脂多糖或全菌在体内阻止炎症单核细胞转化为树突状细胞

老鼠。

从Charles River Laboratories购买5-6周龄雌性C57/BL6J（Ly5.2）、C57/BL5J（Ly5.1）、C3H/HeJ、C3H/ReN或BALB/c小鼠。DO11.10 OVA-TCR转基因T细胞由D.Lo（加利福尼亚州拉霍亚斯克里普斯研究所）提供。IFN-γ（BALB/c-Ifg[tm1 129]）、IL-12p35（c.129S1（B6）-Il12atm1Jm）和IL-12p40（c.129S1-Il12btm1Jm）KO小鼠在BALB/c背景下购得。p35/IFN-γ双重KO是通过杂交从F2代选择携带双重突变的小鼠获得的。BALB/c IL6 KO小鼠由P.Sacerdote（意大利米兰米兰大学）提供。MyD88缺陷小鼠以C57BL/6为背景，并持续喂食抗生素。在喂食抗生素的对照小鼠中，抗生素对单核细胞衍生DC的迁移没有影响。

抗体、细胞表面表型和细胞死亡评估。

以下单克隆抗体购自BD Biosciences：CD4（L3T4）、CD8a（Ly2）、I/A-b、I/A-d、CD11b（Mac-1）、CD11c（N418）、CD45R（B220）、Gr1（Ly-6G）和CD45.2（104）。从R&D Systems购买了一种特异性中和mIL-10的IgG。从相关杂交瘤（HB198）的上清液中纯化F4/80。

使用50μg/ml碘化丙啶进行染色以评估死亡细胞，并使用FACScan™（CELLQuest™软件；Becton Dickinson）进行流式细胞术分析。

菌种和注射制剂。

鼠伤寒沙门氏菌SL7207型(鼠伤寒沙门氏菌233765衍生物hisG46，DEL407[aroA:：Tn10{Tc-s}]）由B.A.D.Stocker（加利福尼亚州斯坦福大学医学院）提供。生成了两株SL7207重组菌株，表达GST-OVA融合基因编码（SL7207-OVA）或单独表达GST（SL7207 pGEX；参考18). 10⁷SL7207-OVA的CFU表达近1μg蛋白质。枯草芽孢杆菌由A.Galizzi（意大利帕维亚帕维亚大学）提供。单个菌落在37°C的鲁里安肉汤（LB；Difco）中培养过夜，第二天以1:10的原始体积重新开始培养，直至达到以下值：对于沙门氏菌，0D₆₀₀=0.35，对应7×10⁸CFU/ml和枯草杆菌到0D₆₀₀=1.0，对应2×10⁸CFU/毫升。

墨西哥利什曼原虫最近从小鼠中分离出的（MNYC/BZ/62/M379株）前鞭毛虫在培养中生长到固定相。用PBS彻底清洗寄生虫并以3×10的速度注射⁶每个注射部位的寄生虫。

小鼠治疗、皮肤炎症诱导和乳胶迁移。

用2.5%阿维汀静脉麻醉小鼠，并在背部皮肤的四个部位剃毛，这些部位由腹股沟或肱淋巴结排出。10⁷, 5 × 10⁴、或10²将细菌CFU稀释至最终体积10μl PBS，并使用Hamilton注射器（Fisher Scientific）进行静脉注射。10⁷在有或无细菌的情况下，注射直径为1μm的FITC-共轭乳胶粒子（Polysciences）作为示踪剂。I-A的迁移^b+或CD11c⁺治疗后1、2或3天，对携带乳胶到DLN的细胞进行评估。在指定时间，处死小鼠，收集、梳理DLN，并用0.25%胶原酶在37°C下处理25分钟，释放细胞（胶原酶D；罗氏）。对细胞进行I-A染色^b或CD11c表达。为了量化，通过细胞荧光测定法和CD11c的绝对数量获得DLN细胞的整个群体⁺或I-Ab⁺携带乳胶珠的细胞按LN测定。分离与注射部位相对应的皮肤区域，通过绿色乳胶珠的微弱视觉外观进行识别，胶原酶处理后释放细胞，并对其进行FACS染色^®如上所述的分析。

