《实验医学杂志》。2002年4月1日；195(7): 931–940.
病毒bcl-2在体内作用的鉴定
,1 ,1 ,2 ,三和1,2
Shivaprakash Gangappa公司
1华盛顿大学医学院病理学和免疫学系，密苏里州圣路易斯63110
琳达·F·范·戴克
1密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院病理学和免疫学系，邮编63110
特拉维斯·J·杰维特
2密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院分子微生物学系，邮编63110
塞缪尔·斯佩克
三佐治亚州亚特兰大埃默里大学耶基斯地区灵长类动物研究中心微生物学和免疫学部，邮编30329
赫伯特·W·维珍，IV
1密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院病理学和免疫学系，邮编63110
2密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院分子微生物学系，邮编63110
1密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院病理学和免疫学系，邮编63110
2密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院分子微生物学系，邮编63110
三佐治亚州亚特兰大埃默里大学耶基斯地区灵长类动物研究中心微生物学和免疫学部，邮编30329
2001年10月31日收到；2002年1月2日修订；2002年2月4日接受。
摘要
许多γ疱疹病毒编码候选癌基因，包括宿主bcl-2和细胞周期蛋白的同源物(v-bcl-2基因,v细胞周期蛋白)，但这些基因在感染过程中的生理作用尚不清楚。我们首次在任何病毒系统中显示了v-bcl-2基因一种γ疱疹病毒v-bcl-2基因对于有效地从潜伏感染中体内外重新激活，以及对于免疫功能低下（干扰素[IFN]-γ）慢性感染期间的持续复制和毒性至关重要−/−)老鼠。这个v细胞周期蛋白对于发病机制的相同阶段也是至关重要的。引人注目的是v-bcl-2基因和v细胞周期蛋白这些基因对慢性感染很重要，对于细胞培养中的病毒复制、体内急性感染期间的病毒复制，潜在感染的建立，或急性感染时的毒力都不是必需的。我们的结论是v-bcl-2基因和v细胞周期蛋白在潜伏性和持续性γ-疱疹病毒感染中具有重要作用，疱疹病毒编码的基因在慢性感染和疾病中具有特定作用，但在急性感染和疾病时不起作用。由于γ-疱疹病毒主要在慢性感染期间引起人类疾病，这些慢性疾病基因可能是治疗干预的重要靶点。
关键词：病毒基因、病毒潜伏期、再激活、持续复制、慢性感染
介绍
细胞周期进展和凋亡的调节对病毒感染的许多方面都至关重要，尤其是对腺病毒、多瘤病毒、乳头瘤病毒和γ疱疹病毒等致癌DNA病毒。腺病毒、多瘤病毒和乳头瘤病毒以pRb和p53的功能为靶点，以调节细胞功能，如细胞周期和凋亡，从而产生包括肿瘤发生在内的重大后果(1——4). 致癌γ疱疹病毒通过表达多种基因来操纵细胞功能的相同方面，包括v-bcl-2基因和v细胞周期蛋白虽然这些基因明确调控细胞生理学的重要方面，但这些基因在感染期间的生理作用尚不清楚。
v-bcl-2基因基因由致癌γ疱疹病毒编码，包括人类γ疱疹病毒EBV和卡波西肉瘤疱疹病毒（KSHV），*灵长类γ疱疹病毒赛米里疱疹病毒（HVS）和密切相关的小鼠γ疱疹病毒68（γHV68）(5——10). 腺病毒和非洲猪瘟病毒也编码抗凋亡的v-bcl-2蛋白(11——16). 在体内的作用v-bcl-2基因基因从未被定义。然而，由于γ-疱疹病毒v-bcl-2蛋白的瞬时表达对培养细胞具有抗凋亡作用，因此这些蛋白抑制凋亡的能力是明确的(6——10). EBV汽车v-bcl-2基因已经构建了突变体，但在原代人类B细胞的永生化中没有可检测的表型(17). 这种表型的缺乏表明v-bcl-2基因基因可能在感染中发挥作用，而这种作用只能通过体内实验来检测。
KSHV、HVS和γHV68在γ疱疹病毒感染和疾病中对细胞周期进程的调节作用一致v细胞周期蛋白，EBV调节宿主细胞周期蛋白分子的表达(5,18——25). 确定体内的作用v细胞周期蛋白我们对γHV68进行了表征v细胞周期蛋白突变体。我们发现γHV68v-细胞周期蛋白在转基因小鼠中表达时致癌(26)，并且对于病毒潜伏期的有效体外再激活是必需的，但对于急性感染期间野生型小鼠的病毒复制不是必需的(18,27). The role of thev细胞周期蛋白在持续复制和慢性病方面尚未进行评估。
在本研究中，我们使用功能丧失突变来评估v-bcl-2基因γHV68体内感染的基因。由于在感染乳头状瘤病毒、多瘤病毒和腺病毒期间，细胞周期和凋亡的调节密切相关，因此我们比较了v-bcl-2基因和v细胞周期蛋白突变体。我们发现，这两个基因在急性感染期间都不起重要作用，但对于潜伏期、持续复制和慢性感染期间的疾病的体外再激活都很重要。
材料和方法
病毒和组织培养。
γHV68克隆WUMS（ATCC VR1465）在NIH 3T12细胞或BALB/c或C57Bl/6小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中传代、生长和滴度(18,28). 病毒库由感染多重性（MOI）=0.05时感染的NIH 3T12细胞生成，并以50%的细胞病变效应（CPE）收获(18).
