《实验医学杂志》。2002年9月2日；196(5): 641–653.
丙型肝炎病毒核心蛋白激活STAT3导致细胞转化
,1,2 ,1 ,三 ,4 ,2 ,5和1
吉田高文
1日本福冈市东町Maidashi，九州大学生物调节医学研究所分子和细胞免疫学部，邮编：812-8582
2日本库鲁姆830-0011，库鲁姆大学医学院第二内科
河田东胜
1日本福冈市东町Maidashi，九州大学生物调节医学研究所分子和细胞免疫学部，邮编：812-8582
德川武史
三千叶大学医学研究生院发育遗传学系（H2），日本千叶中央区260-8670
Kosai先生
4日本岐阜大学医学院心血管再生医学系，岐阜500-8705
米奇奥·萨塔
2日本库鲁姆830-0011，库鲁姆大学医学院第二内科
Michinori Kohara公司
5日本东京都会医学院微生物与细胞生物学系，日本东京113
秋池吉村
1日本福冈市东町Maidashi，九州大学生物调节医学研究所分子和细胞免疫学部，邮编：812-8582
1日本福冈市东町Maidashi，九州大学生物调节医学研究所分子和细胞免疫学部，邮编：812-8582
2日本库鲁姆830-0011，库鲁姆大学医学院第二内科
三千叶大学医学研究生院发育遗传学系（H2），日本千叶中央区260-8670
4日本岐阜大学医学院心血管再生医学系，岐阜500-8705
5日本东京都会医学院微生物与细胞生物学系，日本东京113
2001年12月24日收到；2002年6月27日修订；2002年7月17日接受。
摘要
信号转导子和转录激活子（STAT）家族蛋白是介导细胞因子信号传导的关键转录因子。其中，STAT3通常在人类癌症和转化细胞系中被组成性磷酸化和激活，并与肿瘤发生有关。然而，STAT3在人类肿瘤细胞中持续激活的原因尚不清楚。丙型肝炎病毒（HCV）是非甲非乙型肝炎的主要病原体，HCV的慢性感染与肝硬化和肝癌的发展有关。HCV核心蛋白被认为负责病毒诱导的转化。我们现在报道HCV核心蛋白通过关键酪氨酸残基的磷酸化直接与STAT3相互作用并激活STAT3。NIH-3T3细胞中HCV核心激活STAT3导致Bcl-XL和cyclin-D1快速增殖和上调。在HCV核心表达细胞中STAT3的额外表达导致了锚定物非依赖性生长和肿瘤发生。我们认为HCV核心蛋白与STAT3协同作用，导致细胞转化。
关键词：STAT3、磷酸化、HCV、核心蛋白、转化
介绍
信号转导子和转录激活子（STAT）*在过去十年中，家族蛋白被鉴定为调节几乎所有细胞因子信号的转录因子(1,2). 这些蛋白质通过酪氨酸磷酸化被激活，酪氨酸磷酸化常通过细胞因子受体相关激酶Janus激酶（JAK）家族蛋白质发生(三). 除了在正常细胞信号传导中的核心作用外，最近的研究表明，组成性激活的STAT信号，尤其是STAT3，直接参与肿瘤的发生(4). 例如，所有型钢混凝土转化细胞株表现出组成性激活状态3(5)，而显性负Stat3抑制型钢混凝土转换而不影响ras（拉斯维加斯）转换(6,7). 更直接地说，Bromberg等人(8)证明了STAT3-C的组成激活形式，STAT3-C-在SH2结构域的COOH末端环内有两个取代的半胱氨酸残基，产生自发转录活性的二聚体，可以通过软琼脂中的集落形成和裸鼠中的肿瘤形成来导致细胞转化。因此，活化的Stat3分子本身可以介导细胞转化。对原发性肿瘤和肿瘤细胞系的广泛调查表明，STAT3的不当激活在多种人类癌症中发生的频率高得惊人(9). 然而，STAT3基因的突变尚未在这些癌症中发现，因此尚需确定内源性STAT3是如何组成性激活的。
丙型肝炎病毒（HCV）是非甲非乙型肝炎的主要病原体，可导致慢性感染，最终导致肝硬化和肝细胞癌（HCC）；参考文献10和11). 全球每年有25万至120万HCC新病例，因此HCV是全球发病率和死亡率的主要传染源之一(12). 丙型肝炎病毒（HCV）是一种阳性的RNA病毒，由一个～9600个碱基组成，开放阅读框基因组编码一个3010个氨基酸的多聚蛋白，由细胞和病毒蛋白酶加工成三到四个假定的结构（核心，E1，E2/p7）和至少六个非结构（NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B）蛋白质。其中，HCV核心蛋白来源于NH2-前体多聚蛋白的末端191个氨基酸与细胞转化有关。在一个在肝脏中表达核心蛋白的转基因（Tg）小鼠系中证明了这一点，该转基因小鼠系可诱导肝癌(13)，尽管这一点一直备受争议，并且有几个HCV核心-Tg小鼠系不发展为HCC。核心本身的转化潜力已被证明是微弱的；核心蛋白可以与其他致癌基因如Ras协同转化成纤维细胞。因此，有人认为，HCV核心诱导细胞转化可能需要额外的因素。Kato及其同事证明，在HCV和乙型肝炎病毒（HBV）结构和非结构蛋白中，HCV核心蛋白是最有效的信号诱导剂，通过使用cAMP反应元件、血清反应元件（SRE）和含有核因子（NF）-κB结合位点的元件的各种报告分析确定，激活蛋白1（AP-1）和血清反应因子（SRF；参考14). HCV核心蛋白还影响一些转录因子的活性，包括LZIP和Elk-1；然而，这些转录调节因子在核心介导的转化中的作用尚不清楚(15,16).
