与CD74结合引发MIF信号转导

MIF活性分析。

通过使用针对磷酸化p44/p42或总p44/p43的特异性抗体对细胞裂解物进行Western blotting来测量ERK-1/2（p44/p41）的MIF依赖性磷酸化(25). 通过对细胞质组蛋白相关DNA片段的免疫分析，评估MIF介导的去血清原代成纤维细胞凋亡抑制（Roche生化；参考文献10,26). 用可见分光光度法测定MIF的互变酶活性我-多巴色素甲酯作为底物(35). MIF诱导的PGE分泌₂用特异性ELISA测定培养基中的分泌(10). 通过修改先前公布的程序进行增殖研究(25). 人类Raji B细胞（美国型培养物收集）在RPMI 1640/10%FBS中培养，置于96 well板中（500–1000个细胞/孔），在RPMI/0.5%FBS中隔夜培养使其静止。清洗细胞，更换RPMI 1640/0.5%FBS，并按指示添加MIF和抗体。额外隔夜培养后，1μCi[^三H] 加入胸腺嘧啶核苷，12h后收获细胞。在DMEM/10%FBS中培养的正常人肺成纤维细胞（CCL210；美国型培养物收集）中检测成纤维细胞的有丝分裂，再悬浮在DMEM/2%血清中，与MIF和抗体一起接种到96个板（1500个细胞/孔）中，如图所示(图9C） ●●●●。以50μg/ml的最终浓度添加同位素对照或抗CD74单克隆抗体。隔夜加入[^三H] 胸腺嘧啶核苷转化为DNA。

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图9。

CD74介导MIF对CCL210人肺成纤维细胞ERK-1/2（p44/p42）磷酸化和增殖的刺激。（A） MIF刺激ERK-1/2（p44/p42）磷酸化，（B）抗CD74单克隆抗体抑制CCL210人肺成纤维细胞ERK-1/2磷酸化和增殖。在存在同型对照抗体（Con-Ab）或抗CD74单克隆抗体（克隆LN2）的情况下，用50 ng/ml MIF刺激成纤维细胞2.5小时。（C） 抗CD74抑制MIF诱导的人成纤维细胞增殖。在Con-Ab或抗CD74mAb（克隆LN2）存在的情况下，用50 ng/ml rMIF刺激细胞2.5小时，每种均为100μg/ml。增殖结果为三次测定的平均值±SD，代表至少三次单独的实验。在没有添加MIF的情况下，抗CD74抗体对肺成纤维细胞的增殖没有影响（未描述）。

流式细胞术、结合分析和共聚焦显微镜。

2.5 × 10⁵细胞/ml THP-1细胞在RPMI 1640/10%FBS中培养72h，加入或不加入1ng/ml IFN-γ⁵将细胞重新悬浮在0.1 ml pH 7.4的冰镇PBS中，并在4°C下与200 ng Alexa-488改良MIF（Alexa-MIF）孵育45分钟。将细胞清洗，保存在冰镇条件下，并进行流式细胞术分析（FACSCalibur™；Becton Dickinson）。在选定的实验中，THP-1单核细胞或COS-7转染体与Alexa-MIF和50μg/ml抗CD74单克隆抗体或同型对照单克隆抗体共同孵育（36）。

用激光扫描仪器（LSM 510型；卡尔蔡司显微成像公司）进行Alexa-MIF与细胞结合的共焦荧光显微镜检查。THP-1细胞用IFN-γ孵育72 h，用PBS/1%FBS洗涤三次，然后用2 ng/μl Alexa-MIF或Alexa-MIMF加上50 ng/μl未标记的MIF染色30 min（4℃）。对于双免疫荧光共聚焦显微镜，将IFN-γ处理的THP-1细胞重新悬浮在0.5 ml PBS、pH 7.4、20μg/ml Alexa-MIF和15μg/ml抗CD74单克隆抗体（克隆LN2）中，并在4°C下添加1h。在冰镇PBS/2%FBS中洗涤后，将细胞重新悬浮在0.1 ml PBS中，并在0°C下添加罗丹明结合的抗小鼠IgG 1 h。清洗样品，将其重新悬浮在0.2 ml PBS内，并将30μl等分样品添加到聚-我-赖氨酸涂层载玻片，然后是防褪色固定介质（Vectashide；Vector Laboratories）。图像通过变形强度分析软件（通用成像）进行分析。每幅图像的共定位百分比由两幅图像（Alexa-MIF/反CD74）共有的正像素数除以Alexa-MIMF图像中的正像素数得出(37). 对6个细胞进行分析，并通过配对Student t检验（自变量）确定其显著性。