同源重组产生突变体γHV68。
靶向质粒的亲本基因组亚克隆包含荔枝38（pL3700；参考文献5和18). 使用PCR和引物产生pL3700-v-bcl-2.Stop1突变体靶向质粒，引物剪切70bp（103641至103711），插入9bp，5'CTCGAG公司T型AG公司3′，包括XhoI位点（带下划线）和帧内终止密码子（粗体）。对于pL3700-v-bcl-2.Stop2，引物插入7 bp，5′AGC公司标签C类3′，包括基因组坐标103450处的NheI位点（下划线）和终止密码子（粗体）。这个v-bcl-2基因用v-cyclin转染NIH 3T12细胞产生突变病毒。LacZ病毒基因组DNA（1.5μg）和pL3700-v-bcl-2突变质粒（1.5μg）(18,29). 用X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）染色后，通过白色斑块形态纯化重组病毒(18). 这个v-细胞周期蛋白标记物拯救病毒（v-cyclin.MR）已在前面描述过(18). 通过Southern blot和Western blot分析对菌斑纯化（三轮）病毒株进行了表征(18,29).
小鼠、感染和器官收获。
重组激活基因（RAG）-1−/−（杰克逊实验室；002096）和干扰素-γ−/−根据所有联邦和大学政策，在华盛顿大学医学院饲养C57Bl/6背景（B6）的小鼠（杰克逊实验室；002287）。C57Bl/6J（B6）小鼠购自杰克逊实验室。γ干扰素受体缺陷（IFNγR−/−)129只小鼠来自瑞士洛桑瑞士实验癌症研究所Michel Aguet(30). 除非另有说明，否则小鼠的年龄和性别匹配，在7至10周龄之间使用，并感染10、10三、或106在0.5 ml完整DMEM中腹腔注射γHV68的PFU(18,29). CD-1泌乳小鼠的幼崽（12日龄）为查尔斯·里弗实验室培育的CD-1远交系哺乳小鼠，幼崽在脑内感染了稀释在10μl完整DMEM中的病毒。在斑块分析之前，将滴度器官在−80°C下冷冻在1 ml DMEM中(18,29). 用10 ml DMEM腹腔灌洗收集腹膜细胞(31). 为了评估大弹性动脉中的炎症疾病，在死亡或牺牲IFNγR时采集心脏和主动脉根部−/−小鼠动脉炎病变的发生率和严重程度分析(32,33).
携带γHV68基因组的细胞的定量。
携带γHV68基因组的细胞的频率是通过限制稀释巢式PCR方法测定的，该方法可以扩增具有单拷贝敏感性的γHV68基因50序列(31,34). 简言之，将腹膜细胞和脾细胞在−80°C的10%二甲基亚砜中冷冻，解冻，计数，在等渗缓冲液中再次悬浮，并连续稀释成96 well PCR板。添加未感染的NIH 3T12细胞，使每个孔含有10个4细胞。然后用蛋白酶K溶解细胞并进行巢式PCR(31,34). 每个细胞稀释液分析10个PCR反应，每个实验每个样品分析6个稀释液。每个实验中的对照反应包括未感染细胞（6个反应/板）或含有10个、1个或0.1个质粒DNA拷贝的细胞（p巴姆HIN）包含目标序列（每板6个反应）。在本文报告的试验中，没有出现假阳性PCR反应，所有试验都表明质粒DNA的敏感性约为一拷贝，在89、29和3%的所有反应中，反应包含10、1或0.1拷贝的质粒DNA阳性。
体内外延迟再激活。
使用限制稀释再活化试验测定了体外潜伏期细胞再活化的频率(28,34). 简单地说，在感染后16、28或42天采集腹膜细胞和脾细胞，并进行连续两倍稀释（从4×10开始4腹膜细胞和10596周板中MEF单层上的脾细胞。21天后，Wells在显微镜下对病毒性CPE进行评分。当在高细胞数下难以识别CPE时，将微孔替换到新鲜MEF上，并对CPE进行评估。每个稀释液镀24个孔，每个样品镀12个稀释液。通过电镀经过机械破坏的平行细胞样品，检测组织中的预成型病毒。机械破坏不会使病毒失活，但会杀死99%以上的细胞，因此以这种方式处理的样品检测到的是预先形成的病毒，而不是潜伏期中病毒的重新激活(28,31,34).