我们现在报道HCV核心蛋白直接与STAT3相互作用并选择性激活它。NIH-3T3细胞中HCV核心激活STAT3导致STAT3依赖性快速增殖，Bcl-XL和cyclin-D1上调。核心蛋白还可以与野生型STAT3的额外表达协同转化NIH-3T3细胞。这些数据表明，STAT3的组成性激活在HCV核心蛋白的转化中起着重要作用。
材料和方法
Core-Tg小鼠和致癌物治疗。
使用携带HCV-核心cDNA（HCV-1b株）的构建物融合到HBV X基因（Px）启动子（pPx-核心；参考17). 采用常规方法培育Tg小鼠。用（C57BL/6×DBA/2）F1代小鼠获得受精卵，并与C57BL/6小鼠交配五代以上。HCV核心蛋白的表达已发表(17). 核心蛋白在包括大脑、心脏、肺、肾、胸腺和肝脏在内的各种组织中表达。然而，肝脏中的蛋白质水平约为脾脏和其他组织中蛋白质水平的三分之一。
如前所述，4周龄雄性小鼠以10μg/g体重一次性（腹腔内）注射二乙基亚硝胺（DEN；Sigma-Aldrich）(18). 2天后，处死这些小鼠，并用三个肝叶的部分进行免疫印迹和免疫组织化学研究。为了进行免疫印迹，通过在提取缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.5，150 mM NaCl，1%NP-40，1 mM EDTA，1 mM钒酸盐）中均匀组织来制备肝脏提取物。根据制造商的指示，使用DC蛋白质分析系统（Bio-Rad Laboratories）测定每个肝脏提取物的蛋白质浓度。随后使用20μg总肝蛋白进行免疫印迹分析，如下所述。
细胞周期蛋白D1和增殖细胞核抗原（PCNA）的免疫组织化学检测是使用福尔马林固定的去乙酰化小鼠肝组织切片和抗PCNA和抗细胞周期蛋白D1抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）进行的，如所述(18). 根据制造商的说明，使用SAB试剂盒（Dako）和3,3′-二氨基联苯胺对抗体-蛋白质复合物进行可视化。
核心和丙型肝炎病毒cDNA。
使用从1b型慢性丙型肝炎患者血清中提取的HCV RNA作为模板，通过RT-PCR扩增HCV核心区（573个核苷酸）。核苷酸序列为98%，氨基酸序列与HCV MD7-1株完全相同(19). 将该cDNA亚克隆到带有NH的表达载体pcDNA3中2-终端Myc标签（六次重复；参考20)（pcDNA3-Myc-core）或标记向量（pCMV2-Flag；Kodak；pFlag-core。该克隆用于本研究的大多数实验。另一个核心cDNA基因型1b(21)被亚克隆到pEF1载体（pEF-core；Invitrogen）。还从慢性肝炎患者的血清中克隆了全基因组HCV cDNA，并使用带有poly-a信号的新耐药基因作为填充物将其亚克隆到Cre/loxP条件表达盒（pCALN）中(21). 在本研究中，通过XhoI消化去除Cre/loxP盒。所有HCV蛋白的表达，包括核心蛋白、E1、E2、NS1、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，均通过Western blotting进行了确认（未发表数据）。有关该质粒构建的详细信息将在其他地方发布。
细胞和转染。
HepG2细胞和NIH 3T3细胞分别在含有10%FCS和10%小牛血清（CS）的DMEM中培养。使用TransFast（Promega）或Fugene 6转染试剂（Roche）瞬时转染HepG2细胞和NIH 3T3。对HepG2细胞的转染效率为50-70%。一个用于STAT3活性的APRE-luciferase报告基因(20)如前所述，一个含有IFNα应答的ISRE（IFN刺激因子应答元件）荧光素酶的报告基因构建物(22). 荧光素酶分析是使用双荧光素报告系统（Promega）进行的。v的cDNA-型钢混凝土pcDNA3由滨中伸弥博士（日本名古屋大学）提供。标记的STAT3-C在pRcCMV中的表达质粒由纽约洛克菲勒大学Darnell，Jr.博士提供(8). 为了创建标记为Flag的野生型STAT3，STAT3-C被替换为WT-STAT3 cDNA。
逆转录病毒的构建和感染。
将myc标记的核心cDNA亚克隆到双顺反子逆转录病毒载体pMX-IRES-EGFP（增强型绿色荧光蛋白；参考文献23). 通过瞬时转染PLAT-E包装细胞系产生逆转录病毒(24). 转染后48小时，收集培养上清，NIH-3T3细胞（2×105用适当稀释的PLAT-E上清液（含10μg/ml聚brene）感染细胞24小时。EGFP荧光证实100%感染。感染细胞扩增2-5天，然后立即用于增殖和克隆形成分析。
腺病毒。