cDNA文库构建、表达和细胞分类。

cDNA由poly（A）制备⁺将IFN-γ激活的THP-1单核细胞的RNA克隆到λZAP-CMV载体（Stratagene）中，并将2.5μg/ml的DNA等分试样转染到1.5×10⁷DEAE-右旋糖酐法检测COS-7细胞(38). 转染细胞在4°C下与Alexa-MIF孵育45分钟，清洗，阳性染色细胞用细胞分选仪分离（Moflo；DakoCytomation；reference36). 在典型运行中，1.5×10⁷以10的流速注射细胞/ml并进行分析⁴细胞/秒。回收率通常大于90%。使用Easy DNA试剂盒（Invitrogen）从分选的细胞中提取质粒DNA并转化为大肠杆菌XL-10黄金（Stratagene）用于进一步放大。纯化后的质粒DNA再次感染COS-7细胞，进行额外一轮的分选。经过四轮细胞分选后，随机选取250个单菌落，用PCR分析插入物大小。将插入片段>1.4kb的克隆分别转染到COS-7细胞中，并通过流式细胞术和共聚焦显微镜重新分析MIF结合活性。

蛋白质-蛋白质相互作用研究。

通过PCR产生全长和截短的重组CD74产物，并将其亚克隆到pcDNA 3.1/V5-HisTOPO表达载体（Invitrogen）中。DNA测序证实了载体构建的保真度。用于下拉实验(30)，全长（V5-CD74^1–232)，小时₂-终端–截断（V5-CD74^46–232)，截短膜（V5-CD74^1–72)，或将载体控制质粒转染到5×10⁵使用细胞毒素的COS-7细胞（Bio-Rad Laboratories）。48小时后收集细胞，用RIPA缓冲液（150 mM NaCl、1%NP-40、0.5%脱氧胆酸、0.1%SDS和50 mM Tris，pH 7.5）溶解，并在10000克将含有V5-His标记CD74蛋白的上清液与20μl Ni-NTA琼脂糖珠（QIAGEN）孵育20分钟，在4°C下摇晃1小时，然后通过离心收集珠。在pH 7.4的PBS中重新悬浮后，结合络合物与2μg/ml MIF在4°C下孵育4小时。将珠子旋转下来，再悬浮在1ml PBS中，然后再清洗四次。在4–20%聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE后，通过Western blotting分析沉淀络合物的CD74（V5表位）和MIF。

使用TNT网织红细胞裂解物系统（Promega）进行体外转录和翻译。全长CD74（1–232 aa）和三个截断的CD74结构（1–72 aa、1–109 aa和1–149 aa³⁵含硫氨基酸。的绑定³⁵根据TNT方案（Promega）的建议，通过在室温下培养3小时来评估S-标记CD74对固定化MIF的影响。

细胞表面MIF-结合蛋白的表达克隆。

在制备了MIF的标记生物活性形式并鉴定了MIF结合活性的细胞来源后，我们接下来使用IFN-γ-激活的THP-1单核细胞的cDNA在λZAP-CMV载体中构建了哺乳动物表达库。图书馆等分样品，总计1.5×10⁷将重组体转染到COS-7细胞中，我们之前已经建立了该细胞，以显示MIF的最小可检测结合活性（未发表的数据），并通过流式细胞术分析转染体与Alexa-MIF的结合。通过高速细胞分选纯化阳性染色细胞组分，收集、扩增并再次感染cDNA克隆以进行额外的细胞分选(图3A） ●●●●。对阳性染色的分选细胞进行计数，发现MIF结合活性增加了400倍以上。经过四轮选择，在大肠杆菌随机选取250个克隆进行分析。我们对50个cDNA插入量大于1.4 kb的克隆进行了测序，发现10个克隆编码II类相关不变链CD74（CD74）的表面形式，CD74是一种31–41-kD的II型跨膜蛋白（42）。单个克隆的总长度不同，但每个克隆都是有意义的，编码一个完整的细胞外和跨膜结构域(图3B） ●●●●。

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图3。

通过表达克隆鉴定CD74作为MIF的细胞表面结合蛋白。（A） 通过荧光激活细胞分选显示MIF结合活性的COS-7细胞转染体进行富集。（B） CD74（35-kD亚型）的结构，以及10个具有MIF结合活性的代表性CD74 cDNA克隆中的3个。IC、TM和EC分别是细胞内、跨膜和细胞外结构域。M1和M17指替代翻译起始的两个位置(42).

