中性鞘氨醇酶介导的神经酰胺在T细胞受体诱导的凋亡和有丝分裂原活化蛋白激酶介导的信号转导中的作用

脾T细胞纯化。

Balb/c小鼠的脾T细胞是通过B细胞和II类细胞的负缺失来分离的⁺细胞。B淋巴细胞和巨噬细胞被结合到微球和生物素化大鼠M5/114抗体的B220包裹，然后用结合到链霉亲和素的微球孵育。细胞通过MACS分离器中的MACS柱，并恢复流通。用FITC-结合的2C11抗体对回收的细胞进行染色，确定T细胞制剂的纯度为85–92%。

文化和激励条件。

对于TCR刺激，3DO和2B4细胞接种在4°C下涂有1μg/ml 2C11 Ab的平板上过夜。对于Fas刺激，细胞在室温下用1μg/ml抗鼠Fas Ab Jo2预培养30分钟，用培养基洗涤两次，然后接种在4℃下涂有5μg/ml抗仓鼠IgG的平板上隔夜。使用涂有1μg/ml H57 Ab的平板过夜刺激脾脏T细胞。为了协同刺激，将抗小鼠CD28 37.51 Ab以1:5000的稀释度从腹水中加入到溶液中。将Jurkat细胞培养在涂有5μg/ml抗人TCR Ab HIT3a的4°C平板上过夜。刺激前30分钟将FB1加入细胞培养物中。柔红霉素用于10μM。在图中所示的实验中。​图4，4在TCR刺激时，向细胞培养物中添加外源CM（10μM）、nSMase（0.1 U/ml）和CsA（100 nM）。

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图4

外源CM或细菌SMase重建IL-2生成和细胞死亡。用平板结合的抗CD3抗体刺激3DO细胞，有或没有FB1预培养。在TCR刺激时，如图所示添加外源CM（10μM）、bSMase（0.1 U/ml）和CsA（100 nM）。在刺激后12小时通过ELISA分析上清液中IL-2的产生（A）。在另一个实验中，在刺激后8小时测试细胞凋亡（B）。数据点表示三个独立实验±SE的平均值。

细胞死亡测定、IL-2测量和Northern Blot分析。

通过测量用碘化丙啶染色的分离细胞核的DNA含量来评估细胞死亡的百分比(25)。通过ELISA测定IL-2的产生(健赞)。通过Northern blot分析定量FasL和Nur77 mRNA的表达。每个泳道加载20μg从用2C11处理指定时间的细胞中分离的总RNA。以亲环素表达作为内部对照，使mRNA负载量标准化。

CM量化。

CM通过二酰甘油激酶测定进行定量。在与指示的刺激物孵育后，通过离心法造粒细胞，用冰镇PBS洗涤两次，并用氯仿/甲醇/1 N HCl萃取（100:100:1，vol/vol/vol）。将干燥样品重新悬浮在含有5 mM心磷脂（Avanti Polar Lipid）、1 mM二乙烯三胺五乙酸（DTPA；西格玛)，7.5%辛基-β-d日-吡喃葡萄糖苷(钙生物化学)，10 mM咪唑。在五次冻融循环后，通过向脂质悬浮液中添加100μl反应缓冲液（100 mM咪唑-HCl，pH 6.6，100 mM NaCl，25 mM MgCl）开始反应₂，和2 mM EGTA），20μl 20 mM二硫苏糖醇，19μl冷10 mM ATP，10μCi[γ-³²P] ATP（3000 Ci/mmol；杜邦-NEN)和10微升大肠杆菌二酰甘油激酶(钙生物化学)。在室温下1小时后，通过添加0.5 ml CHCl停止反应_三/中国_三OH/1 N HCl（100:100:1）和85μl PBS，pH 7.4。使用氯仿/丙酮/甲醇/乙酸/水（10:4:3:1）溶剂体系，通过硅胶60板（Whatman）上的薄层色谱分离100μl低有机相，并通过放射自显影术进行可视化。合并³²P通过闪烁计数定量。CM水平通过与已知量CM（III型CM；西格玛).

