用于激活T细胞的Linker远端四酪氨酸的敲除突变阻断小鼠T细胞的发育

Western Blot分析。

胸腺细胞在Brij97裂解缓冲液（1%Brij97、25mM Tris-HCl、150mM NaCl、5mM EDTA和1倍完全蛋白酶抑制剂；罗氏）中裂解。用凝胶电泳分析清除的裂解产物，并用兔抗LAT血清进行Western blot分析三或山羊抗肌动蛋白血清（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）。

LAT的特性^4年/4年老鼠。

拉丁美洲^4年/4年小鼠表现出与LAT显著不同的表型^{重量/重量}与LAT相似的小鼠^−/−小鼠，尽管LAT^4年/4年胸腺细胞含有与LAT相似的LAT蛋白水平^+/−和LAT^{重量/重量}老鼠(图2A） ●●●●。我们还比较了LAT的LAT蛋白水平^4年/4年胸腺细胞与来自重组酶激活基因（Rag）1的胸腺细胞^−/−和CD3ε^−/−胸腺细胞，因为这些小鼠的胸腺大小相似，包含相似的胸腺细胞亚群。观察到一些实验间的变异性；然而，LAT中的蛋白质水平^4年/4年胸腺细胞始终是Rag1胸腺细胞中LAT水平的0.5–1.0倍^−/−和CD3ε^−/−小鼠(图2B） ●●●●。

我们之前报道过LAT中T细胞，而非B细胞、肥大细胞、NK细胞或血小板发育受阻^−/−小鼠10因此，我们重点分析了LAT^4年/4年小鼠T细胞发育。来自LAT的胸腺^4年/4年小鼠很小，通常约为LAT胸腺大小的十分之一^+/+小鼠（与LAT大小相似^−/−胸腺；图4A、 和数据未显示）。此外，通过正向和侧向散射测量的平均胸腺细胞大小在LAT中更大^4年/4年LAT中的小鼠^+/+或LAT^{重量/重量}表明这些细胞尚未成熟的小鼠(图4A） ●●●●。与这一发现一致，所有来自LAT的胸腺细胞^4年/4年小鼠为CD4⁻CD8（CD8）⁻.CD3ε(图4A） 和TCR-β（数据未显示）在LAT表面几乎检测不到^4年/4年胸腺细胞；然而，在LAT中检测到细胞内TCR-β染色^4年/4年和LAT^−/−胸腺细胞，表明TCR-β基因重排和表达（数据未显示）。更具体地确定LAT中T细胞发育阻滞发生的位置^4年/4年对小鼠胸腺细胞进行CD25和CD44染色。未成熟CD4⁻CD8（CD8）⁻胸腺细胞在分化为CD4之前经历四个发育阶段⁺CD8（CD8）⁺阶段：CD25⁻CD44细胞⁺→CD25型⁺CD44细胞⁺→CD25型⁺CD44细胞⁻→CD25型⁻CD44细胞⁻ 15。如所示图4B、 CD25处T细胞发育受阻⁺CD44型⁻LAT中的阶段^4年/4年老鼠。值得注意的是，在LAT的这个阶段，T细胞的发育也被阻断^−/−小鼠10和Rag^−/−16 17，CD3ε^−/−18 19和SLP76^−/−小鼠20与CD4的发育需要preTCR信号的观点一致⁻CD8（CD8）⁻CD25型⁺CD44细胞⁻胸腺细胞至CD4⁻CD8（CD8）⁻CD25型⁻CD44细胞⁻然后，到CD4⁺CD8（CD8）⁺阶段。

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图4

LAT的流式细胞术分析^4年/4年胸腺细胞。（A） 对单细胞胸腺细胞悬浮液进行表面染色，并通过流式细胞术进行分析。点图显示正向散射与侧向散射测量以及CD4与CD8染色。直方图显示CD3ε和CD5染色。灰色线条表示等型匹配阴性对照抗体染色。胸腺细胞总数在括号内。（B） 对CD4、CD8、CD3ε和B220阴性的胸腺细胞进行CD44和CD25表面表达分析。对CD4、CD8和B220阴性的胸腺细胞进行CD3ε、TCR-β和TCR-γδ表面表达分析。

克隆型非依赖性复合物（CICs）包含CD3亚单位与伴侣calnexin配对，可在CD4的细胞表面表达⁻CD8（CD8）⁻CD25型⁺CD44细胞⁻胸腺细胞21CICs最容易在缺乏克隆型亚单位表达的细胞表面表现出来，如Rag^−/−小鼠。通过preTCR或CIC的信号转导可通过注射抗CD3ε触发，从而诱导CD4的增殖⁻CD8（CD8）⁻胸腺细胞及其向CD4的成熟⁺CD8（CD8）⁺阶段22.确定LAT是否^4年/4年胸腺细胞可以通过preTCR或CIC传递信号，小鼠注射抗CD3ε抗体。拉丁美洲^−/−小鼠，这种治疗不会导致胸腺细胞成熟或增殖(图5、和参考10)可能是因为preTCR或CIC下游的信号转导被阻断。注射抗CD3ε抗体也不会导致LAT中胸腺细胞成熟或增殖^4年/4年老鼠(图5)表明即使在这些强烈的刺激条件下，4YF突变LAT蛋白也无法在preTCR或CIC信号转导中发挥作用。