如前所述，在293个细胞中通过同源重组制备了含有lacZ（Ad-lacZ）、Myc-tagged SOCS3（Ad-SOCS3）和HA-taged Y705F-STAT3（Ad-dnSTAT3）基因的腺病毒载体(25). 病毒制剂在293个细胞上用斑点形成试验进行滴定。每个细胞的病毒粒子数（以PFU为单位）表示为感染多重性（MOI）。在MOI=50时接种腺病毒，根据lacZ染色评估，100%的细胞被感染。感染后立即将细胞用于实验。
转化测定。
4-6周龄无胸腺Balb-c/nu/nu小鼠注射106来自不同细胞系的细胞置于0.2 ml PBS中。3周后，对肿瘤进行测量。每个细胞系在2-3只不同的小鼠中进行测试。
结合试验。
将全长核心cDNA连接到pGEX-4T载体中，以创建GST融合核心蛋白（GST-core）。用或不用白血病抑制因子（LIF）刺激的HepG2细胞提取物与含有GST或GST核心的珠子在4°C下孵育1小时。在大量洗涤后，在SDS样品缓冲液中通过煮沸洗脱与珠结合的蛋白质，并用抗STAT3、抗ERK2、抗NF-κB p65亚单位或抗GST抗体进行免疫印迹（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）。NH系列2-通过PCR产生STAT3和核心的末端和COOH末端缺失突变体，并将其亚克隆到pcDNA3-myc或pCMV2标记载体中。这些cDNA在293个细胞中瞬时表达（1μg质粒/转染），细胞提取物用抗Myc多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）或抗旗帜抗体（M2；Eastman Kodak Co.）进行免疫沉淀，然后用抗Myc（9E10）或抗国旗抗体进行免疫印迹分析。
免疫沉淀和Western Blot分析。
细胞在裂解缓冲液中进行裂解（50 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl，0.5%NP-40，1 mM EDTA，1 mM钒酸盐，1 mM-DTT，0.1 mM APMSF），并在12000℃离心克沉淀实验前，以最终浓度1 mg/ml添加BSA 10 min，然后将上清液与指示抗体在4°C下孵育1 h。免疫复合物用蛋白A-Sepharose沉淀（Amersham Biosciences）。用裂解缓冲液洗涤三次后，用SDS-PAGE溶解免疫沉淀物，并用所述的指示抗体进行免疫印迹(20). 核和细胞质提取物的制备如下所述(8). 简单地说，细胞从培养皿上刮下来并制成颗粒；添加3倍于颗粒体积的细胞质缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.9，10 mM KCl，0.1 mM钒酸钠，1 mM EDTA，10%甘油，1 mM DTT，1 mM-PMSF），然后在冰上放置10分钟。使用均质机（10-20冲程）将样品溶解，并在Eppendorf离心机中旋转5分钟。上清液为细胞质部分。将沉淀用细胞质缓冲液洗涤一次，然后用核缓冲液（420mM NaCl、20%甘油、20mM HEPES、pH 7.9、10mM KCl、1mM EDTA、0.1mM NaVanadate、1mM PMSF、1mM DTT）重悬于2×沉淀体积中。每个样品10μg用于抗STAT3抗体的免疫印迹。抗-HCV核心单克隆抗体购自Arista Biological Inc.；抗JAK2购自UBI；抗酪氨酸磷酸化STAT1、抗酪氨酸磷酸化STAT3、抗酪氨酸磷酸化STAT5和抗酪氨酸磷酸化STAT6来自细胞信号技术；抗酪氨酸磷酸化JAK1和JAK2来自Quality Controlled Biochemicals，Inc。；抗STAT1、抗STAT3、抗-STAT5、抗ERK2、抗细胞周期素D1、抗bcl-X、抗NF-kB p65亚基和抗GST来自圣克鲁斯生物科技公司。
结果
HCV核心蛋白诱导STAT3活化。
研究表明，一例HCV核心蛋白在小鼠中的Tg表达导致HCC(13). 我们还开发了HCV核心Tg小鼠（Px-core Tg），其中核心蛋白普遍表达(17). 在13个月大的Px-core Tg小鼠的皮肤和肌肉中发生恶性肿瘤（22只中有6只），而在其非转基因同窝小鼠中没有发生肿瘤。我们的Tg小鼠没有发生HCC，可能是因为肝脏中核心蛋白的表达水平相对较低。同样，有研究表明，携带HBV X蛋白的Tg小鼠的肝脏只有轻微的组织病理学改变。然而，注射DEN使Tg小鼠HCC的发病率比野生型同窝小鼠增加了两倍(26). 通过检测PCNA和掺入5-溴-2′-脱氧尿苷来测量肝细胞增殖的程度，HBV-X蛋白Tg肝脏中的肝细胞增殖程度大约是野生型的两倍(18). 因此，我们询问HCV核心蛋白是否也有助于在DEN治疗后诱导肝脏结扎前阶段。如新的A、 cyclin D1阳性肝细胞的数量是野生型同卵双胞胎的约1.5倍。PCNA染色也获得了类似的结果（未公布的数据）。这些数据强烈表明丙型肝炎病毒核心与失调的增殖有关，这可能最终导致细胞转化。
