《实验医学杂志》。2003年9月1日；198(5): 831–843.
FcɛRI介导的肥大细胞激活中LAT依赖性信号需要四种远端酪氨酸
,1 ,2 ,2 ,1 ,三 ,2和1
Shin-ichiroh Saitoh先生
1国家癌症研究所癌症研究中心细胞和分子生物学实验室
桑德拉·奥多姆
2马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所分子免疫科，邮编：20892
格雷戈里奥·戈麦斯
2马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所分子免疫科，邮编：20892
康妮·萨默斯
1国家癌症研究所癌症研究中心细胞和分子生物学实验室
霍华德·A·杨
三国家癌症研究所实验免疫学实验室——马里兰州弗雷德里克市弗雷德里克，邮编：21702
希望李维拉
2马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所分子免疫科，邮编：20892
劳伦斯·萨默尔森
1国家癌症研究所癌症研究中心细胞和分子生物学实验室
1国家癌症研究所癌症研究中心细胞和分子生物学实验室
2马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所分子免疫科，邮编：20892
三国家癌症研究所实验免疫学实验室——马里兰州弗雷德里克市弗雷德里克，邮编：21702
2003年4月9日收到；2003年7月14日修订；2003年7月25日接受。
摘要
T细胞活化的接头（LAT）是一种对FcõRI介导的肥大细胞活化至关重要的衔接蛋白。LAT是TCR和FcɛRI结合后激活的酪氨酸激酶的底物。在磷酸化LAT的胞质结构域后，磷脂酶C–γ1、Grb2和Gads等多个信号分子通过其SH2结构域与磷酸化的LAT相关联。四个远端酪氨酸在TCR介导的信号传导和T细胞发育中的重要作用已通过使用LAT缺陷细胞系和转基因小鼠的实验证明。为了研究LAT的这四种酪氨酸在FcõRI介导的肥大细胞活化中的作用，用逆转录病毒载体感染LAT缺陷小鼠的骨髓来源的肥大细胞，该载体旨在表达野生型或突变型LAT。对LAT中表达各种酪氨酸到苯丙氨酸突变体的骨髓源性肥大细胞的检测表明，对这些不同的结合位点有不同的需求。在这些研究中，进行了生化途径、脱颗粒、细胞因子和趋化因子释放的分析。最后，还使用转基因动物在体内评估了这些酪氨酸的作用。所有四个远端酪氨酸的缺失，尤其是初级磷脂酶C–γ结合酪氨酸的丢失，对抗原诱导的组胺释放有显著影响。
关键词：信号转导、适配器分子、磷酸化、Fcε受体、过敏
介绍
肥大细胞上高亲和力IgE受体（FcɛRI）的聚集通过一系列复杂的生化事件导致许多肥大细胞效应器功能的激活。这些包括释放含有组胺、5-羟色胺、β-己糖胺酶和肥大细胞特异性蛋白酶的颗粒。此外，多种细胞因子和趋化因子基因的转录和这些蛋白的分泌也遵循受体结合。在细胞因子中，已知在FcɛRI刺激下产生白细胞介素1-6、9、10、13、16、TNF-α、TGF-β和GM-CSF。在FcɛRI刺激的反应中，也会产生趋化因子MCP-1、MIP-1α和MIP-1β，以及调节活化、正常T细胞表达和分泌（RANTES）。FcɛRI介导的信号传导研究中的一个主要问题是，FcɥRI参与后的早期生化事件如何最终导致颗粒释放和基因转录(1).
FcɛRI由多个亚单位、一条配体结合α链和两条链组成，β和γ起信号转导亚单位的作用(2). 这两个亚基都含有一个基于免疫受体酪氨酸的激活基序（ITAM），含有成对的酪氨酸残基(三). 该受体与IgE和多价抗原的结合导致几个Src家族蛋白酪氨酸激酶（PTK）的激活。其中之一Lyn磷酸化β和γITAM的胞浆酪氨酸(4–6). 这些磷酸化为Syk PTK的串联SH2结构域创建了一个结合位点。Syk与磷酸化ITAM的相互作用也会激活该酶。Syk是FcɛRI信号传导的关键分子，因为Syk缺陷的肥大细胞在FcɥR参与后无法激活任何下游通路(7,8).
Syk的激活导致至少一个重要适配器分子的磷酸化，即T细胞激活的连接物（LAT；参考文献9）。当磷酸化时，LAT招募了许多包含SH2结构域的重要信号分子。从T细胞和肥大细胞中的工作来看，已知LAT结合蛋白包括但不限于其他适配器Grb-2和Gads(9–11). 反过来，这些蛋白质分别与SOS和SLP-76结合。此外，磷酸化LAT招募磷脂酶C（PLC）–γ1和PLC-γ2酶。从这个有限的列表中可以清楚地看出，LAT的磷酸化导致对激活小G蛋白（SOS）和控制钙流量、二酰基甘油的生成以及蛋白激酶C（PLC亚型；参考文献12).