腹膜炎性单核细胞或感染皮肤细胞的过继转移。

乳胶⁺如上所述，从腹腔灌洗中收集C57BL/6 Ly5.2小鼠的炎性单核细胞。1–1.25 × 10⁶在有或无10只C57BL/6J Ly5.1小鼠体内注射细胞⁷SL7207的CFU。3天后，处死小鼠，收集DLN，CD45.2⁺/乳胶⁺细胞释放并通过FACS分析^®分析。

为了过继转移感染皮肤的细胞，小鼠每天注射10⁷SL7207的CFU。2天后，收集细胞，在37°C下用100 U/ml链霉素、10μg/ml四环素和50μg/ml庆大霉素孵育2小时，杀死剩余的细胞外细菌。10⁶在C57BL/6J Ly5.1小鼠体内注射细胞。3天后，处死小鼠，收集DLN，CD45.2⁺/乳胶⁺如上所述对细胞进行分析。

可溶性FITC（FITC涂料）的局部应用。

将FITC（Sigma-Aldrich）溶解在浓度为8 mg/ml的丙酮/邻苯二甲酸二丁酯中，并按前述方法将25μl涂敷于与细菌注射区域相对应的刮除背部皮肤的每个区域(5).

乳胶粒子与OVA的共价偶联及免疫方案。

1μm羧基化FITC标记乳胶珠购自Polyscience。根据制造商的说明（Polyscience）与OVA进行共价耦合，50 mM 2除外-(N个-吗啉）-乙磺酸，pH 6.5，用作偶联缓冲液。样品的分光光度评估表明10⁷微球涂有0.25μg OVA。小鼠接种10⁷微球或等量可溶性OVA（0.25μg）²–10⁷). 在小鼠背部皮肤进行了4次10μl注射。

TCR转基因T细胞过继转移。

DO11.10 TCR-OVA T细胞，针对OVA_327–339与I-A结合的肽^d日，采集自脾脏、臂部和腹股沟淋巴结。CD4细胞⁺使用α-CD4（L3T4）磁性微球（Mini-MACS；Miltenyi Biotec）通过阳性选择纯化T细胞，并在37°C下用5μM羧基荧光素琥珀酰酯（CFSE）标记细胞15分钟（分子探针）。

BALB/c受体小鼠静脉注射3×10⁶DO11.10 CFSE标记的T细胞，然后用四种不同的处理进行免疫。我们注射0.25μg可溶性或迟结合的OVA，使细菌浓度增加（10²–10⁷CFU）。或者，给小鼠注射3×10⁵在有或无10μg可溶性OVA的情况下，体外装载BALB/c BM DC⁷细菌CFU或10个², 5 × 10⁴、或10⁷SLpOVA或SLpGEX的CFU（作为对照）。每次实验都将注射10μl 0.25μg OVA、CFA或0.25μgOVA（在CFA中乳化）的小鼠作为对照。3天后，收集DLN，DO11.10 T细胞增殖被评估为CFSE标记的减少。

细菌的细胞内存活。

4 × 10⁶用0.5%脱氧胆酸钠溶解注射小鼠脾脏和DLN的细胞。在LB琼脂上连续稀释细胞裂解物后计数CFU，以量化迁移的活细胞内细菌数量。

抑制含乳胶DC动员是由局部因素引起的。

接下来，我们研究了细菌是否诱导了系统性或局部性的含乳胶DC迁移阻滞。10⁷静脉注射FITC乳胶珠作为阳性对照或与细菌（10⁷CFU）作为阴性对照，或与细菌注射相反，以评估细菌是否控制着DC从远处的迁移。从FITC乳胶珠反向注射细菌不会影响DC迁移，而乳胶和细菌的共同注射再次导致DC迁移受阻（未公布的数据）。因此，细菌或邻近组织细胞释放的局部而非远端因子介导DC迁移的阻滞。同样，也包括革兰氏阳性菌，如枯草芽孢杆菌（10⁷CFU），或寄生虫，例如墨西哥乳杆菌(3 × 10⁶固定相前鞭毛虫），损害DC迁移，尽管阻滞不如革兰氏阴性菌完全(图2A） ●●●●。