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图5

LAT中有缺陷的preTCR信号^4年/4年胸腺细胞。6周龄Rag1^−/−，拉丁美洲^−/−或LAT^4年/4年小鼠单次腹腔注射抗CD3ε（145-2C11，下面板）或PBS（对照，上面板）。1周后，用流式细胞仪检测胸腺细胞总数。描绘了CD4与CD8和CD44与CD25的两种颜色图（在CD4、CD8、CD3ε和B220阴性细胞上门控）。胸腺细胞数量见括号。

最后，LAT中缺失的所有成熟T细胞亚群^−/−LAT中也没有小鼠^4年/4年老鼠。这些包括CD4⁻CD8（CD8）⁻TCR-αβ⁺胸腺细胞（NK1.1⁺T细胞；图4B、 和参考23)、胸腺和外周γδTCR⁺T细胞(图4A、 和数据未显示），外围αβTCR⁺CD4细胞⁺和CD8⁺T细胞和肠上皮内T淋巴细胞（数据未显示）。

这些结果证实了LAT在T细胞发育过程中的关键作用，并扩展了我们之前通过标准敲除技术获得的数据，以确定胸腺细胞成熟所必需的LAT酪氨酸残基。在Jurkat细胞中，Y132的突变（小鼠LAT中Y136的人类对应物）消除了PLC-γ1与LAT的关联，而Y171、Y191和Y226的突变（Y175、Y195和Y235的人类对应体）消除了Grb-2和Gads与LAT之间的关联，那么与PLC-γ1、Grb-2和Gads（以及其他蛋白质）的关联可能对preTCR信号中的LAT功能至关重要。与成熟T细胞中的TCR信号类似，一些下游通路可能会受到这些关联丢失的影响，特别是依赖钙动员和Ras-MAPK激活的通路。Gads还可能通过与SLP-76的关联激活下游信号通路（有关综述，请参阅参考文献24). SLP-76还与Vav相关，因此可能调节Rac/cdc42的激活和肌动蛋白重组（有关审查，请参阅参考文献25). 有趣的是，SLP-76的表型^−/−小鼠T细胞发育与LAT相似^−/−和LAT^4年/4年老鼠20考虑到这些相互作用对信号转导的重要性，可以预测4YF LAT将作为一种惰性或无效蛋白发挥作用。与此概念一致，LAT^{+/4年（预测）}小鼠胸腺大小正常，T细胞发育正常，表明4YF LAT蛋白在野生型蛋白存在的情况下不会产生显性负作用。

除了四种远端酪氨酸对T细胞发育的必要性外，最近的实验表明它们对T细胞的发育也足够了（未发表的数据）。使用一种表达突变LAT蛋白的逆转录病毒感染LAT，该突变LAT蛋白质仅包含四个末端酪氨酸（即，前五个酪氨酸突变为苯丙氨酸）^−/−骨髓细胞，并将这些细胞过继转移到经照射的LAT^−/−小鼠。这种突变形式的LAT在引入LAT时完全能够恢复T细胞的发育^−/−小鼠，表明在LAT中的九个潜在酪氨酸磷酸化位点中，远端四个足以促进T细胞发育。

我们之前已经展示了LAT^+/−小鼠表现出正常的T细胞发育，表明胸腺细胞成熟和T细胞功能对LAT表达的适度变化不敏感。与这个想法一致，LAT中的LAT蛋白水平^{重量/重量}胸腺细胞的水平略低于野生型，但胸腺细胞发育不受影响。LAT的过度表达是否改变了T细胞的发育，LAT中肥大细胞和血小板的活化也受到影响，还有待确定^−/−小鼠26 27虽然在本研究中没有特别提到，但敲除小鼠的可用性将允许我们测试4YF突变蛋白在这些谱系中的功能。

重要的是，LAT的观察结果^{重量/重量}小鼠表现出正常的T细胞发育，这验证了敲除策略在T细胞发育中LAT功能研究中的有效性。这些结果表明，使用类似的方法，应该可以产生额外的LAT敲除小鼠，这些小鼠在LAT中包含单个或多个Y→F突变。这些研究应该能够系统评估特定LAT酪氨酸和LAT偶联信号转导途径对T细胞发育的贡献。