基因失活研究揭示了LAT在肥大细胞功能中的重要性。LAT缺陷小鼠骨髓源性肥大细胞（BMMC）表现出严重的肥大细胞功能缺陷(13). 在这些研究中，肥大细胞脱颗粒和多个细胞因子基因的转录显著受损。基于对T细胞的研究，LAT的远端四个酪氨酸残基可能介导重要的LAT结合事件(10). 为了研究这些残基是否对肥大细胞功能至关重要，并确定各种信号分子如何与LAT偶联，我们重建了LAT缺陷BMMC的功能。使用Moloney小鼠白血病逆转录病毒构建物将各种LAT突变体引入这些细胞。此外，使用在LAT中表达基因靶向突变的小鼠进行体内研究。
来自LAT的BMMC之间FcɛRI介导的肥大细胞活化没有差异+/+小鼠和LAT的BMMC−/−用野生型LAT重组的小鼠。在FcõRI介导的肥大细胞活化方面，LAT和BMMC之间也没有差异−/−小鼠和LAT的BMMC−/−表达突变LAT的小鼠，其中所有四个远端酪氨酸都转化为苯丙氨酸。这些结果表明，在FcɛRI参与后，四个远端酪氨酸对肥大细胞中LAT依赖性信号传导至关重要。表达LAT单突变或组合突变的BMMC对各种LAT残基有不同的需求，其中主要的PLC结合位点是最重要的。体内研究证实了LAT对组胺释放的关键作用。四个远端LAT酪氨酸和主要PLC位点是对抗原的体内反应所必需的。
材料和方法
老鼠。
先前曾报道过LAT缺陷小鼠的产生(14). 根据美国国立卫生研究院的规定，将小鼠关在特定的无病原环境中。所有小鼠均为C57/BL6和129/Sv混合背景。
LAT突变体的构建。
使用Quickchange突变试剂盒（Stratagene）进行小鼠LAT酪氨酸到苯丙氨酸的突变。在LAT起始密码子中构建了一个NcoI位点用于克隆。DNA测序证实了突变。使用的逆转录病毒表达载体是pMX-puro，它是pBabe和MFG的嵌合载体（日本东京大学北村T.Kitamura赠送）。从pCITE-2a分离的脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点（IRES）用于双顺反子表达(15). IRES-EGFP在pBluescript的BamHI和NotI位点进行亚克隆。将野生型或突变型LAT cDNA（来自日本Isehara东海大学医学院S.Habu的礼物）亚克隆到该构建体的NcoI和NotI位点的IRES下游。在IRES上游的SmaI位点亚克隆截短的大鼠CD2 cDNA，该cDNA含有胞外、跨膜和细胞质区的三个氨基酸。用XhoI和NotI消化这些结构，制成CD2-IRES-LAT，如用Klenow片段处理后，将这些片段亚克隆到pMX-puro载体中。
（A） 小鼠LAT分子的示意图。Y表示作为潜在磷酸化位点的酪氨酸残基。Y136（YLVV）是预测的PLC-γ1结合位点。Y175和Y195（YVNV）以及235（YENL）是预测的Grb2结合位点。（B） 逆转录病毒构建用于转导LAT中大鼠CD2和LAT的共表达−/−BMMC。结构域包括细胞外（EC）、跨膜（TM）和细胞质（CY）。仅表达CD2的病毒（CD2-IRES）；带有野生型LAT的CD2（CD2-IRES-LAT-WT）；Y136 F突变（CD2-IRES-LAT-1YF）；Y175F和Y195F突变（CD2-IRES-LAT-2YF）；Y175 F、Y195 F和Y235 F突变（CD2-IRES-LAT-3YF）；使用Y136 F、Y175 F、Y195 F和Y235 F突变（CD2-IRES-LAT-4YF）转导LAT−/−BMMC。
逆转录病毒感染与肥大细胞分离。
取自LAT的骨髓细胞+/+和LAT−/−小鼠股骨在有IL-3的悬浮培养液中孵育4-8周。Phoenix E和Bosc 23被用作包装细胞系(16). 在转染前24小时，将Phoenix E和Bosc 23细胞以1:9的比例混合。使用Lipofectamine Plus（Invitrogen）将逆转录病毒载体转染到这些细胞中。对于逆转录病毒感染，LAT−/−培养12天的BMMC与转染载体的包装细胞系混合。混合培养48小时后，收集BMMC并在含有IL-3的培养基中培养。2d后，用抗大鼠CD2染色检测感染效率。25-30%的BMMC对大鼠CD2呈阳性。在随后选择嘌呤霉素2周后，用抗大鼠CD2和IgE+抗IgE–FITC对BMMC进行染色，以确认LAT蛋白的表达并测量肥大细胞纯度。肥大细胞颗粒用托洛定蓝染色。
IgE受体、大鼠CD2和LAT表达的流式细胞术分析。
用5μg/ml抗CD16/CD32（2.4G2；BD Biosciences）预孵育BMMC，并用2.5μg/ml的抗DNP IgE（SPE-7 mAb；Sigma-Aldrich）染色FcɛRI，然后用FITC-结合大鼠抗鼠IgE染色。为了检测大鼠CD2表达水平，用FITC-偶联抗大鼠CD二抗体或FITC-结合IgG（BD Biosciences）处理BMMC作为阴性对照。为了检测LAT表达水平，BMMC在室温下用3.7%多聚甲醛固定30min，用0.1%Triton X-100处理4min。用2%山羊血清封闭后，用兔抗LAT和藻红蛋白结合山羊抗兔抗体对BMMC进行染色。FACScan™（Becton Dickinson）用于染色细胞的分析。
细胞刺激、免疫印迹和免疫沉淀。
用1μg/ml抗DNP IgE预加载细胞至少4小时(17)培养基中（不含IL-3）。细胞在Tyrode缓冲液中用100 ng/ml DNP-HSA激发(13). 免疫沉淀前，细胞在含有150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、pH 7.6、4 mM EGTA、20μg/ml胃蛋白酶抑制素、完全抑制剂鸡尾酒片（罗氏）、1%Brij或NP-40、1%n个-辛基-β-d日-糖苷、1 mM原钒酸钠、7 mM EDTA在冰上放置30分钟。SLP-76免疫沉淀的裂解缓冲液为150 mM NaCl、25 mM Tris-HCl、pH7.6、4 mM EGTA、40μg/ml Bestatin、2μg/ml E64、2.5μg/ml巨球蛋白、10μg/ml磷酰胺、30μg/ml胃蛋白酶抑制素、完全抑制剂鸡尾酒片、1%Triton X-100、1%n个-辛基-β-d日-葡萄糖苷、1 mM原钒酸钠、7 mM EDTA。用于免疫沉淀的抗体是抗LAT抗血清(9)、抗-PLC-γ1（Upstate Biotechnology）、抗Grb2和抗-PLC/γ2（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）以及抗-SLP-76（抗体溶液）。用于免疫印迹的抗体为4G10和SLP-76（Upstate Biotechnology）。免疫印迹中用于检测抗体的试剂为蛋白A–辣根过氧化物酶（HRP）和羊抗鼠IgG-HRP（Amersham Biosciences），以及蛋白A/蛋白G–HRP（Pierce Chemical Co.）。
钙通量和脱粒的测量。
在37°C下用1μg/ml抗DNP IgE在细胞中预加载4 h。用16μM Fluo-4–AM和16μM Fura red在2%FCS RPMI 1640培养基中37°C培养45 min。用Tyrode的缓冲液清洗细胞两次，重新悬浮，并在室温下保持30 min，以允许AM酯裂解。细胞通过FACScan™（Becton Dickinson）进行分析。细胞内钙浓度显示为Fluo-4/Fura红色荧光强度比。如前所述，通过测量β-己糖胺酶的释放来测定脱颗粒(13).