CM合成酶分析。

CM合成酶活性如前所述测定(26)。简言之，75×10⁶将细胞造粒，用冷PBS洗涤一次，并将其重新悬浮在300μl均质缓冲液中（25 mM Hepes，pH 7.4，5 mM EGTA，50 mM NaF，以及亮氨酸蛋白酶和大豆胰蛋白酶抑制剂各10μg/ml）。细胞均化，裂解液在800℃离心克5分钟。核后上清液在250000下离心克将微粒体膜颗粒重新悬浮在1ml均质缓冲液中30分钟。微粒体膜蛋白（75μg）在含有2 mM MgCl的1 ml反应混合物中培养₂，20mM Hepes（pH 7.4），20μM脱脂BSA(西格玛)，不同浓度（0.2–20μM）的二氢鞘氨醇（Biomol），70μM未标记的棕榈酰辅酶A（棕榈酰辅酶A；西格玛)和3.6μM（0.2μCi）[1-¹⁴C] 棕榈酰辅酶A（55 mCi/mmol；NEN生命科学产品）。通过添加棕榈酰CoA开始反应，在37°C下孵育1 h，然后通过使用2 ml氯仿/甲醇（1:2）提取脂质停止反应。去除、浓缩下相，并将其应用于硅胶60薄层色谱板。使用氯仿/甲醇/3.5N氢氧化铵（85:15:1）溶剂体系从游离放射性标记脂肪酸中分离出二氢甲酰胺，通过与CM标准混合的碘蒸气染色进行鉴定，并通过液体闪烁计数进行定量。

中性和酸性SMase的检测。

收获细胞，并用冰冷的PBS、100μM Na洗涤三次_三VO（旁白）₄温度为4°C。在100μl含有20 mM Tris-HCl、pH 7.5、2 mM EDTA、5 mM EGTA、1 mM钒酸钠、10 mMβ-甘油磷酸盐、1 mM-PMSF、5 mM-二硫苏糖醇、20μg/ml的裂解缓冲液中进行五次冷冻-解冻循环（在甲醇/干冰中），破坏细胞。将裂解液在1000℃下离心10分钟克在4℃下，上清液（核后匀浆）在100000℃下离心60分钟克温度为4°C。将所得颗粒（膜部分）重新悬浮在50μl裂解缓冲液中。将膜制剂在37°C下与¹⁴C-SM（1000000 dpm，10 nmol），在含有100 mM Tris-HCl，pH 7.5，5 mM MgCl的混合胶束分析中₂和0.1%Triton X-100（最终体积100μl）。通过添加800μl CHCl停止反应_三/中国_三COOH（2:1，vol/vol）和250μl水。通过液体闪烁计数测定放射性。为了测定aSMase活性，使用含有20 mM Tris-HCl、pH 7.5、2 mM EDTA、5 mM EGTA和1 mM PMSF的裂解缓冲液从细胞制备膜。所用的胶束分析包含100 mM醋酸钠、pH值5和0.1%Triton X-100。

SM量化。

在0.5μCi/ml（80 Ci/mmol）的存在下培养3DO细胞48小时[^三H] 氯化胆碱。用PBS冲洗标记后的细胞，以0.5×10的速度重新接种⁶RPMI中的细胞/ml，并休息2-4小时。然后对细胞进行各种处理。处理后，收集细胞并将细胞颗粒重新悬浮在3 ml氯仿/甲醇（1:2）中。使用标准布莱和戴尔萃取法回收脂类。将在真空下干燥的脂质重新悬浮在50–100μl氯仿中，并在薄层色谱板上进行斑点，然后在氯仿/甲醇/乙酸/水（50:30:8:5）中展开板。钢板上喷涂了En^三将标记的SM斑点刮入闪烁液中，并在闪烁计数器中计数。

人类nSMase的克隆和转染。

通过PCR从人胎肝（Invitrogen）的cDNA文库中提取人nSMase cDNA，并在pcDNA3.1载体（Invit罗gen）中克隆。该文库是用最近发表的人类nSMase序列设计的引物筛选的(27).

