小鼠T细胞受体γδ的不同贡献⁺和TCRαβ⁺T细胞对化学诱导皮肤癌不同阶段的影响

摘要

介绍

非黑色素瘤皮肤癌（NMSC）是白种人中报告的最常见的恶性肿瘤，其发展可能受到免疫系统调节的程度值得关注。支持这一规定的事实是，医源性免疫抑制器官移植受者对皮肤鳞状细胞癌（SCC）的易感性增加了24倍以上，是迄今为止临床免疫抑制病例中肿瘤发病率变化最大的一例(1). 这些数据促使人们对免疫治疗作为SCC和其他NMSCs治疗的前景产生浓厚兴趣。

尽管如此，也有报道称，非甾体抗炎试剂（如环氧合酶-2抑制剂）可降低SCC的发病率，这可能会降低肿瘤组织的免疫调节(2,三). 一种假设是，免疫抑制个体的易感性增强，抗炎药的保护作用增强，免疫系统中有不同性质的成分，它们实际上分别抑制和促进肿瘤的发展。因此，可以预测，优先抑制淋巴细胞促进肿瘤发展的药理抗炎药总体上会显示抗肿瘤效果。

不同免疫成分对肿瘤反应的概念支持了以下观察结果：许多癌细胞生长的上皮细胞含有不同的T细胞亚群，分别由常驻、上皮内淋巴细胞（IEL）和浸润性系统T细胞组成(4,5). 考虑到上皮细胞的表面积较大，有人提出IEL约占人体T细胞的四分之一到一半。当交叉比较时，IEL和全身T细胞显示出高度不同的基因表达谱和T细胞受体的使用(6,7). 例如，小鼠和人类系统性T细胞亚群主要由TCRαβ控制⁺细胞，IEL储备在TCRγδ中过度富集⁺单元格(5).

小鼠皮肤是IEL和全身T细胞共存的显著例子。构成性IEL储备包括树突状表皮T细胞（DETC）亚群，其中>95%的细胞表达单一、均匀的γδTCR(8). 同时，表皮含有组织相关DC，称为朗格汉斯细胞，它处理皮肤中遇到的抗原并迁移到局部LN，在那里它们启动并通过抗原反应的系统性αβT细胞刺激皮肤浸润。最近，我们报道了TCRγδ⁺DETC积极抑制αβT细胞依赖性细胞浸润向皮肤的迁移(9). 免疫系统“局部”和系统成分之间的功能相互作用的例子表明，DETC可以保护上皮完整性免受内部破坏。据报道，DETC可产生局部活性的角质形成细胞生长因子，提示DETC可进一步保护上皮完整性(10).

相对于免疫活性对应物，TCRδ^−/−小鼠也被证明对三种方案中的任何一种诱导的鳞状细胞癌的发展高度敏感(11). 作为一种潜在的潜在机制，分离的DETC依赖于两个γδ细胞表面受体TCRγδ和NKG2D的参与来溶解SCC细胞(11). 尽管TCRαβ^−/−小鼠同样易受某些SCC诱导方案的影响(11)，这并不是普遍的，这增加了不同T细胞亚群对肿瘤调节的不同贡献在小鼠皮肤中表现出来的可能性。与此一致，Siegel等人(12)据报道，当αβT细胞通过抗原肽免疫预激活后，表达转基因TCRαβ的小鼠皮肤乳头状瘤发病率增加。同样，最近有报道称CD4⁺αβT细胞对细菌感染有明显反应，可引起组织破坏，从而促进转基因致癌基因诱导的皮肤肿瘤的进展(13). 本文对一些T细胞对化学致癌反应可能促进肿瘤发展的概念进行了更广泛的测试，其中大量小鼠接受两阶段化学致癌方案，其中分别监测乳头状瘤的诱导和癌变的进展。本文中使用的FVB小鼠菌株先前已被证明对化学诱导的SCC高度敏感(14). 发展的肿瘤完全是同基因的，理论上限制了传统的、MHC限制的αβT细胞识别肿瘤抗原衍生肽的表达。我们发现γδ细胞缺乏导致乳头状瘤和癌的发病率显著增加。相比之下，αβT细胞对乳头状瘤发展的影响不太明显，最显著的是，有明确证据表明αβT淋巴细胞的存在促进了乳头状瘤向癌的发展。此外，我们发现γδ细胞对肿瘤的免疫监视受到基因调控。

材料和方法

两阶段化学致癌协议。

首先用吸管吸取200 nmol的DMBA，然后每周用5或40 nmol的肿瘤促进剂TPA（丙酮）在8周龄小鼠的背部皮肤上治疗，1周后用电剪刀剃毛，然后用脱毛膏。（对于中所示的实验图2C、 仅用一把剃须刀就可以去除所有老鼠身上的毛发）。