丝裂原活化蛋白（MAP）激酶测定。
对于ERK和JNK激酶测定，在培养基（不含IL-3）中用1μg/ml抗DNP-IgE预载细胞4小时，并用100ng/ml DNP-HSA刺激8或10分钟。对于ERK激酶测定，用抗ERK2的兔多克隆血清（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）免疫沉淀的ERK2用于磷酸化髓鞘碱性蛋白（MBP；Upstate Biotechnology）在室温下保持10分钟。对于JNK分析，使用兔抗JNK1多克隆血清免疫沉淀的JNK1（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）在室温下磷酸化GST-Jun 5–89融合蛋白（c-Jun–GST；Upstate Biotechnology）10分钟。为了控制JNK1水平，切割该膜并用抗JNK1.免疫印迹。为了检测磷酸化的p38MAP激酶，在培养基（不含IL-3）中用1μg/ml抗DNP-IgE预载细胞4小时，并用100 ng/ml DNP-HSA刺激5分钟和10分钟。通过在还原性样品缓冲液中煮沸制备用于免疫印迹的总细胞裂解物，并在4–15%丙烯酰胺凝胶上通过PAGE分离。用抗磷酸p38抗体对膜进行免疫印迹（新英格兰生物实验室公司）。剥离后，用抗p38抗体重新缝合膜（圣克鲁斯生物技术公司）。
逆转录聚合酶链反应。
(2 × 106用1μg/ml DNP-特异性IgE在3×10的温度下预培养细胞6细胞/ml至少4 h。细胞清洗三次，并用100 ng/ml DNP-HSA刺激1 h。使用TRI试剂分离总RNA（分子研究中心；参考文献13）。使用Superscript RT-PCR试剂盒（Life Technologies）进行第一链cDNA合成。在用寡核苷酸dT引物的反应中使用2.5μg总RNA以获得cDNA。在150μl dH中合成7.5μl cDNA20作为细胞因子mRNA扩增反应的模板。PCR条件为：94℃5 min，94℃30次循环30 s，57℃30 s，72℃1 min，72℃8 min，4℃浸泡。IL-2引物从Ambion获得，GAPDH引物从CLONTECH Laboratories，Inc.获得，用作内部对照。
核糖核酸酶保护试验。
根据制造商（BD Biosciences）的指示进行多探针RNase保护测定，修改如下。
为了进行杂交，用[33P] UTP（70–80μC/完全反应），使用BD Biosciences体外转录试剂盒。通过凝胶过滤纯化探针。0.5–1.0 × 106将cpm添加到每个RNA中，最终杂交体积为10–20μl（至少50%BD Biosciences杂交缓冲液）。
对于RNase失活，使用含有200μl RNase灭活试剂（Ambion）、50μl乙醇、5μg酵母tRNA和1μl GycoBlue共沉淀物的主鸡尾酒沉淀受保护的RNA（Ambio）。电泳前将颗粒重新悬浮在3μl样品缓冲液中（BD Biosciences）。
被动全身过敏。
如前所述，用静脉注射抗DNP IgE致敏小鼠(13). 随后通过静脉注射生理盐水进行假激发，或用DNP-HSA或200μg抗IgE激发1.5分钟，用CO杀死2立即通过心脏穿刺取血。采用竞争性组胺免疫分析法测定血清组胺水平。
结果
通过逆转录病毒感染将LAT突变体引入LAT缺陷的BMMC。
我们先前证明LAT对FcɛRI介导的肥大细胞激活至关重要(13). LAT缺乏的BMMC在FcɛRI参与后肥大细胞活化显著降低。LAT缺陷肥大细胞中PLC-γ1、PLC-β2和SLP-76的酪氨酸磷酸化、钙动员、脱颗粒和细胞因子表达显著降低。如所示A、 LAT的胞浆结构域包含九个酪氨酸。在四个远端酪氨酸中，酪氨酸136（YLVV）是潜在的PLC-γ1结合基序，酪氨酸175（YVNV）、195（YVNV）和235（YENL）是经典的Grb2-结合基序（YXN）。在T细胞中，这四个远端酪氨酸对胸腺中的TCR信号和T细胞分化至关重要(10,18). 为了研究LAT酪氨酸在肥大细胞中的作用，将各种LAT突变体引入Moloney小鼠白血病病毒载体pMX-puro(B；参考19). 该逆转录病毒载体设计用于两种产物的双顺反子表达。第一种是LAT野生型（LAT-WT）或含有酪氨酸到苯丙氨酸的LAT突变形式。第二种是截短的大鼠CD2，它含有正常的细胞外和跨膜结构域以及细胞质结构域的3个氨基酸，用作检测成功感染的BMMC的表面标记物(15). 使用脑心肌炎病毒IRES来确保双顺反子的表达。在初步实验中，将LAT-WT的cDNA插入IRES的上游，将截短大鼠CD2的cDNA导入IRES的下游。通过这种结构，感染的BMMC表达的LAT水平比正常LAT高约10倍+/+使用抗LAT抗体通过流式细胞术和印迹实验测定的BMMC（未公布数据）。我们颠倒了载体中两个DNA的顺序。LAT的cDNA插入IRES下游，而截短大鼠CD2的cDNA则插入IRES上游，以诱导LAT分子的低表达，因为IRES依赖性翻译通常效率较低(20). 这种变化导致受感染BMMC中LAT的表达水平大约是正常LAT表达水平的两倍+/+BMMC（参见). 在IRES下游插入不同的LAT cDNA，其具有先前显示的影响T细胞活化的特异性突变(10). 一个cDNA包含潜在PLC-γ1-结合位点Tyr 136（LAT-1YF）的单一替换物。第二个cDNA包含酪氨酸175和195的双重替换，在序列上下文中，YVNV均形成Grb2-结合位点（LAT-2YF）。这两个酪氨酸和Tyr 235（也是潜在Grb2结合位点（YENL）的一部分）的突变产生了第三个cDNA（LAT-3YF）。最后，对所有四种酪氨酸进行突变并插入（LAT-4YF；B） ●●●●。