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图2。

革兰氏阳性细菌、寄生虫、灭活细菌和细菌脂多糖也可抑制DC动员。（A） 不仅是革兰氏阴性菌，还包括革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌（BS）或类似寄生虫墨西哥乳杆菌能够减少乳胶⁺细胞迁移。乳胶的效率⁺细胞迁移与乳胶迁移的比较⁺报告了注射后3d对照小鼠（100%）的细胞。（B） 细菌的生存能力并不是阻碍DC迁移的必要条件。用不同的方法杀死细菌，以确保灭活方法不会影响乳胶⁺细胞迁移。（C） LPS来自大肠杆菌块状乳胶⁺细胞迁移至DLN的浓度≥1μg。

灭活细菌或单纯的脂多糖足以抑制DC迁移。

已经证明曼氏血吸虫可释放可溶性亲脂因子，通过与腺苷酸环化酶偶联的PGD结合，阻断TNF-α诱导的朗格汉斯细胞（LC）迁移₂受体(19). 同样，活菌可以在原位释放代谢物或因子，干扰DC功能和迁移。因此，我们分析了灭活细菌是否仍然会影响DC动员。鼠伤寒沙门氏菌按照材料和方法中的描述进行灭活。在所有情况下，观察到DC迁移受阻，类似于活菌引起的迁移受阻(图2B） ●●●●。最后，我们询问革兰氏阴性菌细胞壁的一种成分，如脂多糖，是否也能影响DC的迁移。如所示图2C、 增加静脉注射LPS浓度（≥1μg）抑制DC迁移。因此，既不需要活的也不需要完整的革兰氏阴性菌来阻止DC的迁移，排除了由于微生物释放的代谢因子而导致DC迁移消失的可能性。此外，LPS能够减少DC迁移，这一事实支持了Toll样受体（TLR）4参与调节DC分化和/或迁移的可能性。

DC迁移阻塞仅影响注入位置的DC。

如果注射附近产生的炎症反应在物理上阻碍了DC的动员，我们预计DC从炎症反应中未直接定位的近端区域迁移，不会受到细菌的影响。因此，我们研究，通过皮肤接触致敏剂的皮下应用，在有或无细菌注射的情况下，注射部位上覆的表皮细胞迁移到DLN的能力。使用接触致敏药FITC，我们在小鼠皮肤内接种细菌后涂上FITC⁺LC迁移到排水节点。如所示图3，FITC公司⁺CD11c公司⁺DC向DLN的迁移不受细菌的影响。相反，FITC略有增加⁺对细胞进行了观察，证实其作用仅限于局部注射和炎症病灶，和/或仅限于对某些DC或DC前体细胞的作用，例如最有效地在真皮中获得吞噬颗粒的单核细胞衍生细胞(5).

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图3。

细菌不会显著影响LC的迁移特性。（A） 即使存在皮下注射的细菌，LCs也能迁移到DLN。直接涂在剃毛小鼠皮肤上的可溶性FITC可使表皮中的LCs致敏。CD11c的细胞荧光分析⁺FITC公司⁺报告了在同一部位注射（FITC涂料+BT）、对侧注射（FITC-paint+BT对侧注射）或非注射（仅FITC涂料）的小鼠皮肤中迁移的细胞。所有这些数据都代表了两个或多个实验，每个实验一式三份。

DC迁移缺失与免疫反应缺陷相关。

如前所述，作为微粒抗原的FITC微球在缺乏细胞转运的情况下无法进入DLN(5). 因此，我们可以假设从DLN中回收的大多数珠状物是由从外围迁移的吞噬细胞主动运输的。随着注射越来越高浓度的细菌逐渐阻止DC从外周组织迁移，我们希望在将珠状物与越来越高剂量的细菌混合时，逐渐抑制T细胞增殖为共价偶联到乳胶珠的模型抗原。因此，乳胶珠与模型抗原OVA偶联，根据Kearney等人制定的方案，使用OVA特异性转基因T细胞（来自DO11.10小鼠）跟踪体内T细胞扩增(20). 通过流式细胞术追踪转移的T细胞的数量，作为CD4⁺立方英尺/平方英寸⁺细胞和细胞分裂被评估为相关CFSE荧光的随后降低。如所示图4A、 细菌以剂量依赖性的方式抑制OVA特异性T细胞向乳胶OVA的增殖。在保持OVA乳胶珠数量不变的情况下，T细胞分裂的数量逐渐减少到10⁷可溶性OVA诱导的T细胞增殖可以逃逸炎症区域并被APC远端吸收，但不受细菌浓度增加的影响(图4B） ●●●●。然后我们注射鼠伤寒沙门氏菌表达GST-OVA融合蛋白（SL-pOVA）或仅表达GST的同一菌株（SL-pGEX）作为对照。如所示图4C、 只有在非常高的浓度下（10⁷SL-pOVA的CFU）可以检测到一些反应，这比乳胶OVA诱导的反应低得多，尽管细菌释放的OVA量是珠释放量的四倍（参考材料和方法）。这与DLN中极少菌落的恢复有关，可能是由于游离细菌从炎症部位逃逸所致(图4D） 。这些结果并不是由于细菌对DC迁移的普遍直接抑制作用，因为当OVA负载时，骨髓来源的DC与细菌共培养（10⁷CFU），然后在体内注射前广泛清洗，检测到良好的T细胞增殖反应(图4E） ●●●●。总之，这些实验表明，不仅乳胶耦合的模型抗原的呈现受损，而且由于抗原未能到达树突状细胞内的DLN从而促进T细胞增殖，细菌内表达的相同抗原也未呈现。