MIF与CD74结合的结构验证。

为了验证CD74是MIF的细胞表面结合蛋白，我们分析了Alexa-MIF与转染CD74表达质粒或载体对照的COS-7细胞的结合。Alexa-MIF与表达CD74的COS-7细胞的结合被过量的未标记MIF（未公开的数据）和特异性针对蛋白胞外部分的抗CD74单克隆抗体所抑制(图4A） ●●●●。THP-1细胞的双色免疫荧光共聚焦显微镜显示MIF与CD74以时空特异性的方式共定位(图4B） ，通过变形图像分析计算共定位百分比为69.2±12.0（P=0.031，n个=6个单元格）。

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图4。

Alexa-MIF与CD74表达细胞结合的荧光分析。（A） 流式细胞术分析Alexa-MIF与CD74转染与对照载体转染的COS-7细胞（左）的结合，以及Alexa-MIF与抗CD74单克隆抗体（克隆LN2）孵育的CD74转导的COS-70细胞（右，con-Ab）的结合。抗CD74单克隆抗体LN2与蛋白质胞外COOH末端60个氨基酸内的表位反应(48). 以50μg/ml添加单克隆抗体，所示数据代表至少三个独立实验。（B） 用Alexa-MIF（左）和罗丹明标记的抗CD74单克隆抗体（中）双重染色的代表性THP-1细胞（IFN-γ-预处理）的共焦显微镜图像。带有黄色区域的合并图像表示MIF和CD74（右）的共定位。共定位百分比计算为69.2±12.0（P=0.0308，n个=6个单元格）。

接下来，我们通过在表达CD74的细胞中进行“下拉”实验，寻找CD74和MIF之间关联的生化证据。通过表达V5标记的全长CD74（V5-CD74）的细胞沉淀的蛋白质复合物的Western blotting检测MIF^1–232)，NH₂-末端截短的CD74（V5-CD74^46–232)，但不是缺少细胞外结构域的膜截断CD74（V5-CD74^1–72;图5A） ●●●●。[³⁵S] -由转录和翻译耦合的网织红细胞裂解物系统制备的CD74蛋白在体外也与MIF结合，CD74胞外结构域（残基109-149）内的40个氨基酸区域对MIF结合活性似乎很重要(图5B） ●●●●。

为了进一步验证CD74和MIF之间的显著结合作用，我们在大肠杆菌并纯化至含有膜截短胞外结构域（sCD74）的均质截短可溶性CD74蛋白^73–232)或细胞内+跨膜结构域（sCD74^1–72)，并通过敏感的（双抗体）夹心ELISA系统测试其抑制MIF识别的能力。如所示图5C、 添加sCD74^73–232，但不是sCD74^1–72，以剂量依赖的方式抑制MIF检测。

MIF与CD74的实时结合分析（BIAcore分析）。

我们通过表面等离子体共振测定了MIF与CD74结合的平衡速率常数，这是一种通过改变生物特异性表面的折射率来测量实时结合相互作用的技术(41). 制备了光学生物传感器表面或蛋白质“芯片”，并对MIF（表面结合MIF）和sCD74之间的结合作用进行了BIA核心分析^73–232揭示了一个平衡离解常数K（K） _d日第9.0×10页⁻⁹M（M）(图6) . 在流动相和表面结合sCD74中使用MIF进行互补结合分析^73–232透露了一个K（K） _d日共2.3×10⁻¹⁰M（未发布数据）。考虑到循环中测量到的MIF纳米摩尔浓度，这些值在预期范围内(40,43). 然而，这些结合常数可能略低于体内的值，因为天然CD74是三聚体，而sCD74^73–232我们制备的结构缺乏与蛋白质三聚反应相关的跨膜结构域(44).

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图6。

通过实时表面等离子共振（BIAcore分析）测量MIF与CD74的高亲和力结合。sCD74（sCD74）之间相互作用的代表性生物传感器^73–232)和MIF传感器芯片，如材料和方法（顶部）所述。MIF与膜相关G蛋白βγ相互作用的控制（底部）。

我们感谢J.Yan和P.Anderson在荧光激活细胞分选方面的协助，感谢K.Curran和E.Suh在共焦显微镜方面的帮助，感谢J.Bernhagen、E.Lolis和M.Symons对手稿的仔细阅读。

这项工作得到了国家卫生研究院拨款1R01AI42310和1RO1AR49610、曼宁基金会（给R.Bucala）、威康信托基金会和爱尔兰科学基金会（对S.Donnelly）的支持。