来自LAT的BMMC中大鼠CD2、IgE受体的表面表达水平和LAT表达水平+/+，拉丁美洲+/−、和LAT−/−小鼠和LAT−/−BMMC感染逆转录病毒。（A） 大鼠CD2表达水平。用FITC-偶联抗大鼠CD2（连续线）或FITC-结合IgG作为阴性对照（虚线）治疗BMMC。非感染LAT大鼠CD2表达水平−/−BMMC为基础水平（连续线）。（B） IgE受体表达水平。在抗CD16/CD32治疗后，用抗DNP IgE单克隆抗体治疗BMMC，并用FITC-偶联的大鼠抗鼠IgE孵育。对照组仅用FITC-偶联大鼠抗鼠IgE染色（虚线）。（C） BMMC用3.7%多聚甲醛固定30分钟，用0.1%Triton X-100处理4分钟。用2%山羊血清封闭后，用抗LAT抗血清和藻红蛋白结合的山羊抗兔抗体对BMMC进行染色。LAT在BMMC中的表达水平分为四个不同的峰值。峰值1显示感染CD2-IRES-LAT-1YF、2YF、3YF、4YF和WT BMMC的LAT表达水平。峰值2显示LAT的LAT表达水平+/+BMMC。峰值3显示LAT的LAT表达水平+/−BMMC。峰值4显示LAT的LAT表达水平−/−BMMC和表达CD2-IRES的细胞。（D） 全细胞中的蛋白质从2×10裂解5用SDS-PAGE分离BMMC，并用抗LAT抗血清进行免疫印迹。
这些逆转录病毒构建物以及缺乏LAT cDNA的构建物分别转染到两个逆转录病毒产生细胞系Bosc 23和Phoenix E的混合培养物中，16小时后，这些转染细胞与LAT混合−/−BMMC在含有IL-3的培养基中培养12天。在这种联合培养48小时后，由CD2表达确定的感染效率大于20%，这一效率高于单独使用Bosc 23或Phoenix E细胞或使用培养上清液时的效率。选择嘌呤霉素>2周后，感染的LAT−/−用抗大鼠CD2抗体对BMMC进行染色。几乎100%的感染BMMC表达相同水平的大鼠CD2，无论使用哪种结构(A） ●●●●。还对细胞进行了FcɛRI表达水平的检测，逆转录病毒表达后BMMC上的受体水平与任一LAT的受体水平相同+/+或LAT−/−BMMC公司(B） ●●●●。来自每一个受感染BMMC的细胞含有几乎相等数量的甲苯胺酮阳性颗粒，表明肥大细胞形态正常（未发表数据）。感染LAT的LAT表达水平−/−用流式细胞术和抗LAT抗体印迹法检测BMMC。这两种方法都表明，所有受感染BMMC中LAT的表达水平大约是LAT的两倍+/+BMMC公司(). 感染LAT−/−重复生成具有相同CD2和LAT表达水平的BMMC，并在FcɛRI参与后用于肥大细胞的生化和功能分析。
FcɛRI结合后LAT的酪氨酸磷酸化。
LAT的酪氨酸磷酸化对LAT功能至关重要。分析LAT分子的各种酪氨酸突变是否在感染的LAT中表达−/−BMMC在FcɛRI参与后可被酪氨酸磷酸化，感染的BMMC通过与单克隆抗DNP IgE孵育致敏，并用100 ng/ml DNP-HSA刺激1分钟。刺激后30 s–2分钟，LAT的酪氨酸磷酸化度最高(13). 用抗LAT抗体免疫沉淀野生型和突变型LAT分子，用抗磷酸酪氨酸印迹法检测酪氨酸磷酸化。如所示A、 LAT-WT分子在感染的LAT中表达−/−BMMC的磷酸化水平与LAT内源性LAT磷酸化水平相似+/+BMMC。Y136（LAT-1YF）的突变对磷酸化的影响最小，尽管磷酸化水平始终低于LAT-WT。LAT-2YF分子的磷酸化降低，所有三个Grb2结合位点的突变对磷酸化水平有显著影响。最后，所有四个远端酪氨酸LAT-4YF的突变几乎完全抑制了分子的磷酸化。结果表明，四个远端酪氨酸是肥大细胞LAT的主要磷酸化位点。
抗原刺激后，BMMC中LAT、PLC-γ1、PLCγ2和SLP-76的蛋白酪氨酸磷酸化。用1μg/ml抗DNP IgE致敏BMMC，用100 ng/ml DNP-HSA刺激1分钟。裂解物（2–4×107细胞）用抗LAT（A）、抗-PLC-γ1（B）、抗-PLC-γ2（C）、抗-SLP-76（D）免疫沉淀。免疫沉淀蛋白通过电泳分解并转移到硝化纤维素膜上。（A） LAT和Grb2的酪氨酸磷酸化与LAT相关。LAT免疫沉淀后，用抗磷酸酪氨酸和抗Grb2抗体免疫印迹膜，剥离后用抗LAT抗血清重新印迹膜。（B） PLC-γ1的酪氨酸磷酸化及其与LAT的结合。在PLC-β1免疫沉淀后，用抗磷酪氨酸对膜进行免疫印迹，剥离后用抗-PLC-γ1重新缝合。（C） PLC-γ2的酪氨酸磷酸化及其与LAT的结合。PLC-β2免疫沉淀后，用抗磷酪氨酸免疫印迹膜，剥离后用抗-PLC-γ2重新印迹膜。（D） SLP-76的酪氨酸磷酸化。SLP-76免疫沉淀后，膜过滤器用抗磷脂酰肌醇进行免疫印迹，剥离后，用抗-SLP-76重新印迹。显示了三个或四个独立实验的代表性数据。