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图4。

细菌在给药微粒或“细菌”（但非可溶性）抗原后阻止T细胞增殖。（A） 在有细菌存在的情况下，观察到T细胞对微粒抗原增殖的剂量依赖性抑制。将CFSE标记的DO11.10 CD4转移给BALB/c受体小鼠⁺T细胞。10⁷每天注射与0.25μg OVA蛋白共价偶联的羧基化微球，同时增加细菌浓度（范围：10²–10⁷CFU）。CD4的点图⁺CFSE公司⁺报道了皮下注射后3天从DLN收集的T细胞。（B） 0.25μg可溶性OVA在无细胞转运的情况下到达DLN，并由常驻APC提供，在与细菌浓度增加同时注射时激活T细胞。（C）“细菌”重组OVA仅在注射大量（10⁷低剂量的细菌或对照非重组BTpGEX（第一组）不会诱导DO11.10 T细胞增殖。（D） 仅在注射10后⁷细菌的CFU可以在DLN中回收，但不能在脾脏中回收。通过从治疗小鼠的脾脏和DLN收集细胞，并将细胞裂解物涂布在LB琼脂上，评估注射部位的细菌逃逸。（E） 携带可溶性OVA的树突状细胞在单独注射或清除共培养细菌后均可诱导良好的T细胞增殖反应。

细菌注射部位未捕获DC。

伴随DC迁移缺陷的一个共同特征是在细菌注射部位形成强烈的炎症反应。我们对树突状细胞迁移障碍进行了三个假设：（a）沙门氏菌大量存在可能有毒并导致乳胶死亡⁺细胞；（b） 那个乳胶⁺DC可能被困在炎症区域；（c）或者，作为乳胶⁺从皮肤迁移到DLN的DC主要来源于单核细胞进入组织的过程(5)，注射部位的细菌可能会抑制DC与单核细胞的分化，从而阻止其迁移到DLN。因此，我们解决了每一种可能性。在第1、2或3天，通过细胞荧光测定法或免疫组织化学分析与注射部位对应的组织中以下标志物的表达：Gr-1、CD11c、CD11b、F4/80、B220、I-A^b、CD4和CD8。细胞悬液也进行了碘化丙啶染色，以评估细胞死亡数量。凋亡或坏死不太可能导致DC迁移减少，因为最多10%的乳胶⁺细胞对碘化丙啶也呈阳性(图5A） ●●●●。只有少数巨噬细胞（F4/80^你好细胞），但其数量在以后的时间点增加，而很少有CD11c⁺在任何时间点都可以找到。因此，我们认为乳胶⁺细胞局限于感染部位。对微球注射部位的组织进行丙酮提取后恢复的荧光单位进行定量分析，支持了这一结论。我们发现，乳胶和细菌共注入3天后，100%的初始注入荧光被恢复（未公布的数据），而在没有细菌的情况下，约25%的荧光单位离开了迁移细胞内的注入部位(5). 沙门氏菌感染皮肤的免疫组织化学与FACS完全一致^®分析（未发布的数据）。因此，我们可以排除DC迁移的消失是由于乳胶的细胞死亡⁺细胞或捕获CD11c⁺/乳胶⁺皮肤中的细胞。