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图2。

T细胞缺乏小鼠肿瘤发展的形态学评估。在两阶段化学致癌作用下发生的肿瘤（参见图1)如材料和方法所述，被评分为临床明显的乳头状瘤（P）或癌（C）。（A） 获得了典型肿瘤的苏木精和伊红染色切片，并显示了典型示例。这个乳头状瘤(第1页; 评分指数见正文），轮廓对称，棘皮病和乳头状瘤病（×40），角质形成细胞均匀，细胞质中等丰富，细胞核小而圆（×100）。这个早期癌症(指挥与控制)表现出不对称轮廓和由不典型上皮（×40）组成的瘤样滤泡样结构的扩张。多形性角质形成细胞随意浸润真皮，核质比增加（×100）。这种晚期癌症(C3类)表现出一种组织不良、不对称的生长模式（×40），由聚集在血管结缔组织核心（×100）周围的非典型角质形成细胞组成。（B） 实验中描述的乳头状瘤和癌的发展图1第17周*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.005；****，P<0.001。（C） 研究结束时第二次独立实验中的乳头状瘤和癌症发展。未注明，未完成。（D） TCRδ中两个代表性小鼠的肿瘤外观^−/−和TCRβ^−/−δ^−/−组。

结果

TCRδ中肿瘤发病率增加，肿瘤发病更快^−/−和TCRβ^−/−δ^−/−老鼠。

为了诱导皮肤SCC，FVB小鼠先涂上200 nmol DMBA，然后每周用低剂量（5 nmol）的肿瘤促进剂TPA治疗。每个实验组由15只小鼠组成，其中记录了随时间推移可触及肿瘤（>1mm）的发展情况。肿瘤大小被分类为T1>1 mm²，T2≥4毫米²，T3≥9毫米²，且T4≥16 mm²(表一). 在WT小鼠中，肿瘤在发病后11至13周内首次可见(图1)然后发病率缓慢但稳定地增加，直到17周，因为人道主义原因，实验被缩短。到那时，15只小鼠中有13只（87%）记录了60个肿瘤（平均4.0±0.9/只；图1和表一.

表一。

DMBA启动后第13、15和17周的肿瘤大小

	第13周					第15周					WK17号机组
	T1类	T2段	T3航站楼	T4类	Lg百分比。	T1类	T2段	T3航站楼	T4类	Lg百分比。	T1类	T2段	T3航站楼	T4类	Lg百分比。
重量	21	7	1	0	27.6	36	14	1	0	29.4	36	18	4	2	40
β−/−	33	19	2	0	38.9	31	29	5	三	54.4	30	38	6	12	65.1
δ−/−	72	69	13	2	53.2	33	130	17	三	80.7	57	142	36	10	76.7
β−/−δ−/−	183	144	11	0	45.9	113	262	11	9	73.2	181	282	33	13	64.4

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百分比Lg。，肿瘤≥T2的百分比；其中1 mm²<T1<4毫米²≤T2<9毫米²≤T3<16毫米²≤T4。

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图1。

TCRδ中肿瘤快速发病和肿瘤发病率增加^−/−和TCRβ^2/2δ^2/2老鼠。根据两阶段化学致癌方案，即开始使用200 nmol DMBA和每周使用（低剂量）5 nmol TPA，观察WT（w.t.）和t细胞缺陷小鼠所有皮肤肿瘤（乳头状瘤或癌>1 mm；参见图2和表二用于故障）。尽管TCRβ^−/−与WT小鼠相比，仅缺乏αβT细胞的小鼠在肿瘤发生方面没有显著差异，TCRδ^−/−小鼠（γδT细胞缺乏）和TCRβ^−/−δ^−/−小鼠（αβ和γδT细胞均缺乏）发病较早，肿瘤发展明显增加。*，β的P≤0.0001^−/−δ^−/−和δ^−/−相对于WT或β^−/−.