Grb2与LAT的关联。
磷酸化LAT与多种信号分子相关，包括衔接分子Grb2。LAT有几个潜在的Grb2结合位点，如分析重组LAT中Grb2与LAT的关联−/−裂解BMMC、活化细胞，用抗LAT抗体免疫沉淀WT或突变LAT分子，并用抗Grb2印迹法检测Grb2相关性。如所示A、 LAT中表达的LAT-WT分子之间的关联水平−/−在激活的LAT中，BMMC和Grb2与内源性LAT及Grb2相当+/+BMMC。与LAT-1YF相关的Grb2数量实际上高于LAT-WT和Grb2相关的观察值。Grb2与LAT-2YF的相关性显著降低，LAT-3YF和LAT-4YF均未与Grb2发生交互作用。相互作用的Grb2免疫沉淀实验支持这些结果。LAT-WT和LAT-1YF分子与来自活化细胞的抗Grb2抗体共沉淀。然而，在本实验中，LAT-2YF没有与Grb2共沉淀（未公布的数据）。这些结果都表明，预测的Grb2结合位点、酪氨酸175、195和235实际上对Grb2和LAT的结合至关重要。
与LAT结合的PLC-γ1和Grb2对PLC-γ1和PLC-γ2的酪氨酸磷酸化至关重要。
之前，我们证明LAT对于酪氨酸的最佳磷酸化、PLC-γ1和PLC-β2的激活以及钙的动员至关重要(13). 为了探索LAT中的哪些酪氨酸残基与PLC-γ1和PLC-β2结合，这些蛋白质是从活化的、重组的LAT中免疫沉淀出来的−/−具有抗-PLC-γ1和抗-PLC/γ2抗体的BMMC。如所示（B和C）、PLC-γ1和PLC-β2的酪氨酸磷酸化通过抗磷酸酪氨酸印迹检测，并测定LAT关联性。在刺激后表达LAT-WT的细胞中，PLC-γ1被酪氨酸磷酸化。表达LAT-2YF的感染BMMC中PLC-γ1的酪氨酸磷酸化降低了～50%。在表达LAT-1YF、LAT-3YF或LAT-4YF的细胞中检测到PLC-γ1的酪氨酸磷酸化水平与不表达任何LAT（仅CD2）或LAT的细胞相当−/−BMMC。在本实验中，LAT与PLC-γ1共沉淀难以检测，仅在表达LAT-WT或LAT-2YF的细胞中可见。2YF中PLC磷酸化的细微缺陷，如果没有两倍高水平的蛋白质表达，可能会更令人印象深刻(C） 3YF中更完整的区块表明，除了Y136处预测的PLC-γ位点外，LAT中的Grb2-结合位点对PLC-β1也至关重要。在类似的实验中，LAT与PLC-γ2共沉淀很难检测到（未公布的数据）。然而，当在表达各种LAT突变体的细胞中测量PLC-γ2的酪氨酸磷酸化时，观察到与PLC-α1定性相似的结果。从这些结果可以清楚地看出，两种PLC亚型的磷酸化和活化依赖于相同的LAT酪氨酸残基。
PLC亚型与LAT的关联也依赖于Grb2结合位点，这可能反映了T细胞系统中的观察结果，即LAT与PLC的相互作用也需要适配器SLP-76。SLP-76通过Gads（一种Grb2相关蛋白）的相互作用进入LAT(21,22). LAT上的Gads结合位点至少包括Tyr 175和195(10). 在该模型中，发生合作绑定事件，PLC通过SLP-76直接或间接绑定LAT(23). 在之前的工作中，我们报告了LAT中SLP-76的磷酸化降低−/−FcɛRI参与后的BMMC(13). 为了证明受感染BMMC中的SLP-76磷酸化，SLP-76在激活后与抗SLP-76抗体进行免疫沉淀。在刺激1分钟后，我们观察到LAT-WT表达受感染BMMC中SLP-76分子的强烈磷酸化(D） ●●●●。LAT-2YF细胞中两个Grb2和Gads-结合位点的丢失导致SLP-76磷酸化降低50-55%（磷酸化比活性），LAT-3YF细胞的所有三个Grb2和Gads结合位点的缺失导致SLP-76-酪氨酸磷酸化降低约87%。去除PLC结合位点也有影响。与表达LAT-WT的BMMC相比，LAT-1YF细胞中的SLP-76磷酸化降低了约70%。去除所有四个远端酪氨酸导致LAT-4YF和仅表达受感染LAT的CD2中SLP-76酪氨酸磷酸化几乎完全丧失−/−BMMC细胞。这些结果与前面提到的合作绑定思想相一致。
LAT酪氨酸在钙动员和脱颗粒中的作用。
细胞内钙升高是FcɛRI刺激的众所周知的结果。为了测试LAT突变对FcɛRI刺激后肥大细胞钙动员的影响，用钙敏感染料Fluo-4–AM和Fura red-AM负载重建的BMMC比较每种重组细胞类型与LAT的钙反应+/+和LAT−/−BMMC。应注意，如前所述，LAT−/−BMMC表现出适度的钙反应。LAT重组−/−具有LAT-WT的BMMC恢复了几乎正常的钙反应。LAT-2YF和LAT-3YF的表达导致部分钙反应。在Y136表达点突变的细胞表现出较低的钙反应。所有四个远端酪氨酸的缺失具有主要的抑制作用，由此产生的钙反应与LAT相当−/−细胞和仅表达对照CD2标记的细胞（未公布数据）。在本实验中，在1μM的thapsigargin刺激后，所有细胞的钙反应是可比较的（未公布的数据）。对FcɛRI聚集的反应支持这样的结论，即Y136位点对钙反应最重要，但其他三个远端酪氨酸起支持作用。这些功能结果与上述证据一致，这些证据揭示了PLC结合和磷酸化所需的协同作用。