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图5。

发炎的皮肤细胞没有经历大规模细胞死亡和LN乳胶⁺来自腹膜单核细胞的细胞具有成熟树突状细胞的特征。（A） 只有10%的乳胶⁺发炎皮肤细胞悬浮液中的细胞也是碘化丙啶⁺（死亡）。双色FACS^®FITC胶乳的分析⁺细胞和碘化丙啶在注射10⁷细菌CFU。（B） 腹腔单核细胞负载FITC⁺乳胶珠到达DLN时显示出成熟DC的特征。分离的腹膜单核细胞表达中等水平的Gr1，CD11c、B7.2和CD40均为阴性，FITC乳胶珠均为阳性（顶部）。LN乳胶⁺单核细胞衍生DC下调Gr1的表达，上调CD11c、MHC II、B7.2和CD40的表达。开放直方图显示门控CD11c的表型⁺单元格和填充轮廓显示门控CD11c⁻细胞。（C） 过继移植后第3天检查的LN冰冻切片用B220或DEC-205染色，用Cy3-共轭次级单克隆抗体（红色）检测。通过绿色荧光可以看到乳细胞。

细菌不可逆地阻止DC从单核细胞分化。

接下来，我们讨论了DC从单核细胞分化是否在炎症组织中正常发生的问题。我们从腹腔灌洗获得单核细胞(21)生产乳胶的材料和方法中所述的Ly5.2小鼠⁺单核细胞。收集的大部分乳胶⁺细胞表现出炎症单核细胞的典型特征(图6A： Ly6-c中间水平、F4/80中间水平[未描述]和I-A^b、无CD11c、无B7.2、无CD40和低CD115（M-CSF受体））。CD11c的缺失⁺细胞提示经典DC不存在。80层/四层^你好巨噬细胞可能来源于常驻巨噬细胞，但占单核细胞来源细胞的10%以下（未公开数据），吞噬微球的效率低于新招募的巨噬细胞。因此，虽然一些恢复的细胞可能来自常驻巨噬细胞，但大多数必须来自新招募的单核细胞。FITC乳胶⁺在C57/BL6J Ly5.1小鼠体内注射单核细胞，或者单独注射，或者与细菌一起注射，注射比例为25:1。在受体小鼠中，过继转移的单核细胞可被追踪为CD45.2⁺/乳胶⁺细胞。如所示图6B、 乳胶⁺只有在没有细菌的情况下注射，才能在DLN中检测到过继转移的细胞。LN乳胶⁺细胞显示DC表型(图5B） 类似于内源性迁移单核细胞(5). 许多迁移的单核细胞产生成熟的乳胶⁺MHC-II、B7.2和CD40高表达的DC(图5B） ●●●●。原位发现这些细胞位于T细胞区和滤泡间隙内B细胞滤泡的下方，在那里DEC-205呈阳性染色(图5C） ●●●●。

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图6。

细菌阻碍DC从单核细胞分化。（A） 乳胶⁺腹腔灌洗液中的细胞表现出典型的炎性单核细胞特征：中等水平的Ly6-c和I-A^b、无CD11c、无B7.2和低CD40。在含有GM-CSF的培养基中培养2天后，腹膜单核细胞在DC中分化。相比之下，第2天从皮肤中细菌/乳胶注射部位获得的细胞在从皮肤中恢复后没有显示DC发育的迹象，并且在含有GM-CSF的培养基中培养2或4天后，它们也保留了“单核细胞”表型。（B） 细菌阻碍了共同注射的含乳胶的炎性单核细胞的迁移。乳胶⁺从用巯基乙酸处理18小时和用FITC乳胶溶液处理4小时的小鼠腹腔灌洗液中收集单核细胞。在有或无细菌的情况下，每天注射炎症单核细胞，在注射后3天分析DLN中是否存在乳胶⁺细胞。（C） 注射细菌皮肤中的炎性单核细胞而非炎性细胞能够产生迁移的单核细胞衍生DC。CD45.2型⁺在含有抗生素的培养基中培养腹膜炎性单核细胞（左侧）或感染2天的皮肤细胞（右侧）2小时，以杀死细胞外细菌，清洗并在没有细菌的情况下对Ly5.1小鼠进行i.d.注射。LN Ly5.2-latex⁺注射后3d可见迁移细胞。这些结果代表了三个独立的实验。