HCV核心蛋白Tg小鼠肝细胞的增殖和STAT3激活。（A） DEN处理的Px核心Tg小鼠和野生型小鼠肝组织切片中Cyclin D1的代表性免疫组织化学染色（原始放大倍数×200）。细胞周期蛋白D1阳性细胞核呈棕色，未标记细胞核用苏木精复染。在右侧面板中，DEN处理的小鼠肝脏中Cyclin D1阳性肝细胞的百分比(n个= 4). 通过计数五个随机区域中Cyclin D1阳性肝细胞的平均值，每个区域约250个细胞。误差线表示标准偏差。（B） STAT3的磷酸化。两个Tg鼠系（核心-Tg1和核心-Tg2；第3、4、7、8和10列）及其同窝鼠（非Tg1和非Tg2；第一、二、五、六和九列）在没有（1-4、9、10列）或（5-8列）DEN的情况下进行处理。2 d后，制备肝细胞提取物（20μg蛋白质/条），并用抗磷酸-STAT3（PY-STAT3）、STAT3、磷酸-STAT5（PY-STAT5）、STAT5和HCV核心抗体进行免疫印迹。
由于STAT3的组成性激活通常发生在人类肿瘤中，STAT3激活与增殖和抗凋亡相关(27)，我们确定HCV核心蛋白是否会影响Px-core Tg小鼠肝脏中STAT3的活性。用抗磷酸化STAT3特异性抗体进行免疫印迹显示，在两个独立的Tg小鼠肝脏中，STAT3的酪氨酸705（Y705）发生磷酸化，这是一个对二聚体化和DNA结合至关重要的事件，但在非转基因同窝鼠中则不是这样(B、 车道1-4）。接下来，我们检查了DEN对肝脏STAT3激活的影响。注射DEN后2天，制备肝脏提取物。与野生型小鼠相比，经DEN处理的Tg小鼠肝脏中STAT3的酪氨酸磷酸化更强(B、 车道5–8）。由于STAT5在Tg和野生型小鼠中未磷酸化(B、 泳道9和10），这些数据表明核心蛋白特异性诱导和增强STAT3的激活。
如所示，核心蛋白在HepG2细胞和NIH 3T3细胞中的瞬时表达显著增加了STAT3转录活性，LIF刺激进一步增强了核心蛋白的STAT3活性。相反，丙型肝炎病毒核心蛋白不影响干扰素（IFN）α诱导的报告蛋白（ISRE-reporter）活性，后者反映STAT1和STAT2的激活(C） ●●●●。在不同类型的细胞中，包括293个细胞和Hela细胞（未公布的数据），核心也观察到类似的STAT3激活。核心蛋白不影响IFNγ诱导的STAT1或EPO诱导的STAT5激活（未公开数据）。与这些发现一致，当HCV核心蛋白在HepG2细胞中表达时，STAT3（而非STAT1或STAT5）被显著酪氨酸磷酸化(D、 a、b和c）。通过来自不同患者的三种独立HCV（基因型1b）的不同核心蛋白构建物观察到STAT3激活(E、 车道1-3）。丙型肝炎病毒全长基因组的表达导致STAT3激活比核心蛋白单独表达更强(E、 车道4）。
HCV核心蛋白激活STAT3。（A–C）报告基因分析。用0.5、1或2μg pcDNA3-Myc-core质粒转染HepG2（A和C）或NIH-3T3（B）细胞，然后用10 ng/ml LIF（A和B）或100 ng/ml IFNα（C）刺激6 h。测量STAT3-（A和B）或ISRE-（C）依赖的荧光素酶活性。（D） 核心蛋白使STAT3磷酸化。HepG2细胞转染0（1区和5区）、0.5（2区）、1（3区）、2（4区）μg核心质粒，然后免疫沉淀STAT3（a）、STAT1（b）、STAT5（c）、JAK1（d）和JAK2（e）。免疫沉淀用抗磷酸化形式特异性抗体进行印迹。作为阳性对照（泳道5），用LIF或IFNγ刺激细胞进行STAT3、STAT1和JAK1磷酸化。对于STAT5，用Epo刺激转染有促红细胞生成素（Epo）受体（Epo-R）的293个细胞。（E） 通过三个独立的HCV核心cDNA和全长HCV基因组DNA激活STAT3。pcDNA3-Myc-core（core-1，lane 1）、pPx-core（core-2，lane 2）、pEF-core（core-3，lane 3）和pCALN-HCV（HCV-full，lane 4）在HepG2细胞中瞬时表达，然后用指示的抗体对总细胞提取物进行免疫印迹。（F） 用空载体pcDNA3-Myc（第1道）或pcDNA3-Myc-core（第2道和第3道）或未转染细胞（第4道和第5道）转染的HepG2细胞在没有（第1-3道）或（第5道和第6道）10 ng/ml LIF的情况下处理3 h，然后再与（第3道和第五道）或不与（第1、2和第4道）AG490（50μM）培养6 h。用抗PY-STAT3或抗STAT3抗体对总细胞提取物进行免疫标记。
有趣的是，核心蛋白表达并没有激活JAK1和JAK2(D、 D和e）。此外，JAK抑制剂AG490并未阻止核心诱导的STAT3磷酸化(F、 通道2和3），而AG490有效阻止LIF诱导的STAT3激活（通道4和5）。我们尚未检查Tyk2。然而，这种激酶不太可能参与，因为SOCS3腺病毒并没有通过核心抑制STAT3的激活（参见D） ●●●●。这些数据表明，核心蛋白通过细胞因子受体和JAK非依赖性机制激活STAT3。