钙2+抗原刺激后BMMC动员。用1μg/ml抗DNP IgE致敏BMMC 6 h，并用Fluo-4–AM和Fura red–AM加载。在指定时间用100 ng/ml DNP-HSA刺激BMMC。用流式细胞仪检测抗原刺激后的Fluo-4和Fura红荧光强度。细胞内钙浓度由Fluo-4/Fura红色荧光强度的比值表示。显示了五个独立实验的代表性数据。
继续对表达LAT突变的细胞进行功能分析，我们使用β-己糖胺酶释放试验分析肥大细胞脱颗粒() . 再次，对各种重组细胞，脱颗粒与LAT进行比较+/+和LAT−/−BMMC。LAT-WT完全重组LAT−/−BMMC。表达LAT-2YF和LAT-3YF的细胞的脱颗粒被部分抑制。相反，LAT-1YF、LAT-4YF和对照细胞（未公布数据）释放的β-己糖胺酶与LAT水平相同−/−BMMC。Thapsigargin刺激诱导的脱颗粒在所有感染的BMMC和未感染的BMMCs中具有可比性（未公布的数据）。与中所述的测定一致和，四个远端酪氨酸的丢失消融了一种反应。在脱颗粒过程中，仅失去初级PLC结合位点同样具有破坏性。
通过测量β-己糖胺酶的释放来确定脱颗粒水平。2 × 106/在培养基（不含IL-3）中用1μg/ml抗DNP IgE使ml BMMC敏化6 h，并在Tyrode缓冲液中用指定浓度的DNP-HSA或1 mM thapsigargin刺激7 min。在用0.5%Triton X-100溶解在Tyrode缓冲液中的上清液和细胞颗粒中测量β-己糖胺酶的酶活性。通过将上清液中的吸光度除以上清液和细胞颗粒中的总吸光度，计算β-己糖胺酶释放的总百分比。标准误差反映了三个实验。自发释放率为8.7%至12%。
MAP激酶通过LAT的四个远端酪氨酸调控。
MAP激酶激活是肥大细胞中细胞因子和趋化因子转录激活的核心。我们先前报道，LAT缺陷的肥大细胞表现出ERK和JNK活化受损(13). 以c-Jun–GST为底物，通过体外激酶试验测定重组BMMC中JNK1的活化。如所示A、 表达LAT-WT的BMMC中JNK1的激活是强健的，与LAT中的JNK1激活相当或更大+/+BMMC。在表达LAT-4YF和LAT的细胞中，JNK1的激活是相似的−/−BMMC。JNK1活化并没有通过四个突变LAT结构体中的任何一个的表达完全重建。与具有LAT-WT的细胞相比，表达LAT-2YF的细胞中JNK1的激活降低了55-60%。表达LAT-1YF和LAT-3YF的电池中JNK1的激活降低～78%。含有LAT-4YF的BMMC中JNK1的活化降低了90%。这些结果表明，四个远端酪氨酸对JNK1的激活至关重要，Y136结合位点和三个Grb2结合位点对FcɛRI参与后JNK1的激活至关重要。
抗原刺激后BMMC的MAP激酶活性。抗原刺激后BMMC中的（A和B）ERK和JNK活性。用1μg/ml抗DNP-IgE致敏BMMC，并用100 ng/ml DNP-HSA刺激10分钟。（A）通过体外激酶测定JNK1激酶活性。（顶部）32P-通过BMMC的JNK1免疫沉淀物磷酸化后并入c-Jun–GST。用抗JNK1抗体探测同一过滤器。（底部）显示了JNK1蛋白量。（B） 体外激酶测定法测定ERK2激酶活性。（顶部）32P-通过BMMC的ERK2免疫沉淀物磷酸化后并入髓鞘碱性蛋白（MBP）。（底部）通过抗ERK2免疫印迹法检测同一细胞裂解物中ERK2蛋白的量。（C） 抗原刺激后BMMC中的p38磷酸化。用1μg/ml抗DNP IgE致敏BMMC，并用100 ng/ml DNP-HSA刺激5分钟和10分钟。2×10的细胞裂解液中的蛋白质5用SDS-PAGE分离BMMC，并转移到硝化纤维素膜过滤器。用抗磷酸-p38抗体对膜进行免疫印迹。剥离后，用抗p38抗体对同一膜进行免疫印迹。显示了三个独立实验的代表性数据。
为了检测BMMC中ERK的活性，从LAT中免疫沉淀ERK2−/−BMMC、LAT+/+BMMC和重组BMMC。以MBP为底物，通过体外激酶试验测定ERK2活性(B） ●●●●。LAT-WT重组了LAT−/−细胞。使用1YF、2YF或3YF构造的重构是部分的。LAT-4YF构建物的表达未能将ERK2活化重建到高于对照重建细胞的水平。如所示C、 用特异性抗磷酸化p38抗体印迹裂解产物，检测激活的p38。在活化的LAT中观察到p38激酶磷酸化增加+/+BMMC以及表达LAT-2YF和LAT-WT的BMMC。然而，LAT中p38 MAP激酶磷酸化显著降低−/−BMMC和LAT−/−仅表达CD2、LAT-1YF、LAT-3YF或LAT-4YF的细胞。因此，对于所有测试的MAP激酶，完整的重组需要所有四个远端LAT酪氨酸残基。
LAT末端四个酪氨酸中预测的PLC-γ1-和Grb2-结合位点调控细胞因子和趋化因子的表达。