根据我们之前的结论，非迁移乳胶⁺注射乳胶和细菌的小鼠皮肤细胞未显示任何DC标记(图6A） ●●●●。此外，当乳胶⁺从皮肤炎症反应中收集细胞，并在没有细菌的情况下进行静脉注射，它们不会产生迁移的DC，这表明DC从单核细胞分化的阻滞是不可逆的(图6C） ●●●●。唯一的乳胶⁺可以在LN中发现的细胞是受体来源的。乳胶培养始终如一⁺感染皮肤的细胞在含有GM-CSF的条件培养基中培养长达4天，不会产生DC(图6A） ●●●●。相比之下，腹腔单核细胞迅速上调CD11c、共刺激分子（CD40和B7.2）和MHC II类（I-A）的表达^b)在DC条件培养基中培养2天后(图6A） ●●●●。这些结果支持这样一种假设，即静脉注射细菌可不可逆地抑制感染部位的炎性单核细胞分化为DC，从而解释了它们无法迁移到DLN。

DC分化的抑制不仅仅是由于TLR4的参与。

我们已经证明，静脉注射量≥1μg的脂多糖（LPS）可诱导与细菌诱导的DC迁移相似的阻滞。因此，我们研究了细菌的作用是否主要由脂多糖介导。我们分析了与LPS或细菌共注射的过继性转移炎性单核细胞在对LPS无反应的小鼠（C3H/HeJ）或对LPS有反应的小鼠中的迁移能力。正如预期的那样，当与LPS或细菌同时注射时，HeN单核细胞在LPS应答小鼠（HeN）中无法迁移(图7A） ●●●●。相比之下，只有当同时注射LPS而不是细菌时，HeJ单核细胞才能够在LPS无反应小鼠体内完全迁移(图7A） ●●●●。由于C3H/HeJ小鼠有一个点突变，它只影响TLR4的功能，因此我们可以得出结论，当我们注射细菌时，除TLR4外，其他可以通过TLRs转导的细菌成分也参与了DC分化的阻断。我们研究了MyD88中细菌的抑制作用是否可以逆转^−/−老鼠。在该菌株中，在没有细菌的情况下，单核细胞衍生DC的迁移是正常的，细菌诱导的阻滞没有逆转。如果细菌的作用依赖于TLR，则反应必须涉及MyD88依赖的信号通路(22)MyD88信令可能占主导地位或冗余。

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图7。

LPS并不完全负责细菌依赖性抑制DC分化，也对招募的炎症细胞产生影响。（A） 每天给C3H/HeN和C3H/HeJ小鼠注射乳胶⁺炎性单核细胞。单核细胞来源于HeN或HeJ小鼠，然后单独或与10⁷同基因和同源菌株中的细菌CFU或10μg LPS。乳胶⁺注射后3d从DLN中回收细胞。细菌总是阻碍乳胶的迁移⁺单核细胞。当注射无反应单核细胞（HeJ单核细胞）时，LPS诱导的DC迁移阻滞完全恢复，但当注射LPS反应性单核细胞到无反应小鼠（HeJ小鼠）时，则没有恢复。（B） 细菌和炎症细胞之间的协同作用介导了DC从单核细胞分化的阻滞。分离出乳胶细胞后，富含硫乙醇酸的炎性单核细胞，并在含有GM-CSF的培养基中单独培养或与沙门氏菌（50:1细菌/单核细胞）一起培养。炎症细胞与细菌孵育后，DC分化抑制率最高可达50%。当除细菌外，炎症细胞比例增加时，抑制率为100%。