在TCRβ中^−/−在WT小鼠中检测到任何肿瘤之前，有两个肿瘤出现，但此后两个菌株中的肿瘤发展具有可比性。到17周时，15只小鼠中有10只产生了86个肿瘤，平均每只小鼠产生5.7±1.8个肿瘤，与WT无显著差异（P<0.08；图1和表一). 相比之下，TCRδ对肿瘤诱导的易感性明显更高^−/−老鼠。在WT小鼠中检测到肿瘤之前约1个月首次出现肿瘤，然后在11到13周之间肿瘤发病率急剧增加，之后增加稳定但不太明显(图1). 到17周，TCRδ的100%^−/−小鼠有245个肿瘤（平均每只小鼠16.3±2.3个肿瘤，比WT高出四倍以上；P[δ^−/−与重量]<0.0000064，P[β^−/−vs.δ^−/−] < 0.00015). 这些数据符合并扩大了TCRδ的高敏感性^−/−小鼠至SCC(11)并强调αβT细胞在TCRδ中的无能^−/−小鼠在缺乏γδ细胞的情况下有效控制化学诱导的肿瘤发生率。

TCRβ对肿瘤发展的敏感性最高^−/−δ^−/−缺乏γδ细胞和αβT细胞的小鼠(图1). 肿瘤的出现不早于TCRδ^−/−但在11至13周之间，肿瘤发展的上升幅度更大。到17周时，100%的TCRβ^−/−δ^−/−小鼠共有509个肿瘤（平均33.9±1.8个/只；图1和表一该发病率（比WT增加八倍以上；P<10⁻¹⁰)显著超过所有其他菌株。

总之，这些数据表明，无论是在发病时间还是累积肿瘤发病率方面，小鼠γδ细胞在下调化学诱导的皮肤肿瘤发生中发挥着重要作用。事实上，在每个时间点，TCRδ中体积较大的肿瘤比例最大^−/−老鼠(表一见下文）。TCRβ肿瘤的多发性^−/−δ^−/−缺乏所有T细胞的小鼠相对于TCRδ的发生率^−/−尽管TCRβ^−/−与WT-FVB对应物相比，小鼠对肿瘤发展的敏感性并没有显著增加。一种解释是TCRβ^−/−小鼠γδ细胞容易补偿αβT细胞的大多数抗肿瘤活性，而在TCRδ细胞中^−/−小鼠有一定的αβT细胞替代γδ细胞的某些作用。因此，由于它缺乏任何T细胞活性，TCRβ^−/−δ^−/−小鼠在肿瘤监测中表现出一种夸张的缺陷。一个T细胞亚群对另一个T淋巴细胞亚群的缺失进行不同程度的补偿的能力，以前在发生于法斯-缺乏所有T细胞的缺陷小鼠fas公司-缺乏单个T细胞亚群的缺陷小鼠(15).

高剂量致癌物对αβT细胞的肿瘤调节。

为了进一步研究αβT细胞对肿瘤进展的调节，进行了每周向WT和TCRβ应用40 nmol（而非5 nmol）TPA以促进肿瘤生长的实验^−/−老鼠。在这种条件下，与使用低剂量TPA时相比，WT小鼠产生的肿瘤要多得多。在这些条件下，TCRβ^−/−小鼠的肿瘤面积明显低于WT小鼠（15周时为12.7±1.7 vs.20.9±1.9；P=0.0015；未描述），并且每只小鼠的肿瘤区域明显更小（68.2±9.5 mm²与203.1±25.2相比；P<0.001；图3A） ●●●●。此外，TCRβ^−/−小鼠对肿瘤进展为癌的敏感性大约低5倍（每只小鼠2.35±0.5 vs.11.8±1.1 cm²; P<0.0001），第15周(图3B） ●●●●。WT和TCRβ肿瘤发展的对比表现^−/−老鼠被描绘成图3C、。

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图3。

肿瘤负担显著降低和TCRβ进展^−/−老鼠。根据两阶段化学致癌方案，即开始使用200 nmol DMBA，每周使用（高剂量）40 nmol TPA、WT（w.t.）和TCRβ^−/−跟踪小鼠肿瘤的发展（>1mm）。TCRβ^−/−缺乏αβT细胞的小鼠表现出明显较低的（a）肿瘤面积和（B）肿瘤发展。（C） 来自WT和β^−/−组。（D） αβ存在的代表性流式细胞术分析⁺6周龄TCRβ小鼠脾脏中的（H57）T细胞^−/−小鼠、WT小鼠和TCRβ^−/−小鼠出生时通过腹腔注射第13.5天的FLHSC进行重组。（E和F）重组TCRβ^−/−小鼠（β^−/−+αβT细胞）的肿瘤面积（E）和癌形成率（F）均高于TCRβ^−/−老鼠。*，P≤0.02；**，P≤0.01；***，P≤0.005。