为了检测FcɛRI参与后细胞因子和趋化因子mRNA的表达，用100 ng/ml DNP-HSA刺激BMMC 60分钟。通过RT-PCR检测IL-2或使用特定引物或探针进行RNA保护分析，分析从BMMC纯化的RNA。评估了7种细胞因子（IL-1β、IL-2、IL-6、IL-13、LIF、M-CSF和TNF-α）和5种趋化因子（MCP-1、MIP-1α、MIP-β、RANTES和TCA3）() . 通过比较LAT的响应−/−用WT或四种LAT突变形式重组细胞，检测到三种定性反应模式。除了两种产品（IL-1β和MCP-1）外，所有产品的反应等级都类似。对于所有这些趋化因子和细胞因子，分析显示了相同的突变效应层次：2YF<3YF<1YF<4YF。失去两个或三个Grb2结合位点的影响小于失去Y136的影响。所有四个远端酪氨酸的丢失最为明显，与LAT大致相当−/−细胞。然而，在这种反应顺序中，实际的活性水平从几乎完全依赖LAT（RANTES和IL-2）到反应几乎是LAT一半的例子都不同+/+细胞（MIP-1α和TCA3）。
抗原刺激后BMMC中细胞因子和趋化因子mRNA的表达。（A） 2×106用1μg/ml抗DNP IgE致敏BMMC并用100 ng/ml DNP-HSA刺激1 h。从BMMC中纯化mRNA，并使用每个细胞因子的特定引物或模板集通过RNA保护试验检测细胞因子mRNA（IL-2除外）。通过RT-PCR获得IL-2结果。（B） 用RNA保护试验检测趋化因子mRNA。RNA保护分析的标准误差反映了三到五个实验。
对IL-1β产生的分析显示出略微不同的表型。在这种情况下，2YF和3YF突变的影响大于1YF突变，这表明与PLC相比，与Grb2或相关分子耦合的通路的作用更大。尽管如此，4YF突变的表达确实使细胞因子的产生水平降至LAT产生的水平−/−细胞。最后，对MCP-1生成的分析显示LAT几乎没有作用−/−和LAT+/+因此，各种LAT突变的表达并不影响MCP-1的产生水平。
LAT突变小鼠的被动全身过敏反应。
上述一系列实验进一步证明了LAT在BMMC的各种信号级联和细胞反应中的作用。与各种LAT突变体的重组证实了这些位点在信号转导过程中的重要性。为了分析这些LAT酪氨酸残基在完整动物中的功能，我们使用了被动全身过敏性试验。正常小鼠用单克隆抗DNP-IgE进行预处理，并用多价DNP-HSA进行攻击，以聚集肥大细胞FcɛRI。在抗原递送后的几分钟内可以测量到大量组胺释放。在上一篇论文中(13)，我们发现LAT缺陷的肥大细胞在这些条件下无法释放组胺。在当前的分析中，将野生型反应与两种小鼠进行比较，其中显示PLC结合缺陷最明显的LAT突变取代了野生型LAT等位基因(18,24). 缺乏所有四个远端LAT酪氨酸的小鼠在给药后组胺释放显著减少() . 只表达带有Y136F（1YF）突变的LAT蛋白的小鼠未表现出可测量的组胺释放。
如材料和方法中所述，对小鼠进行致敏和激发。显示了所示基因型的四只或六只小鼠的血清组胺水平，这些小鼠要么被假性激发，要么被DNP-HSA或抗IgE激发。中位数响应由水平线表示。
表达Y136F突变的小鼠表现出以CD4扩增为特征的淋巴增生性疾病+产生Th2淋巴因子的T细胞(24). 许多后果之一是循环IgE水平非常高。这种IgE可以饱和肥大细胞FcɛRI，从而阻断抗DNP IgE的结合，并通过多价抗原阻止肥大细胞活化。为了绕过这种可能性，给WT和1YF小鼠注射IgE，并用抗IgE作为交联试剂进行治疗。抗IgE处理的WT小鼠的肥大细胞释放组胺的水平与抗原处理的小鼠相当。相反，1YF小鼠的交联肥大细胞不能释放大量组胺。这一结果证明了LAT Y136残基在体内的关键功能。
讨论
FcɛR1的聚集导致多个PTK的激活以及随后能够招募多个信号分子的适配器分子的磷酸化(1,25,26). 许多工作都集中在描述依赖Lyn、Syk的这种途径，以及适配器分子LAT和SLP-76的磷酸化(4,13,27,28). 编码这些分子的基因发生遗传性破坏后，肥大细胞激活的显著缺陷证实了这一途径的重要性(7,13,29,30). 然而，许多论文表明，这些信号分子之一的丢失并不能完全消融肥大细胞的信号传导。例如，我们之前的工作记录了LAT在肥大细胞信号传导中的重要作用，仍然提供了LAT的证据−/−肥大细胞具有部分残留功能(13). 最近的分析为肥大细胞中的替代信号通路提供了证据。适配器分子Gab2因其招募PI-3激酶的能力而被证明对肥大信号传导至关重要(31). Gab2磷酸化及其招募额外分子的能力似乎依赖于Fyn PTK(32). 我们目前的研究主要集中在LAT相关途径上，我们证明这是复杂和相互作用的。
先前对T细胞的研究表明，LAT的所有四种远端酪氨酸对于最佳信号传导是必要的(10). 这些在LAT-缺陷Jurkat细胞中进行的研究表明，用缺乏这四个残基的突变体重建的细胞根本无法发出信号。这项工作还证实，远端三个酪氨酸残基结合Grb2，与Tyr 175和195同源的残基是Gads–SLP-76结合的主要位点。Jurkat细胞中的PLC-γ1结合和激活主要依赖于与小鼠Y136位点同源的位点，但在LAT-3YF突变重组的细胞中，结合和激活均降低。LAT突变也被引入小鼠基因组，并研究了随后对T细胞发育的影响，这也是一个LAT依赖性过程。LAT无T细胞发育−/−小鼠或仅表达LAT 4YF突变的小鼠(14,18). 仅表达LAT-1YF突变的小鼠胸腺细胞的钙通量能力有缺陷。这些小鼠产生了有趣的淋巴增殖和自身免疫表型(24,33).