统计方法。
使用GraphPad Prism软件（GraphPad-software）分析所有数据。使用非参数Mann-Whitney对滴度数据进行统计分析t吨测试。根据泊松分布，从细胞数量中获得频率，63%的微孔在病毒活化或病毒基因组存在方面均为阳性。对数据进行非线性回归分析，以获得每个极限稀释分析的单细胞频率。通过配对统计分析再激活和基因组阳性细胞的频率t吨测试。使用χ-平方检验和Fisher精确检验比较动脉炎发病率的变化（得出了可比较的结果）。
结果
γHV68 v-bcl-2基因突变病毒的产生。
要确定v-bcl-2基因在病毒感染中，我们构建了四个γHV68v-bcl-2基因突变体。γHV68 v-bcl-2 ORF（M11原始名称）跨度513bp，位于v细胞周期蛋白基因（ORF72）和ORF73(A） ●●●●。在不同bcl-2家族成员之间保守的四个公认的bcl-2同源结构域（BH结构域；BH1-BH4）中，预测的γHV68-v-bcl-2蛋白具有可识别的BH1样结构域，但缺乏明确的BH2、BH3或BH4结构域(5——7). γHV68 v-bcl-2也与bcl-2和v-bcl-1蛋白共享一个疏水性COOH末端结构域(5——10). 假设蛋白质保守区的功能重要性，我们构建了两个γHV68突变体，在v-bcl-2 ORF（v-bcl-2.Stop1，v-bcl-1.Stop2）中有终止密码子和移码突变，其中BH1结构域和COOH末端疏水结构域都不应翻译(). Stop1突变删除预测的BH1结构域，并在预测的171个氨基酸v-bcl-2的76个氨基酸后插入一个终止密码子(B） ●●●●。v-bcl-2。Stop2包含一个突变，在v-bcl-2的10个氨基酸后插入一个终止密码子和移码突变(B） ●●●●。我们生成了每个结构体的两个独立克隆，分别表示为A和B。v-bcl-2、Stop1A和1B以及v-bcl-2的基因组结构通过Southern blot分析得到确认(C） ●●●●。Western blot分析表明，v-bcl-2阻断病毒在溶血感染的3T12成纤维细胞中正常表达v-cyclin(D） ●●●●。
v-bcl-2的基因组结构。阻止突变病毒。（A） γHV68基因组编码区示意图v-bcl-2基因基因（M11 ORF；基因组坐标103418–103930）（参考5)，结构v-bcl-2基因突变病毒与v-bcl-2基因区域Southern杂交探针（基因组坐标101654–105377）（参考5). v-cyclin中ORF72内的阴影区域。LacZ病毒代表102704 bp和103179 bp之间的LacZ盒插入（参考文献18). v-cyclin中M11 ORF中的交叉阴影区。LacZ表示v-bcl-2.Stop1中删除的M11 ORF部分。（B） v-bcl-2 ORF的示意图显示了v-bcl-2 ORF中保守的BH1结构域的位置以及Stop1和Stop2突变位点。阴影区域是预测要转换的ORF部分。（C） wtγHV68，v-bcl-2.Stop1和Stop2突变体，v-cyclin的Southern分析。LacZ和v-cyclin。MR病毒。用XhoI和BamHI（1-5道）或NheI和Bam HI（6-10道）消化所示病毒纯化的基因组病毒DNA（1μg），并用v-bcl-2区域探针（A；参考18和29）。XhoI和BamHI消化物的预期片段大小：泳道1/wtγHV68，5.2kb；泳道2/v-cyclin。LacZ突变体，3.8kb和1.1kb；车道3/v-bcl-2.Stop1A突变，3.3和1.9 kb；车道4/v-bcl-2.Stop1B突变体，3.3和1.9 kb；第5车道/v-cyclin。MR，5.2 kb。NheI和BamHI消化液的预期碎片大小：6道/wtγHV68，5.2 kb；车道7/v-cyclin-LacZ突变体，3.8 kb和1.5 kb；车道8/v-bcl-2.Stop2A突变体，3.5和1.7 kb；车道9/v-bcl-2.Stop2B突变体，3.5和1.7 kb；10车道/v-cyclin。先生；5.2 kb。（D） wtγHV68、v-bcl-2.Stop1和Stop2突变体v-cyclin的免疫印迹分析。LacZ或v-cyclin。MR病毒感染NIH 3T12细胞裂解物检测v-cyclin和β-actin蛋白的表达。
As v-bcl-2.Stop病毒来源于γHV68突变的v-cyclin。我们将突变病毒与野生型γHV68（wtγHV68）和v-cyclin进行了比较。MR是一种病毒，其中含有v-cyclin。使用wt病毒序列拯救了LacZ突变(18). 为了明确将我们报告的表型映射到v-bcl-2基因，我们对两个独立产生的病毒突变进行了表征，其中每个突变都包含v-bcl-1基因中的两个不同突变。使用两个独立的分离株将表型映射到疱疹病毒基因是一种公认的方法(35——37).