细菌的抑制作用与炎症细胞有关。

有趣的是，当HeN单核细胞与LPS同时注射到LPS无反应株中时，它们的迁移能力没有恢复。可能有两种解释，不是相互排斥的，要么是脂多糖本身在一定程度上阻止了单核细胞向DC的分化，要么是一些污染的炎性细胞可能释放了抑制单核细胞分化为DC的因子。LPS非反应性单核细胞无法将树突状细胞分化为LPS反应性受体这一事实支持了后一种可能性，这表明LPS诱导的炎症环境而非细胞自主效应在迁移性树突状上皮细胞的发育或功能中起决定性作用(图7A） ●●●●。然而，我们不能排除细菌或LPS可能对DC分化有直接影响。因此，我们如上所述从腹腔冲洗液中提取炎性单核细胞，并通过分离乳胶纯化炎性单细胞群⁺细胞。然后，我们在含有GM-CSF的培养基中培养含有或不含外部细菌的细胞，并分析产生CD11c的细胞百分比⁺细胞。如所示图7B、 细菌的存在降低了50%炎性单核细胞分化为DC的潜能。当我们加入少量的乳胶时，观察到了更强烈的分化抑制作用，更类似于体内观察到的块状物⁻细胞类型的炎症细胞图6（在使用未分类的腹膜细胞的地方），我们知道留下乳胶⁻含有GM-CSF的二维培养物中的炎性细胞在没有细菌的情况下不会对单核细胞向树突状细胞的分化产生不利影响。当炎性细胞（主要是中性粒细胞）与细菌和标记的单核细胞共存时，单核细胞衍生细胞向树突状细胞的诱导几乎消失。这些数据表明，完全抑制DC分化是通过细菌介导的事件和感染部位的炎性细胞介导的组合实现的。

IL-10、IL-6、IL-12或IFN-γ的单一作用不足以阻止DC分化。

为了确定炎症细胞释放的可溶性因子和导致DC分化受阻的因素，我们评估了被认为对DC分化有负面影响的细胞因子的作用。我们发现，在感染后的第一天和第二天，ELISA检测到注射部位对应的解剖组织中有大量IL-10（分别对应300和500 pg）。IL-10通过阻断单核细胞的DC分化对DC功能起调节作用(10,11)或多种刺激诱导的DC和LC成熟和功能(23–26). 此外，IL-10可将单核细胞转化为巨噬细胞，从而增强抗菌活性(15)并降低感染DC的迁移能力牛分枝杆菌卡介苗(27). 因此，我们研究了炎症过程中释放的IL-10是否在阻止DC分化中起作用，我们将中和性抗IL-10抗体与FITC胶乳或与FITC乳胶和细菌一起注射。作为对照，我们注射了一种等型匹配的无关抗体。如所示图8A、 IL-10中和甚至不能部分恢复DC迁移。在10人在场的情况下注射乳胶珠⁷在缺乏IL-10的小鼠中，细菌CFU也阻止DC迁移(图8A） ，表明如果IL-10参与调节DC功能，这与其他因素相结合。另一个可能导致单核细胞向巨噬细胞分化的候选细胞是IL-6，它可以由许多炎症细胞释放(14). 因此，我们研究了IL-6在阻止DC分化中的作用，并在没有或存在细菌（未公布的数据）或LPS的情况下，在IL-6 KO小鼠中注射FITC乳胶珠。如所示图8B、 IL-6的缺失不能恢复乳胶的迁移⁺这表明IL-6在阻止单核细胞分化DC中不起主要作用。最后，最近有研究表明，IL-12和IFN-γ在沙门氏菌感染的早期主要反应中起重要作用(28)主要由中性粒细胞释放(29,30). 由于炎症反应早期招募的最多的细胞类型是中性粒细胞，我们询问IL-12或IFN-γ是否可以通过影响DC分化或炎症反应的产生，在阻止DC迁移中发挥作用。如所示图8B、 在缺乏p35或干扰素-γ和p35的小鼠中，DC迁移的阻滞没有恢复。

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图8。

IL-12-p40的缺失，而p35、IL-10、IL-6或IFN-γ的缺失，部分缓解了LPS的阻滞作用。（A） 用抗IL-10抗体中和IL-10并不能恢复DC从外周向DLN的动员。在IL-10 KO小鼠中也获得了类似的结果。乳胶⁺注射IL-10中和小鼠后1、2或3天，以及注射IL-10 KO小鼠后3天，显示从DLN中回收的细胞。结果代表了三个独立的实验。（B） 只有IL-12-p40 KO小鼠能够部分恢复乳胶块⁺LPS注射诱导细胞迁移。乳胶的迁移⁺分别在缺乏IL-12-p35、IFN-γ和IL-12-p55、IL-12-p40和IL-6表达的不同小鼠株中评估细胞。乳胶微球单独或与10μg LPS一起静脉注射。

这项工作得到了意大利癌症研究协会（AIRC）、Ministero della Salute（Ricerca finalizzata）、美国国立卫生研究院的资助，以及癌症研究所（纽约）授予G.J.Randolph的研究员奖。