目前的研究旨在进一步明确LAT在肥大细胞功能中的作用。在WT或LAT来源的肥大细胞中检测LAT依赖性结合和信号传导−/−小鼠或来自LAT−/−使用逆转录病毒载体和四个LAT突变体中的一个重组肥大细胞。免疫共沉淀研究用于测试这些突变的影响。联合免疫沉淀蛋白的检测是困难的，在我们的实验中，更容易检测到的磷酸蛋白的存在被用作结合的证据。在共沉淀研究中，Y136位点的丢失对Grb2结合并没有影响，正如预期的那个样。然而，其他结合研究表明，存在一些更复杂的相互作用。两种PLC亚型和SLP-76的磷酸化形式与LAT的共沉淀受到Y136位点的损失以及三个Grb2结合位点的损失的影响。所有四种酪氨酸的丢失导致共沉淀磷酸化蛋白的进一步减少。LAT上的多个酪氨酸调节PLC和SLP-76的结合的证据与T细胞中Gads、SLP-76和PLCγ的结合高度协同的证据一致(23). 在这个模型中，Gads和PLC都直接与LAT结合，并为SLP-76/PLCγ结合提供了额外的证据。
我们的功能实验进一步支持了LAT中蛋白质相互作用的作用。依赖于PLC结合和激活的钙通量以及脱颗粒都高度依赖于LAT。LAT中的反应没有重建−/−当对表达LAT-4YF的细胞进行测试时，肥大细胞显示出来，这表明LAT在这些功能中的作用完全依赖于这些酪氨酸。用其他LAT突变体（1YF、2YF和3YF）观察到部分重组。钙反应更依赖于Y136，但Grb2或Gads-结合位点的丢失会支持上述复杂相互作用模型。虽然1YF突变与LAT基本相同，但脱颗粒也发现了类似的结果−/−和4YF突变体。这些数据可能反映了脱颗粒依赖于钙流量和其他信号通路的复杂性。ERK可能通过Grb2招募激活剂SOS与LAT偶联，但正如T细胞中的情况一样，可能还涉及其他Ras GEF，如RasGRP(34–37). 已知JNK和p38也被近端丝氨酸/苏氨酸激酶级联激活，但将这些级联偶联到LAT的实际方法尚不清楚。无论如何，所有这些途径的LAT依赖性似乎也很复杂，与–所有LAT-4YF均受到强烈抑制，而其他突变体仅提供部分重组。
我们最近证实，FcɛRI的弱刺激导致Fyn/Gab2-与LAT介导的信号更强的诱导，并使淋巴因子反应偏向更有效的趋化因子反应(38). 在弱刺激下，对基因激活小鼠肥大细胞的分析显示，Gab2或LAT对趋化因子或细胞因子的相对重要性存在差异。当刺激强度增加时，这种差异缩小了。然而，与目前的结果一致，无论刺激强度如何，MCP-1 mRNA相对不受LAT缺乏的影响。相反，正常MCP-1反应需要Gab2。我们在本研究中测量的转录事件显示出进一步的复杂性。当使用强刺激时，几乎所有淋巴因子都观察到至少部分LAT依赖性的证据。同样，无论LAT在哪里发挥作用，4YF突变都能消除所有LAT依赖性效应。其他三种突变的影响较小。这些结果为以下观点提供了进一步的证据：多条通路在LAT处收敛，这些相互作用是最佳反应所必需的。
BMMC被用作研究LAT酪氨酸突变对FcõRI参与后的信号传导和细胞事件的影响的一种手段。如前所述，这些酪氨酸残基对这些途径和肥大细胞激活至关重要。然而，很难判断表达不同突变集的细胞之间某些数量差异的重要性。为了更严格地评估远端四个酪氨酸和Y136F突变的功能，特别是，我们决定确定这些突变对体内组胺释放的影响。先前的研究揭示了这种病理生理反应对LAT的需求(13). 本文描述的实验表明，携带4YF或1YF LAT突变的小鼠在被动全身过敏反应中受到严重损害。鉴于在1YF小鼠中观察到高水平的循环IgE，抗IgE交联被用作绕过潜在饱和受体的手段。在这些条件下，反应是相同的。鉴于这些小鼠患有全身性疾病，对这一结果的合理警告是，可能还有其他未知因素导致完全无反应。一些4YF小鼠的组胺释放水平较低，这确实表明这些小鼠中可能存在一些代偿机制，但在完全缺乏LAT的小鼠中则不存在这种机制，因为它们可以产生一些反应。
除了我们对LAT缺陷BMMC的研究外，还发表了关于SLP-76、Vav和Gab2缺陷BMMC功能的研究。LAT和SLPL-76缺陷型肥大细胞的表型几乎相同，这表明，正如所怀疑的那样，这些分子位于同一途径(13,30). 在Vav缺乏细胞中，大多数反应与LAT缺乏细胞相似，但脱颗粒、全身过敏反应和IL-3表达在Vav缺陷细胞中没有严重受损(39). 在Vav缺陷细胞中，TNFα的表达和ERK的激活没有受到显著影响，PI3激酶的激活受到更大的影响。这些细胞反应的一般相似性表明，Vav和LAT在许多反应中处于相同的途径，但在其他反应中是独立的。Gab2缺陷细胞中也观察到一些Vav效应的丧失，这与LAT缺陷细胞最显著的不同之处在于，PI3激酶反应需要Gab2，而LAT的丧失对PI3激酶途径没有影响(31). JNK和p38激酶受到Gab2丢失的不利影响大于LAT丢失的影响。这些不同研究的结果表明，几个途径耦合到FcɛR1。其中包括Gab2和LAT耦合响应(32). 此外，我们目前的工作证明了LAT上通过不同酪氨酸残基耦合的途径之间的相互作用。更详细地了解这些不同途径需要仔细分析设计为缺乏多种适配器和信号分子的BMMC。
致谢
作者感谢S.Krebs和M.Sanford对细胞因子和趋化因子的分析。
Saitoh是日本科学促进会的研究员。
笔记
本文中使用的缩写：BMMC，骨髓源性肥大细胞；辣根过氧化物酶；IRES，内部核糖体进入位点；ITAM，免疫受体酪氨酸基激活基序；LAT，激活T细胞的连接物；MAP，丝裂原活化蛋白；髓鞘碱性蛋白；磷脂酶C；蛋白酪氨酸激酶；RANTES，受激活调节，正常T细胞表达和分泌；WT，野生型。
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