v-bcl-2在急性复制中无作用。
我们首先测试了γHV68v-bcl-2基因在培养细胞或急性感染的wt B6或免疫受损的IFN-γ中进行病毒复制需要−/−背景为B6的老鼠。正如EBV研究预测的那样v-bcl-2基因突变体(17)，γHV68 v-bcl-2.Stop1和v-bcl-2.Stop2在单级和多级培养条件下在培养细胞中均能正常生长() .v-bcl-2基因通过斑块分析测定，感染后4或9天，wt B6小鼠的脾脏和肝脏中也复制了突变体以及wtγHV68(C、 左侧面板）。同样v-bcl-2基因γ-干扰素急性感染过程中的突变−/−与wtγHV68的生长无法区分(C、 右侧面板）。这些数据表明v-bcl-2基因在急性感染期间，无论是wt B6还是免疫受损的IFN-γ，对复制都不是必需的−/−老鼠。我们之前已经证明v细胞周期蛋白野生型小鼠急性感染期间不需要复制(18). 我们证实了这一发现，并进一步表明v-cyclin与v-bcl-2基因，对IFN-γ的复制不是必需的−/−老鼠(C、 右侧面板）。而wtγHV68和v-cyclin的滴度相差1.8倍。B6小鼠第9天的MR和v-cyclin之间的2.4倍差异。MR和v-cyclin。在第4天停止IFN-γ−/−小鼠脾脏达到统计差异，这种微小差异的生物学意义在滴度上尚不清楚，并不影响我们关于v-bcl-2突变体的结论。
γHV68v-bcl-2基因突变病毒在培养细胞和小鼠急性感染期间生长类似wtγHV68。NIH 3T12细胞每细胞感染5.0（A）或0.05（B）PFU病毒，并在指定时间测定病毒滴度。数据来自两个实验（平均值±SEM）。（C） B6（左面板）和IFN-γ在脾脏和肝脏中的病毒滴度−/−（右面板）小鼠腹腔感染10次后4和9天6病毒PFU。数据来自两个单独的实验，每个时间点/实验共有五只小鼠（平均值±SEM）。脾脏中的病毒滴度具有统计学意义（*），如下所示。对于B6小鼠，第9天脾脏；wtγHV68与v-cyclin的比较。MR相差1.8倍，P（P）= 0.03. 对于IFN-γ−/−小鼠，第4天脾脏；v-cyclin。MR与v-cyclin的比较。停止，2.4倍的差异，P（P）= 0.001.