尽管本研究中使用的TCR突变小鼠被广泛回交到FVB株，但重要的是，TCRβ^−/−小鼠主要是由于缺乏αβ⁺T细胞。因此，TCRβ^−/−小鼠出生时用WT FVB供体的第13.5天FLHSC重组。重组小鼠脾脏的流式细胞术(n个=13）在6周龄时，外周血αβT细胞室出现大量重新填充（平均43.0±5.2%；图3D） 然后，使用40 nmol TPA对小鼠进行两阶段致癌。与模拟重组TCRβ相比^−/−小鼠，αβT细胞-重组TCRβ^−/−肿瘤面积约为肿瘤面积的三倍（147.1±32.4 vs.43.3±10.1 mm²; P=0.0025；图3E） 每只小鼠的癌症数量增加了三倍（4.6±1.0 vs.1.4.1±0.4 cm²; P=0.0025；图3F） 启动后15周。这些数据表明，携带αβT细胞的小鼠比缺乏αβT淋巴细胞的相同基因型的小鼠更容易发生肿瘤进展。

基因修饰物通过γδ细胞调节肿瘤监测。

在确定γδT细胞缺乏会增加FVB小鼠对SCC的易感性后，我们研究了这一观察结果是否可以用来揭示肿瘤发展的额外遗传修饰因子。因此，将DMBA TPA（5 nmol）方案应用于483 WT和TCRδ的SCC诱导^−/−FVB小鼠、WT和TCRδ^−/−C57BL/6（B6）小鼠及其杂交。数据证实FVB比B6更容易受到SCC的化学诱导(图4; 参考14). 他们还证实了FVB的更高敏感性。TCRδ^−/−鼠标。然而，这种敏感性的增加在B6和TCRδ中都不明显^−/−小鼠或（B6×FVB）F₁TCRδ^−/−老鼠(图4)两者的肿瘤耐药率均较高。因此，γδ细胞对SCC调节的强大贡献是对SCC高度敏感的FVB动物的一个特征。因为没有B6.TCRδ^−/−小鼠表现出两种以上的肿瘤，我们将敏感性增强定义为小鼠携带两种以上肿瘤。引人注目，26.2%的（B6×FVB）F₂TCRδ^−/−小鼠和46.3%的（B6×FVB）F₁TCRδ^−/−回交FVB的小鼠表现出更强的敏感性。如果B6和FVB小鼠之间的单个基因分离调节γδ缺乏症的易感性，那么F组的预期频率将为25%₂小鼠和回交小鼠各占50%。虽然修饰基因可能通过多种机制（例如，对DMBA诱变的敏感性、对TPA刺激的敏感性）影响该系统中的致癌作用，但未来对这些基因进行定位的尝试可能会阐明一些因素，以补偿高度抗肿瘤宿主中的局部T细胞免疫监视。

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图4。

易感FVB杂交的肿瘤发展。TCRδ^2/2带电阻C57BL/6.TCRδ^2/2老鼠。FVB公司。TCRδ^−/−（FVB.δ^−/−)和C57BL/6.TCRδ^−/−（B6.δ^−/−)培育小鼠产生F₁.δ^−/−，F₂.δ^−/−、和（F₁×FVB）回交（BC）。δ^−/−根据200 nmol DMBA启动和每周（低剂量）5 nmol TPA的两阶段化学致癌方案，在DMBA启动后第16周跟踪小鼠所有皮肤肿瘤（乳头状瘤或大于1 mm的癌）的发展。表示每组每只动物肿瘤总数的平均数±标准差。尽管没有B6.δ^−/−小鼠出现两种以上肿瘤，占BC的46.3%。δ^−/−F2.δ的26.2%^2/2小鼠出现了两个以上的肿瘤。

讨论

这项对WT和T细胞缺陷型FVB小鼠在两种化学致癌物剂量下诱发的皮肤恶性肿瘤的广泛研究表明，肿瘤发展的免疫监测可分为定性不同的免疫成分。γδ细胞对化学诱导的SCC具有保护作用，而αβT细胞对低剂量致癌物的保护作用相对较小(图1). 此外，在较高剂量的致癌物下，TCRβ^−/−小鼠对乳头状瘤的抵抗力高于WT小鼠(图3). 当对乳头状瘤转化为癌进行评分时，αβT细胞对宿主保护作用的失败最为明显，事实上，αβT细胞促进了乳头状瘤向癌的转化，尤其是在前驱病变（即乳头状瘤）数量较多的情况下。这在四个实验中得到了证实：两个独立的实验中，使用了稍微不同的方案将低剂量的致癌物应用于TCRβ^−/−δ^−/−小鼠与TCRδ^−/−老鼠(图2、B和C)，一个将高剂量致癌物应用于TCRβ的实验^−/−小鼠与野生型小鼠(图3B） ，以及一项将高剂量致癌物应用于TCRβ的实验^−/−小鼠与TCRβ^−/−αβT细胞重组小鼠(图3、E和F).