通过电穿孔50μg所示cDNA和1μg En，对Jurkat T细胞进行瞬时转染^三汉斯绿色荧光蛋白-N1（EGFP）；Clontech公司)。通过分析EGFP的百分比来监测转染效率⁺通过流式细胞术检测细胞。EGFP公司⁺使用贝克顿·迪金森FACStar™。

TCR触发诱导nSMase激活、SM水解和CM生成。

FB1对IL-2生成和细胞死亡的抑制，通过抑制CM合成酶干扰CM的从头合成，表明CM可能参与TCR信号的早期事件。因此，我们测试了TCR是否触发CM的产生。​图22A、 TCR刺激后细胞内CM浓度迅速增加。

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图2

TCR刺激可诱导nSMase激活、SM水解和细胞内CM水平升高。（A）TCR触发可诱导CM生成。（B） 柔红霉素（daunorubicin，daun.）增强的CM合成酶活性不受TCR刺激的影响。（C） TCR参与特异性激活nSMase而非aSMase（C，左），并诱导SM（D）水解。刺激Fas激活两种SMase（C，右）。（E） TCR交联还诱导Balb/c小鼠（左）、小鼠T细胞杂交瘤2B4（中）和人类T细胞克隆Jurkat（右）的脾T细胞中的nSMase活化。用抗CD28抗体刺激纯化的脾T细胞并不影响nSMase活性（左）。所提供的数据代表了至少三个独立实验。

CM由两种不同的途径产生：从头合成和SMases水解SM(37)。通过刺激CM合成酶从头合成CM与凋亡途径有关(38)。由于FB1已被证明抑制这种酶(38，29)，我们首先测试了TCR触发时CM的产生是否由CM合成酶的激活引起。如图所示。​图22B、 经TCR刺激后，CM合成酶活性没有增加。接下来，我们分析了TCR参与是否诱导了SMases的激活，SMases是通过刺激几种膜受体（包括神经生长因子受体（NGFR）、TNFR和Fas）诱导CM生成的酶(39)。已知SMase至少以两种形式存在，一种是Mg²⁺-具有中性最佳pH值（nSMase）和溶酶体酸性形式（aSMase(37)。触发TCR导致nSMase激活（图。​（图22C） ●●●●。这种激活是选择性的，因为Fas触发时容易刺激的aSMase不是由TCR诱导的（图。​（图22C） ●●●●。nSMase活化的时间过程与CM的产生以及nSMase-底物SM的水解平行（图。​（图2，2、A和D）。因此，TCR刺激后细胞内CM的快速增加依赖于nSMase的激活。

为了确定nSMase的激活是否是TCR参与的一般和特定结果，我们分析了其他T细胞类型中TCR和CD28分子触发后的nSMase活性。纯化的小鼠脾脏T细胞（图。​（图22E、 左侧），小鼠T细胞杂交瘤2B4（图。​（图22E、 中）和人T细胞克隆Jurkat（图。​（图22E、 右），均显示nSMase对TCR的刺激的激活。共刺激分子CD28特异的同型匹配抗体没有激活nSMase或改变纯化脾T细胞中该酶的TCR依赖性诱导（图。​（图22E） ●●●●。因此，在所有分析的T细胞类型中，nSMase都被TCR特异性激活。

FB1阻断TCR诱导的nSMase激活和CM生成。

尽管FB1被认为是CM合成酶的抑制剂(38，29)，我们的数据表明该毒素干扰TCR依赖的nSMase激活。因此，我们测量了TCR触发后的nSMase活性、CM和SM水平。我们发现FB1抑制该酶的激活，从而抑制SM水解和CM生成（图。​（图3，三，A–C）。相反，FB1不影响Fas诱导的aSMase激活（数据未显示）。因此，FB1通过直接或间接干扰nSMase激活来抑制TCR诱导的CM生成。