v-bcl-2对从潜伏期到体内再激活很重要，但对潜伏期的建立不重要。
鉴于缺乏v-bcl-2基因在急性感染期间，我们将注意力转向慢性感染的参数。我们研究了v-bcl-2基因建立潜伏期（病毒基因组在细胞内稳定携带，无主动复制）和潜伏期的体外再激活。感染后16天，感染性γHV68从wt B6小鼠的脾和腹膜细胞中清除，并建立潜伏期(18,28,29,32,34). γHV68v-bcl-2基因自B6小鼠感染wtγHV68、v-cyclin后16或42天采集脾细胞（数据未显示）和腹膜细胞后，无需确定潜伏期。MR或v-bcl-2。含有与病毒基因组承载细胞相同频率的终止突变(A） ●●●●。尽管潜伏期正常，没有生产性感染B、 v-bcl-2。与wtγHV68或v-cyclin相比，停止突变体激活效率低4-5倍。感染后第16天和第42天，MR病毒在腹膜渗出细胞（PEC）中，但不在脾脏中（数据未显示）(B） ●●●●。这种病毒表型与v细胞周期蛋白突变体也无法有效地从延迟中重新激活(18,27)这表明，细胞凋亡和细胞周期的调节是从潜伏状态体外再激活的关键。
v-bcl-2基因突变体正常建立潜伏期，但在体外培养过程中未能有效激活。B6小鼠感染了10只6在感染后16或42天采集病毒和腹膜细胞的PFU，以定量潜伏感染细胞的频率（A）和潜伏期细胞重新激活的频率（B）。数据表示使用两个独立的突变菌株（平均值±SEM）进行的两到五个单独实验的结果，每个实验都包含来自五只小鼠的细胞。在第16天和第42天，wtγHV68与v-bcl-2、Stop1和v-cyclin之间的基因组阳性细胞频率差异无统计学意义。MR与v-bcl-2.停止2。与wtγHV68和v-cyclin相比，第16天（A和B，左侧面板），两个v-bcl-2停止突变体的体外再激活频率降低。MR具有统计学意义，如下所示：v-bcl-2.Stop1与wtγHV68，P（P）= 0.006; v-bcl-2.Stop2与wtγ，P（P）= 0.005; v-bcl-2.Stop1与v-cyclin的比较。先生，P（P）= 0.013; v-bcl-2.Stop2与v-cyclin的比较。先生，P（P）= 0.010. 42 d时（A和B，右侧面板），与wtγHV68和v-cyclin相比，两个v-bcl-2停止突变体的体外再激活频率降低。MR具有统计学意义，如下所示：v-bcl-2.Stop1与wtγHV68，P（P）=0.004；v-bcl-2.Stop2与wtγ，P（P）= 0.005; v-bcl-2.Stop1与v-cyclin的比较。先生，P（P）= 0.006; v-bcl-2.Stop2与v-cyclin的比较。先生，P（P）= 0.009.
这个γHV68 v-bcl-2和v-cyclin是免疫缺陷宿主中病毒持续复制所必需的。
γ-疱疹病毒的持续复制可能导致免疫缺陷宿主的疾病以及病毒在宿主之间的传播。与以前的报告一致(18,29)，我们没有检测到wtγHV68或v-bcl-2的持续复制。在感染后16和42天阻止正常小鼠脾脏（数据未显示）或腹膜细胞中的病毒(B、 打开符号）。然而，wtγHV68在IFN-γ的腹膜细胞中持续复制−/−感染后至少6周的小鼠（未公布的数据），提供了一个模型来确定v-bcl-2基因在持久复制中具有角色。一种情况是，持久复制是由于延迟导致的重新激活。因为γHV68v细胞周期蛋白突变体与v-bcl-2基因突变体（以上）：尽管潜伏期建立正常，但潜伏期激活减少的表型(18)，我们分析了v-bcl-2基因和v细胞周期蛋白突变体在干扰素-γ中持续复制的能力−/−老鼠。
与免疫活性B6小鼠的研究结果一致()，v-bcl-2.Stop1和v-bcl-2.Stop2显示IFN-γ腹膜细胞的再激活频率降低了4-5倍−/−小鼠与wtγHV68和v-cyclin进行比较。MR病毒(，左侧面板）。体外再激活减少并不是因为携带病毒基因组的细胞数量减少，因为来自IFN-γ的PEC−/−感染v-cyclin的小鼠。MR、v-bcl-2、Stop或v-cyclin。含有基因组阳性细胞相似频率的停止突变(D） ●●●●。这个v细胞周期蛋白也需要有效的离体再激活来自IFN-γ的细胞潜伏−/−老鼠(，左侧面板）。