HCV核心对NIH-3T3细胞增殖的影响。（A） 用携带核心（pMX-core）或对照病毒（pMX）的逆转录病毒载体感染NIH-3T3细胞，然后将其放入35 mm的培养皿中，在正常生长条件下每天计算细胞数。显示了具有三次重复实验标准误差的平均细胞数。（B） 用抗磷酸-STAT3或抗STAT3免疫印迹来自亲代NIH-3T3细胞（亲代）或感染细胞的总细胞提取物。（C） 感染pMX-core逆转录病毒载体（NIH-3T3/core）的NIH-3T3细胞在MOI 50进一步感染携带lacZ、SOCS3和Y705F-STAT3（dnSTAT3）的腺病毒。感染后，每天对细胞进行电镀和评分（重复三次实验）。（D） 感染细胞的总细胞提取物用抗磷酸-STAT3、抗STAT3或抗SOCS3进行印迹。
堆芯和STAT3之间的直接相互作用。
核心蛋白激活STAT3表明这两种蛋白质之间存在直接相互作用。如所示，STAT3在体内外均与核心结合。体外磷酸化和非磷酸化形式的STAT3与GST融合核心蛋白结合(A） ●●●●。我们检测了核心蛋白是否与ERK2（MAP激酶）或NF-κB p65亚单位直接相互作用，因为核心已被证明在某些情况下激活MAP激酶和NF-κ的B(14,16). 我们在体外观察到核心与这些蛋白质没有直接相互作用(A） ●●●●。
核心蛋白与STAT3之间的相互作用。（A） 体外结合实验。用（+）或不使用（−）LIF刺激的HepG2细胞提取物与结合谷胱甘肽-脑葡萄糖的GST或GST-核心孵育。用抗STAT3、抗NF-κB p65和抗ERK2抗体对总细胞提取物（TCL）和与珠结合蛋白的等分样品进行免疫印迹。纯化的GST和GST核心融合蛋白（0.1μg蛋白）也用抗GST进行了印迹。（B） STAT3结构域和缺失突变体示意图。（C） 标记STAT3缺失突变体和myc标记核心在293细胞中共表达，然后与抗myc或抗标记抗体免疫沉淀。用抗Myc或抗Flag抗体印迹总细胞提取物（TCL）或免疫沉淀物（IP）。为了证实核心蛋白和ΔL-TA结构之间缺乏结合，右侧显示了单独实验的数据（实验2）。（D） 核心蛋白缺失构建体的示意图。（E） 用APRE-luciferase报告基因转染HepG2细胞，并增加显示的核心缺失突变体的数量。转染24小时后，检测荧光素酶活性。（F） 用标记了STAT3和myc的核心缺失突变体转染293细胞。带有抗Myc抗体或TCL的免疫沉淀物用抗Flag和抗Myc的抗体进行印迹。
接下来，我们确定负责绑定到核心的STAT3区域。如所示使用截短形式的STAT3进行的结合实验表明，STAT3的连接区对于与核心蛋白的相互作用至关重要。对于核心蛋白，ΔC2（1–113）结合和反式激活STAT3，而ΔC3（1–75）没有这样做；因此，残基75-113很重要。类似地，ΔN2（91–191）而非ΔN3（120–191；因此，驻留91-120非常重要。根据这些发现，氨基酸91–113不仅对STAT3结合至关重要，而且对TAT3转录激活也至关重要(). 这些数据表明，核心蛋白直接与STAT3相互作用，从而导致酪氨酸磷酸化和STAT3的激活。
核心蛋白主要位于细胞质中，但也可在细胞核中看到重要部分(28). 亚细胞分馏研究表明，小部分STAT3在核心蛋白存在的情况下转位到细胞核(A、 车道4）。LIF诱导STAT3在细胞核中的易位（泳道6），并且在核心蛋白存在的情况下STAT3的细胞核定位进一步增强（泳道8）。然后我们用免疫荧光显微镜检查核心和磷酸化STAT3的亚细胞定位。如预期，磷酸化STAT3与HepG2和NIH-3T3细胞中的核心蛋白共定位(B） ；大部分在细胞质中，但在细胞核中有一小部分。LIF处理细胞可加速细胞核内STAT3的移位。然而，在核心转染细胞中，磷酸化的STAT3仍有很大一部分存在于细胞质中，而磷酸化的TAT3主要存在于未转染细胞的细胞核中。磷酸化STAT3在核心蛋白存在下的细胞质保留也支持STAT3和核心蛋白之间强烈相互作用的概念。
STAT3（A和B）的核定位和STAT3的去磷酸化过程。用空载体（1、2、5和6道）或pcDNA3-Myc-core（3、4、7和8道）转染HepG2细胞，在没有（1-4道）或（5-8道）10 ng/ml LIF的情况下刺激30分钟。用抗STAT3抗体进行免疫印迹分析核（N）和细胞质（C）提取物（各20μg）。（B） 用Myc标记的核心cDNA转染HepG2细胞，然后用抗Myc（单克隆；红色）或抗磷酸化STAT3（多克隆；绿色）抗体进行免疫染色，然后用FITC-和Cy3-结合的二级抗体进行培养。白色箭头表示核心转染细胞的位置，黄色箭头表示未转染细胞。至少通过三个独立的实验获得了类似的结果。（C） 去磷酸化的时间进程。在环己酰亚胺（CHX）治疗前，用10 ng/ml LIF刺激转染或不转染核心cDNA（转染效率>60%）的HepG2细胞30分钟。在没有LIF的情况下，在100μg/ml CHX的存在下对细胞进行清洗和培养，培养时间为指定的时间段。用所示抗体通过免疫印迹法分析带有抗STAT3抗体的免疫沉淀物。使用NIH Image软件通过免疫印迹密度测定法定量非转染（开环）和转染（闭环）细胞中磷酸化STAT3的水平。
