞，并用抗myc抗体进行免疫沉淀。在这些实验中，内源性MP1在myc-p14免疫沉淀中被检测到，内源性p14在myc-MP1免疫沉淀中也被检测到(图9A） ，证明了p14和MP1的体内相互作用。为了进一步分析p14–MP1蛋白的可能复合体，我们在洗涤剂提取100000个蛋白质后分离蛋白质和蛋白质复合体-克在连续甘油梯度上从EpH4细胞中提取PNS颗粒。其中，内源性p14和MP1共分馏，沉降系数类似于～5–6 S(图9B） ●●●●。

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图9

p14和MP1在体内的相互作用：共免疫沉淀和共沉淀。（A） 稳定转染myc的HeLa细胞提取物_三-p14或反向myc_三-以p14构建物为对照，用多克隆抗myc抗体进行免疫沉淀。反向对照（rev）或myc提取物的50%_三-p14表达细胞（p14）作为输入对照进行分析。单独使用固定化蛋白A（PA）或使用免疫前血清（PI）控制非特异性结合。免疫印迹法分析共免疫沉淀MP1。（B） 稳定表达myc的HeLa细胞提取物_三-分析MP1与A中p14的共免疫沉淀。加载20%的提取物作为输入对照。（C） 通过100000离心浓缩EpH4细胞的总膜克将提取的蛋白质加载到5–35%的甘油梯度上，并通过免疫印迹分析收集的组分。显示了已知蛋白质混合物的S值。

体内p14和MP1之间复合物形成的进一步支持来自共定位实验。在过表达Xpress标记的p14和myc标记的MP1的HeLa细胞中，这两种蛋白定位于同一核周LAMP-1阳性区室(图10). 此外，将Xpress标记的p14与K-Ras的高变结构域和CAAX基序融合(Choy等人，1999年)，导致p14的质膜定位，导致共表达MP1有效地补充到相同的位点(图10，底部）。

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图10

p14和MP1在体内的相互作用II：共定位和共定位。HeLa细胞与X-p14（顶部和中间面板）或X-p14–CAAX（底部面板）和MP1-myc瞬时共转染₆培养24小时后，固定细胞并使用抗LAMP-1、抗Xpress和抗myc抗体进行间接免疫荧光处理。棒材，10μm。

我们感谢罗伯特·库兹鲍尔（Robert Kurzbauer）、查斯·弗格森（Chas Ferguson）和玛格丽特·林赛（Margaret Lindsay）在免疫电子显微镜方面的帮助。作者还感谢Manuela Baccarini、Marino Zerial和Michael J.Weber慷慨提供抗体和构建物，以及在整个工作过程中进行的许多刺激性讨论。我们感谢Karin Paiha（I.M.P.）对共焦分析软件的帮助。我们还感谢Rainer Pepperkok在实时显微镜方面的帮助，感谢Manfred Schmid和Andreas Birbach对这项工作的贡献。L.A.Huber和R.G.Parton将这项工作献给托马斯·克莱斯（Thomas Kreis）。

这项工作得到了伯林格·英格尔海姆（Boehringer Ingelheim）的支持，也得到了强生重点捐赠计划（Johnson&Johnson Focused Giving Program）和奥地利科学基金会（FWF，P11446-MED）对L.A.Huber的资助。