显然，αβT细胞通常表现出保护性抗肿瘤活性，如人类黑色素瘤中肿瘤相关抗原的抗原特异性靶向(16,17)以及缺乏αβT细胞的小鼠对甲基胆蒽诱导的NMSC的敏感性降低(11). 因此，确定调节聚集性αβT细胞是否抑制或促进肿瘤发展的因素至关重要。一个因素可能是肿瘤的免疫原性。例如，黑色素瘤可能具有足够的免疫原性，为全身αβT细胞提供无数靶点。相比之下，由两阶段动力学作用的化学物质在同基因宿主中诱导的SCC可能具有较少的免疫原性。事实上，Williams等人(18)据报道，即使在共刺激分子实验性上调后，此类肿瘤也未能激活保护性全身T细胞反应。在这种情况下，αβT细胞的参与可能是肿瘤抗原的非特异性，例如对局部炎症的反应，并可能通过分泌大量细胞因子和金属蛋白酶促进肿瘤生长(13,19). 无论涉及何种机制，本文提供的数据可能有助于免疫治疗策略，因为它强调增强的系统性T细胞激活可能对肿瘤早期发展最有效。随着肿瘤的进展，旨在增强全身T细胞反应的治疗可能会显示出更多不同的疗效。

同时，重要的是不要忽视γδ细胞，以及可能与γδ细胞相似的其他局部作用的非传统T细胞在肿瘤监测中的作用(5,6). γδ细胞抑制SCC的效果可能反映出肿瘤起源于富含TCRγδ的区域⁺IEL。因此，肿瘤发育的解剖部位可能决定了攻击肿瘤的最佳免疫反应的性质。尽管有一种独特的TCRγδ，但人类表皮中相应的保护性T细胞隔室尚未报道⁺最近描述了人类真皮的剧目(20). 此外，众所周知，人体肠道富含全身T细胞和IEL，包括γδ细胞，据报道，γδ细胞可攻击表达MHC类IB分子MICA的人肠癌(21). 因此，本文所述的局部T细胞的保护作用可能为人类肿瘤的监测提供了一个易于控制的动物模型。TCRγδ的容量⁺靶向MHC类IB分子（如MICA）的IEL可能对失去传统MHC抗原表达的肿瘤特别有效，这是一个常见的临床问题。

除了直接靶向肿瘤外，局部T细胞的作用可能是多方面的，因为DETC是αβT细胞介导的皮肤炎症的有效抑制剂(9)强烈提示局部T细胞可能降低αβT细胞促进癌形成的潜力。同样，局部驻留和/或浸润的T细胞亚群可能直接改变（例如，增加或减少）应用TPA的促炎作用。环境致癌物的增强可能是T细胞调节人类致癌的一种机制，尽管有证据表明αβT细胞可能促进肿瘤的发展，但在不涉及化学致癌物质的系统中也有报道(12,13,19).

许多基因影响小鼠的皮肤癌发生（如人类的情况；14），并且我们在本文中显示了TCRδ中所见的对肿瘤发展的敏感性增加^−/−与C57BL/6背景相比，小鼠依赖于FVB背景中发现的修饰基因。这些基因现在可以被识别。尽管如此，它们的存在增加了一种形式上的可能性，即在TCR突变小鼠与FVB的回交过程中与中断的TCRβ基因座共分离的基因可能有助于观察到的TCR^−/−FVB小鼠相对于WT FVB(图3). 通过显示TCRβ^−/−通过与外周血αβT细胞重组，小鼠可以显著增加，而不会影响任何其他基因。因此，在这个模型中，αβT细胞的存在是肿瘤进展增强的主要决定因素。

总之，通过根据肿瘤的解剖部位、免疫原性、发育阶段和宿主的遗传学对肿瘤类型进行分类，可以为适当的免疫疗法的设计和应用提供有用的信息。实际上，有效的免疫监测可能与遗传上易感肿瘤的宿主最为相关，而在更具耐药性的宿主中，其他基因的作用可能替代免疫监测。本文通过B6和FVB小鼠对TCRγδ细胞肿瘤监测的不同依赖性来模拟这种遗传影响。正在进行的确定这种差异背后基因的研究可能有助于阐明支持人类免疫监测重要性的因素。

致谢

笔记

本文中使用的缩写：树突状表皮T细胞；DMBA，7,12-二甲基苯并[a]蒽；胎肝造血干细胞；上皮内淋巴细胞；非黑色素瘤性皮肤癌；鳞状细胞癌；TPA，12-O-十四烷基佛波醇13-醋酸盐。

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