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图3

FB1干扰TCR诱导的nSMase激活。用FB1（100μM）预培养3DO细胞可阻断TCR诱导的nSMase（A）激活。因此，SM水解（B）和CM生成（C）也受到抑制。所示数据代表五个独立实验。

外源CM逆转FB1对TCR诱导的IL-2生成和凋亡的抑制作用。

总之，这些发现表明FB1通过抑制CM的产生而损害TCR信号。然而，这种毒素也可以抑制TCR导致IL-2产生、FasL上调以及细胞死亡所必需的其他途径。为了区分这两种可能性，我们使用bSMase或细胞可渗透CM类似物来重建细胞内CM水平。两种治疗均逆转了FB1的抑制作用，并恢复了TCR诱导的IL-2的产生（图。​（图44A） ●●●●。然而，当TCR信号被CsA（一种阻止活化T细胞转录因子核因子（NFAT）-c1去磷酸化和核移位的免疫抑制剂）抑制时，这两种化合物都不能重建IL-2的生成(40)。此外，C2 CM仅在信号被FB1而非CsA阻断时才恢复TCR诱导的PCD（图。​（图44B） ●●●●。

反义RNA灭活nSMase可阻断TCR诱导的IL-2生成。

为了直接测试nSMase在TCR信号传导中的作用，我们通过PCR克隆了最近鉴定和克隆的人类nSMase的cDNA编码(27)。Northern blot分析表明，nSMase在所有人类淋巴组织和测试细胞系中表达，包括脾、淋巴结、胸腺、外周血淋巴细胞、骨髓、胎肝和Jurkat T细胞（数据未显示）。然后将nSMase cDNA以正反义方向克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1中。Jurkat T细胞被转染有正反义结构体和编码EGFP的质粒。通过测量EGFP的百分比来确定转染效率⁺细胞，在60%到70%之间（数据未显示）。与我们的假设一致，通过转染正义结构过度表达nSMase导致抗原受体触发时IL-2的产生显著增加（图。​（图5）。5)。相反，与模拟转染细胞相比，反义结构的表达将IL-2的产生减少了约50%（图。​（图66A、 左）。为了准确测量反义载体的抑制作用，并确定nSMase反义RNA的表达是否有效地耗尽了nSmse蛋白的细胞池，我们通过筛选EGFP分离转染细胞⁺细胞。然后对分选的细胞进行TCR诱导的IL-2检测（图。​（图66A、 右）和CM生产（图。​（图66B） ●●●●。在这个实验环境中，反义nSMase几乎完全阻断了IL-2和CM的产生。综上所述，这些结果表明，CM是TCR的重要第二信使，能够为IL-2的产生和PCD提供充分的信号。

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图5

nSMase的过度表达增强了TCR诱导的IL-2分泌。与模拟转染（pcDNA3）或非转染（nt）对照组相比，转染有意义克隆的nSMase并用抗CD3ε抗体刺激的Jurkat T细胞产生的IL-2水平显著升高。右图中的数据代表三种不同的转染，误差条显示SEM。转染后12小时测量IL-2水平。

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图6

反义nSMase的过度表达抑制TCR诱导的CM生成和IL-2分泌。（A） 用反义nSMase表达质粒（反义）或空载体（pcDNA3）转染Jurkat T细胞，在EGFP分选前（左侧；TCR刺激后20 h测量）和分选后（右侧）检测IL-2的产生⁺细胞。在TCR刺激45分钟后，对分选的细胞进行CM生成分析（B）。数据点表示三个独立实验±SE的平均值。

我们感谢K.L.Holmes博士和S.Barbieri博士对细胞进行了分类，感谢R.H.Schwartz和L.Samelson对手稿的有益讨论和评论。