v-bcl-2基因和v细胞周期蛋白对IFN-γ中γHV68的持续复制至关重要−/−老鼠。干扰素-γ−/−小鼠感染了10只6在感染后16、28或42天采集病毒和腹膜细胞的PFU，以定量细胞重新激活病毒的频率（A–C，左面板）、持续病毒的数量（A–C，右面板）和潜在感染细胞的频率（d）。数据表示两到三个实验的结果（平均值±SEM），每个实验都包含来自五只小鼠的细胞。由于在第42天的时间点，v-cyclin之间没有显著差异。观察到MR和wtγHV68，只有v-cyclin。对第16天和第28天的时间点以及两个独立的v-bcl-2菌株Stop1和v-cyclin进行MR检查。停止。对于第42天的实验，v-bcl-2基因突变感染包括两个v-bcl-2.Stop1实验和一个v-bcl-2.Stop2实验。同样，v细胞周期蛋白突变感染包括两个v细胞周期蛋白实验。停下来用v-cyclin做一个实验。第42天时间点的LacZ。体外再激活和持续生产性复制的频率降低v-bcl-2基因突变体和v细胞周期蛋白与wtγHV68和v-cyclin相比的突变。MR具有统计学意义，如下所示：第16天体外再激活，v-bcl-2。Stop1与v-cyclin。先生，P（P）=0.007；v-cyclin。停止与v-cyclin的比较。先生，P（P）= 0.003; 对于第16天的持续生产性复制，v-bcl-2.Stop1与v-cyclin的比较。先生，P（P）= 0.014; v-cyclin。停止与v-cyclin。先生，P（P）=0.011，对于第28天的体外再激活，v-bcl-2.Stop1与v-cyclin。先生，P（P）=0.0009，v-cyclin。停止与v-cyclin的比较。先生，P（P）= 0.0001; 对于第28天的持续生产性复制，v-bcl-2.Stop1与v-cyclin的比较。先生，P（P）=0.0326，v-cyclin。停止与v-cyclin的比较。先生，P（P）=0.028，第42天体外再激活，v-bcl-2基因突变体与wtγHV68，P（P）= 0.0008,v-bcl-2基因突变体与v-cyclin的比较。先生，P（P）= 0.0003,v细胞周期蛋白突变体与wtγHV68，P（P）= 0.0001,v细胞周期蛋白突变体与v-cyclin的比较。先生，P（P）= 0.0001; 对于第42天的持久生产复制，v-bcl-2基因突变体对wtγHV68，P（P）= 0.027,v-bcl-2基因突变体与v-cyclin的比较。先生，P（P）= 0.008,v细胞周期蛋白突变体与wtγHV68，P（P）= 0.032,v-细胞周期蛋白突变体与v-cyclin。先生，P（P）= 0.011. v-cyclin在第16天和第42天的基因组阳性细胞频率差异在统计学上不显著。MR与v-bcl-2、Stop1和v-cyclin的比较。MR与v-cyclin的比较。停止。
有趣的是，既没有v-bcl-2停止，也没有v-cyclin。终止突变体在IFN-γ中表现出显著的持续复制−/−老鼠(，右侧面板）。检测到wtγHV68和对照病毒v-cyclin持续复制。MR。这些结果证明了这两个方面的要求v-bcl-2基因和v细胞周期蛋白免疫受损宿主持续复制的基因。这与这些基因在wt或IFN-γ的急性复制中缺乏作用形成鲜明对比−/−老鼠(). 这表明急性复制和持续复制需要不同的病毒基因，强烈主张急性和持续γ-疱疹病毒复制是基因不同的过程。
v-bcl-2和v-cyclin对致死性慢性病而非致死性急性病的需求。
迄今为止提供的数据表明v-bcl-2基因和v细胞周期蛋白慢性但非急性感染。如果这种区别在生理上很重要，那么这些基因应该是慢性病模型中的毒力所必需的，而不是急性感染时的毒力。慢性感染IFN-γ−/−和干扰素γR−/−小鼠出现致命的持续感染和严重的大血管血管炎(32). 血管炎是由于大弹性动脉免疫特权介质的平滑肌细胞持续复制所致(33). 与上述数据一致，证明了v-细胞周期蛋白和v-bcl-2基因IFN-γ持续复制−/−老鼠，v-bcl-2基因突变体和v细胞周期蛋白突变病毒杀死干扰素γR−/−慢性感染期间小鼠的效率低于wt病毒(A） ●●●●。动脉炎病变的病理学评估显示病变发生率有显著变化（v-cyclin.MR[14/19=74%]与v-bcl-2。Stop[10/35=28%]，P（P）= 0.0002; v-细胞周期蛋白。MR与v-cyclin的比较。停止[7/20=35%]，P（P）=0.001），但在v-cyclin之间主动脉病变的严重程度不存在差异。先生，v-bcl-2基因突变体，以及v细胞周期蛋白变异病毒感染小鼠（数据未显示）。