尽管核心选择性STAT3磷酸化的分子机制尚不清楚，但我们怀疑STAT3核心相互作用可能会阻止去磷酸化。因此，通过用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺培养细胞来比较磷酸化STAT3的去磷酸化。如所示C、 STAT3的磷酸化由核心蛋白表达维持。这表明HCV核心蛋白要么保护STAT3免受磷酸酶的攻击，要么将未知酪氨酸激酶招募到STAT3，从而诱导STAT3的结构性磷酸化。
核心诱导的增殖促进依赖于STAT3。
接下来，我们关注HCV核心蛋白对STAT3生物功能的影响。用携带核心cDNA的逆转录病毒（pMX）感染NIH-3T3细胞。如所示A、 核心蛋白的过度表达导致NIH-3T3细胞的增殖率增加，但仅核心蛋白的表达并没有诱导细胞转化（参见)在表达核心蛋白的NIH-3T3转化子（NIH-3T3/core）中观察到STAT3磷酸化(B） ●●●●。为了检测STAT3在核依赖性过度增殖中的作用，NIH-3T3/核细胞进一步感染携带lacZ（对照）、SOCS3或Y705F-STAT3的腺病毒(25;C） ●●●●。Y705F-STAT3被证明是STAT3的主要负形式（dnSTAT3；参考文献29). 由于dnSTAT3可以与核心结合（未公开的数据），dnSTAT_3的过度表达会将核心蛋白从内源性STAT3中隔离出来。另一方面，SOCS3结合gp130和JAK并抑制JAK酪氨酸激酶活性(30,31). 我们证实，SOCS3-和dnSTAT3-腺病毒感染均能完全抑制类风湿关节炎患者滑膜细胞LIF-诱导的STAT3活化和IL-6依赖性增殖，但不影响亲代NIH-3T3细胞的增殖(25). 如所示显性负性STAT3的过度表达将NIH-3T3/核心细胞的生长速度降低到亲代NIH-3T3细胞的水平，并降低STAT3磷酸化，而SOCS3对生长速度或磷酸化状态没有显著影响。使用表达核心蛋白的HepG2稳定转化子也观察到dnSTAT3的类似生长抑制（未发表数据）。这些数据证实了核心蛋白的生长促进活性依赖于STAT3，但核心介导的STAT3激活独立于细胞因子/JAK途径。
WT-STAT3和核心转染细胞的转化潜能。（A） 用WT-STAT3或STAT3-C转染NIH-3T3细胞或感染pMX-core的细胞，并将其置于软琼脂中，并在第10天拍照。在最低面板中，细胞在MOI=50时感染了携带dnSTAT3的腺病毒（Ad-dnSTAT3）。（B） NIH-3T3内源性和外源性STAT3水平及其与HepG2细胞的比较。用抗STAT3抗体对来自亲本3T3、表达核心和WT-STAT3（核心+WT-STAT3）的两个独立转化子和HepG2细胞的等量细胞提取物（15μg蛋白/条）进行免疫印迹。在5-40μg蛋白质之间观察到条带强度的线性。（C） 腺病毒对表达WT-STAT3/core的软琼脂细胞系的平板效率的影响。106将细胞感染指示的腺病毒（MOI=50）并培养10 d。对0.1 mm或更大的菌落进行评分。
核心的转换需要STAT3激活。
接下来，我们研究了核心蛋白对细胞转化的影响。最近的研究表明，STAT3对于v-src型STAT3（STAT3-C）的组成激活形式转化了正常成纤维细胞(5–7). 因此，我们检测了核心蛋白与野生型（WT）-STAT3或STAT3-C结合的转化潜力和A、 仅表达核心（pMX-core）或转染WT-STAT3不会在软琼脂中产生菌落。然而，将WT-STAT3转染到用pMX核心感染的NIH-3T3细胞中确实导致集落形成。WT-STAT3和核心（WT-STAT3/核心）的菌落形成效率和菌落大小与STAT3-C相当(A和). 核心和STAT3-C的结合进一步提高了菌落形成效率(). 从这些转化的菌落中回收细胞并进行培养。在软琼脂中形成的这些细胞中，外源性WT-STAT3的水平比内源性STAT3高1.5–2倍(B） 外源性和内源性STAT3均被核心酪氨酸磷酸化（参见)因此，STAT3的水平对于核心蛋白的转化是至关重要的。NIH-3T3细胞转化需要进一步的STAT3表达，这可能是因为与肝癌细胞系HepG2和小鼠肝组织中的STAT3含量相比，成纤维细胞系中STAT3的含量相对较低(B、 和未发布的数据）。
表一。
集落形成分析
| 稳定NIH-3T3衍生细胞系的电镀效率
|
|---|
| 矢量 | 菌落数（SD） | 细胞系 | 接种细胞 | 菌落数（SD） |
|---|
| pMX型 | 0 (0) | NIH-3T3 | 106
| 0 (0) |
| pMX+WT-STAT3型 | 0 (0) | NIH-3T3芯 | 106
| 0 (0) |
| pMX+STAT3-C蛋白 | 8 (4) | WT-STAT3型 | 106
| 0 (0) |
| pMX-核心 | 0 (0) | WT-STAT3/芯 | 104
| 110 (32) |
| pMX-核心+WT-STAT3 | 10 (4) | STAT3-C型 | 104
| 92 (26) |
| pMX-芯+STAT3-C | 20 (10) | STAT3-C/芯 | 104
| 222 (42) |
|
v-src型
| 96 (22) |
v-src型
| 10三
| 180 (34) |
从亲代NIH-3T3细胞（亲代；泳道1）、核心感染细胞（核心）（泳道2）和从软琼脂中分离的代表性克隆（STAT3+核心[泳道4]、STAT3-C[泳道5]和v-src型[lane 6]）和表达WT-STAT3的NIH-3T3转化子（lane 3），然后用所示抗体进行免疫印迹。
然后，我们直接比较了新建立的WT-STAT3/核心转化细胞系和STAT3-C转化细胞在软琼脂中的平板效率。WT-STAT3/核心细胞中每个被镀细胞形成的菌落数（电镀效率）与STAT3-C中的菌落数量相当(). 显性阴性STAT3腺病毒显著降低了WT-STAT3和核心的集落形成能力，但SOCS3病毒没有显著降低()从而表明组成性STAT3激活在软琼脂的集落形成潜能中起着重要作用。
接下来，测定用野生型STAT3转化的细胞和核心的致瘤性。当106将来自两个WT-STAT3/核心克隆的任何一个细胞皮下注射到裸鼠体内，2到4周内注射部位肿瘤明显。这些肿瘤与STAT3-C转化的细胞一样大(和A） ●●●●。福尔马林固定切片的苏木精和伊红染色显示，WT-STAT3/核心衍生的肿瘤细胞具有多个核仁、大细胞核和频繁的有丝分裂(B） ●●●●。与WT-Stat3/core或v-src型–衍生肿瘤。WT-STAT3/核衍生肿瘤细胞似乎与v-src型–衍生肿瘤比STAT3-C衍生肿瘤细胞(B） ●●●●。注射亲代NIH-3T3细胞或3T3核的小鼠从未发生肿瘤(). 对STAT3/核心肿瘤提取物的Western blot分析显示，STAT3和核心蛋白水平较高，因此生长中的肿瘤细胞保留了这两种蛋白（未发表的数据）。这些结果表明，通过核心蛋白关联或点突变，组成活性STAT3具有类似的致癌潜能。
表二：。
| 细胞系 | 肿瘤大小（cm） | 厘米三
|
|---|
| NIH-3T3 | ND（无损检测） | |
| NIH-3T3芯 | ND（无损检测） | |
| WT-STAT3型 | ND（无损检测） | |
| WT-STAT3/芯 | | |
| 克隆1 | 0.8 × 0.8 × 1.0 | 0.64 |
| 0.4 × 0.5 × 0.8 | 0.16 |
| 0.8 × 0.6 × 0.8 | 0.38 |
| 克隆2 | 1.8 × 1.5 × 1.5 | 4.05 |
| 1.6 × 1.2 × 1.2 | 2.34 |
| 1.2 × 1.0 × 1.0 | 1.20 |
| STAT3-C型 | 1.2 × 0.8 × 1.0 | 0.96 |
| 1.2 × 1.5 × 1.6 | 2.88 |
| 1.8 × 1.2 × 1.0 | 2.16 |
|
v-src型
| 3.0 × 4.0 × 2.5 | 30 |
WT-STAT3转化细胞和核心转染细胞的致瘤性。（A） 将WT-STAT3/core或STAT3-C转化细胞系注射到裸鼠体内，3周后拍摄小鼠照片。（B） WT-STAT3/岩芯、STAT3-C和v-src型-含肿瘤用苏木精和伊红染色，并在400倍放大镜下观察。
由Core/Stat3控制的转录事件，可能与转化和细胞生长有关。
为了检测组成活性STAT3/核心或STAT3-C下游促进肿瘤发生的事件，我们检测了分别参与细胞周期进展和抗凋亡的cyclin-D1和Bcl-XL的表达，以及STAT3的直接靶基因(8). 我们还检测了由STAT3诱导的SOCS3(32,33). 如所示STAT3-C、WT-STAT3/core转化的细胞中cyclin D1和Bcl-XL的浓度急剧增加v-src型然而，由于非转化NIH-3T3/核心细胞也表达高水平的cyclin D和Bcl-XL，这两个STAT3靶基因可能在快速增殖中发挥重要作用()，但不足以进行细胞转化。识别直接参与肿瘤发生的新STAT3靶基因将非常重要。
我们还观察到在表达核心蛋白的细胞中SOCS3的表达升高(). 这与之前的报告一致，表明SOCS3的表达受STAT3调控。此前，据报道HCV基因组表达通过未知机制抑制干扰素-STAT1信号传导(34). SOCS3上调可能是干扰素信号通路抑制的机制之一(35)，使HCV感染细胞具有干扰素抵抗力。
讨论