v-bcl-2基因和v细胞周期蛋白对于致命的慢性病是必需的，但对于致命的急性病则不是必需的。（A） 干扰素γR−/−小鼠腹腔感染v-cyclin。MR、v-bcl-2、Stop或v-cyclin。在感染后90天内停止突变病毒并观察其致死率。感染v-bcl-2基因变异病毒或v-cyclin。与v-cyclin相比阻止变异病毒。MR病毒的统计学意义如下：v-bcl-2。停药与v-cyclin。先生，P（P）= 0.0003; v-cyclin。停止与v型气缸的比较。先生，P（P）= 0.012. （B） RAG-1的生存−/−腹腔感染106, 10三或10个PFU病毒。数据来自两个实验(n个=小鼠数量）。（C和D）脑内感染v-cyclin的CD1小鼠（3-4周龄）的存活率。MR、v-bcl-2、Stop 1或v-cyclin。在感染后21天内停止病毒并观察其致死情况。数据表示每点20–30只小鼠，来自2–3个独立实验。P（P）=NS表示所示组之间没有统计差异。
我们注意到，在IFN-γ的慢性感染过程中，v-bcl-2和v-cyclin缺陷病毒的表型−/−与这些病毒在正常和IFN-γ急性感染期间生长时缺乏表型形成对比−/−老鼠(C） ●●●●。我们考虑了使用IFN-γ的急性感染数据的假设−/−与IFNγR的慢性感染数据不可比−/−老鼠。然而，IFN-γ的表型−/−小鼠与干扰素γR−/−使用许多不同的感染途径和剂量的wtγHV68也很相似(32,38). 确定v-bcl-2基因和v细胞周期蛋白突变病毒对慢性病具有特异性，我们在急性感染期间用另外两种毒力模型测试了突变病毒。wtγHV68和v-bcl-2的毒力在RAG-1中具有可比性−/−感染10，10的小鼠三、或106PFU（功率因数校正装置）(B） ●●●●。我们之前展示过v细胞周期蛋白突变γHV68在同一模型中没有衰减(18). 在断奶小鼠脑内注射γHV68也会导致急性致命性脑膜炎(39). 毒力v细胞周期蛋白和v-bcl-2基因这种致命性脑膜炎模型中的突变体与wtγHV68的突变体没有区别(). 因此v-bcl-2基因和v细胞周期蛋白在两种不同的急性病模型中未发现慢性病期间的突变病毒，这进一步支持了我们的结论v-bcl-2基因和v细胞周期蛋白是病毒基因，在慢性感染过程中具有重要的生理学和特异性作用。
讨论
我们在这里首次展示了γ-疱疹病毒v-bcl-2基因，如前所示v细胞周期蛋白是从潜伏期进行有效的体外再激活所必需的。抗凋亡和细胞周期调节蛋白在潜伏期体外再激活中的重要性表明，再激活过程需要细胞周期进展，并触发宿主或细胞凋亡途径，以防止再激活，除非病毒与抗凋亡分子发生对抗。
对于理解疱疹病毒如何引起疾病具有特别重要的意义，我们首次证明疱疹病毒具有基因(v-bcl-2基因和v细胞周期蛋白)对免疫功能低下的宿主的持续复制和慢性疾病很重要，但对急性复制和急性疾病不重要.这表明持久复制是一个与急性感染期间的复制在基因上不同的过程，并表明对持久复制重要的基因是关键的毒力决定因素。
v-bcl-2是有效的体外潜伏期再激活所必需的。
γHV68在包括巨噬细胞、树突状细胞和B细胞在内的多种细胞类型中建立潜伏期(28,31,40,41). 我们发现潜伏期的建立不需要v-bcl-2。在这方面，v-bcl-2基因与我们分析的其他γHV68基因类似，包括v细胞周期蛋白和M1级(18,29). 然而v-bcl-2基因突变导致病毒从潜伏感染细胞体内无效地重新激活。在这方面v-bcl-2基因基因类似于v细胞周期蛋白，但与M1级基因突变后的基因座M1级基因座提高体外再激活效率(18,29). 因此，γHV68包含增强和抑制体外再激活的基因，这表明潜伏期和体外再激活之间的平衡受到多个病毒基因的严格调控。的重要性v-bcl-2基因对于潜伏期和持续复制的体外再激活，与我们之前的证明一致，即v-bcl-2基因基因在潜在感染组织中被积极转录(42). 有可能使用不同的感染途径鉴定v-bcl-2突变体的其他表型。