在过去几年中，积累的数据表明，人类肿瘤样本中含有组分激活的STAT3。人工创造的功能获得突变体STAT3，STAT3-C，清楚地证明了STAT3的致瘤潜力。迄今为止，在人类肿瘤中未发现STAT3基因的活性突变。另一方面，有大量描述性证据表明核心蛋白与细胞转化有关，但其机制尚未阐明。在我们的研究中，我们注意到丙型肝炎病毒核心蛋白和STAT3的组成性激活之间存在着强烈的联系，这些事件会导致生长失调。由于我们目前的研究是使用细胞系和模型小鼠的一种病毒蛋白的过度表达系统，我们可能无法将我们的结论简单地应用于生理感染条件。因此，在未来的研究中，有必要使用感染HCV的人类标本来验证我们的假设。然而，我们的研究表明，HCV核心蛋白激活STAT3是体外转化的重要步骤。这将为HCC的发展机制和新的治疗靶点STAT3提供新的见解。
由于仅表达核心的细胞并不致瘤，因此对于HCC的出现，一些次要的“hit（s）”，如STAT3的表达升高或ras的激活(36)必须是恶性表型发展所必需的。细胞周期蛋白D1和Bcl-XL的上调可能解释了STAT3激活导致生长速度增加的原因，但这两个基因不足以进行细胞转化。我们目前正在通过WT-STAT3/core寻找在转化细胞中特异表达的基因，但不是仅在表达核心或WT-STAT3的细胞中。
Yoshikawa及其同事报告了证据，证明基因甲基化对SOCS1的失活以及随后细胞因子JAK/STAT（尤其是STAT3）信号通路的组成型激活是HCC生长的原因(37). 他们的研究以及我们的数据为STAT3在肝癌发展中的作用提供了新的见解。我们还观察到，dnSTAT3腺病毒可以抑制软琼脂中HepG2细胞的集落形成（未发表的数据）。这些数据强烈表明STAT3的组成性激活可能在软琼脂中HCC细胞集落形成中起重要作用。由于核心蛋白表达仅在HCV存在时发生（HCV基因组未整合到肝细胞DNA中），核心/STAT3相互作用可能是STAT3激活的初始步骤，然后SOCS-1表达的缺失接管了STAT3的组成激活。因此，由病毒或细胞癌基因诱导的STAT3的组成性激活或抑制因子的丢失为药物发现提供了一个有吸引力的靶点，具有诱导细胞死亡或抑制人类HCV介导的肝癌生长的潜力。我们的显性阴性STAT3腺病毒或一种抑制由Turkson等人开发的STAT3信号的最小肽(38)可以作为基因治疗或模拟肽药物设计的先导。此外，本实验提供了探索STAT3介导的转化基础的工具，包括寻找新的STAT3靶基因，并提高了人们对肿瘤中STAT3组成激活的分子机制的兴趣。此外，其他病毒癌蛋白或细胞原癌基因可能与STAT3合作，从而促成恶性转化。
由于核心蛋白没有酪氨酸激酶活性，它诱导STAT-3酪氨酸磷酸化的方式尚不清楚。我们的实验表明，核心的共表达导致磷酸化STAT3的去磷酸化率降低(C） ●●●●。因此，核心可能阻止磷酸酶进入STAT3，或者核心招募酪氨酸激酶到STAT3。然而，我们在带有抗核抗体的免疫沉淀物中未检测到酪氨酸激酶活性。因此，我们怀疑前一种情况更有可能发生。这可能提供一种新的方法来选择性地调节STAT3的激活，而不影响其他细胞因子信号通路。
虽然我们的pX-core Tg小鼠在皮肤和肌肉中发生肿瘤，但在这些Tg小鼠中HCC并不明显。此外，HCV结构蛋白Tg小鼠出现淋巴细胞自发局灶浸润、肝细胞坏死、变性和有丝分裂肝细胞改变灶，但到20个月龄时，肝脏没有肿瘤或癌性病变(39). 然而，Lerat等人报告称，在肝脏中表达完整病毒多聚蛋白RNA的老年雄性Tg小鼠中发生了肝细胞腺瘤或肝癌(40). 因此，结构和非结构蛋白的异源过表达系统可能比单个病毒蛋白的表达具有更强的致癌潜力。在这种情况下，有趣的是，与单独的核心蛋白相比，HCV全基因组表达更强烈地诱导STAT3磷酸化(E） ●●●●。STAT3的转录活性也受到HCV全基因组的强烈上调，而非仅受核心基因的上调（未公布的数据）。因此，STAT3的激活不仅可以通过核心蛋白的表达，也可以通过HCV整体蛋白的表达来实现。最近，人们注意到非结构HCV蛋白NS5A对STAT3的类似组成性激活(41). 在这种情况下，氧化应激和细胞内钙2+因为抗氧化剂或钙2+螯合剂消除了NS5A诱导的STAT3的激活。相反，我们观察到这些药物对核心介导的STAT3激活没有影响（未发表的数据），这表明STAT3可能由多种机制和不同的病毒蛋白激活。进一步的研究正在进行中，以确定STAT3激活、转化和HCV蛋白完全表达之间的关系。
致谢
我们感谢H.Ohgusu、M.Sasaki女士和Y.Kawabata女士提供了出色的技术援助，并感谢M.Ohara对手稿的评论。
这项工作得到了日本教育、科学、技术、体育和文化部、日本健康科学基金会、人类前沿科学计划、原口癌症研究纪念基金会和日本临床药理学研究基金会的部分资助。
脚注
*
本文中使用的缩写：DEN，二乙基亚硝胺；乙型肝炎病毒；肝细胞癌；丙型肝炎病毒；JAK、Janus激酶；白血病抑制因子；感染多重性；NF，核因子；增殖细胞核抗原；STAT、信号转导子和转录激活子；Tg，转基因。
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