为什么两者都是v-bcl-2基因和v-细胞周期蛋白对潜伏期的有效体外再激活很重要吗？我们推测潜在感染细胞处于静止状态0状态，并且体外再激活过程需要v细胞周期蛋白用于诱导细胞周期进展。在这种情况下v-bcl-2基因将阻止对体外再激活至关重要的病毒基因的表达或在体外再激活过程中起作用的促凋亡宿主基因诱导的凋亡。令人感兴趣的是，当KSHV v-cyclin过表达时，可以诱导细胞凋亡，并且这被KSHV v-bcl-2的共表达所阻断(43). 类似地，γHV68v-cyclin在转基因胸腺细胞中诱导细胞周期进程，并具有致癌作用，尽管会导致细胞凋亡增加(26). 因此，可能需要v-bcl-2来防止v-cyclin表达引起的凋亡反应。
v-bcl-2也可能阻止宿主蛋白诱导的细胞凋亡。例如，γHV68和HVS v-bcl-2在过度表达时可以阻断Fas和TNF-α介导的凋亡(6,44)EBV v-bcl-2能抑制颗粒酶介导的细胞凋亡(45). 后者尤其重要，因为穿孔素的缺乏（穿孔素是宿主颗粒酶诱导细胞凋亡的关键）导致潜在感染细胞的数量增加（未发表的数据）。重要的是要确定确切的宿主和病毒诱导凋亡的途径，这些途径被病毒基因组中的v-bcl-2表达所抑制，而不是在培养细胞中过度表达。可能v-bcl-2对阻断宿主蛋白和病毒蛋白诱导的凋亡至关重要。识别被v-bcl-2抑制的凋亡途径可能会导致γ疱疹病毒相关疾病的治疗，例如通过消融来增强这些途径v-bcl-2基因功能，可能阻止病毒重新激活或抑制持续复制。
体内急性和持续复制的不同遗传要求。
证明了v-bcl-2基因和v细胞周期蛋白对于免疫受损宿主的持续复制至关重要，但对于急性感染则不重要，将持续感染确定为体内疱疹病毒感染的一个不同基因阶段。因此，体内γ疱疹病毒感染具有以下实验上可区分的成分：急性复制、潜伏期建立、潜伏期维持、持续复制和潜伏期再激活。在持续复制而非急性感染期间复制过程中具有特殊功能的保守基因的存在表明，持续复制是疱疹病毒感染的重要生理组成部分。
持续复制很可能导致病毒在人群中传播。此外，有人认为持续复制可能有助于γ疱疹病毒的肿瘤发生(46). 因此，持续复制所必需的病毒基因可能也会导致肿瘤发生，即使它们不是独立致癌的。该假设预测，通过靶向对持续复制至关重要的基因的功能，即使这些基因在组织培养中的复制、急性感染期间的复制或可检测到的转化活性中没有作用，γ-疱疹病毒也可以阻止肿瘤的诱导。值得注意的是，迄今为止没有直接证据表明在正常主机中发生了持久复制。然而，在正常宿主中确实会发生间歇性的再激活，大量证据表明，识别裂解γHV68抗原的T细胞在潜伏期内持续受到刺激，这表明裂解病毒基因的表达，以及可能在当前检测不到的水平上的持续复制，确实发生在正常宿主(47——53).
有趣的是，有两个基因对体外有效再激活很重要(v细胞周期蛋白和v-bcl-2基因)对于免疫受损宿主的持续复制也很重要。这有力地支持了这样一种假设，即持久性病毒来源于再激活事件，而不是感染性病毒从一个裂解感染的细胞持续传播到下一个细胞。在这个模型中，持久性病毒将来自于再激活事件，而再激活衍生病毒的扩张受到免疫系统成分的限制。其中一个宿主因子是IFN-γ，它控制潜伏期、持续性和由于感染γ疱疹病毒γHV68而导致的慢性疾病(54; 未发表的数据）和γ疱疹病毒小鼠巨细胞病毒(32,38,55). 有效控制慢性γ-疱疹病毒感染可能最好的方法是同时阻断对重新激活、持续复制和增强免疫功能至关重要的基因的功能，例如对控制潜伏期和持续性的重新激活至关重要的IFN-γ。
致谢
我们还感谢H.W.Virgin、S.H.Speck、David Leib和Lynda Morrison实验室成员对本研究提出的建设性意见。Beth Levine、Scott A.Tibbetts和Joy T.Loh对手稿做出了有益的评论。
H.W.Virgin获得了美国癌症协会和美国国立卫生研究院的RPG-97-134-01-MBC赠款AI39616、CA74730和HL60090的支持。S.H.Speck得到了美国国立卫生研究院拨款CA43143、CA52004、CA58524、CA74730的支持。L.F.van Dyk得到了美国国立卫生研究院5T32 AI 07163的资助。
脚注
*
本文中使用的缩写：CPE，细胞病变效应；γHV68、γ疱疹病毒68；HVS、saimiri疱疹病毒；KSHV，卡波西肉瘤疱疹病毒；MEF，小鼠胚胎成纤维细胞；重组激活基因；wt，野生型。
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