肿瘤坏死因子家族成员突变对外周淋巴结基因的调控

第一阶段。

淋巴系统通过淋巴囊的形成而发育，淋巴囊起源于静脉的内皮芽（早在小鼠胚胎期[E]10.5天开始）。Prox1，与普鲁索果蝇最近研究表明，它对静脉内皮细胞的出芽至关重要，其缺乏会导致淋巴系统完全停滞，继而导致早期死亡5.

第二阶段。

淋巴管是由淋巴囊中的内皮细胞发芽而形成的。

第三阶段。

淋巴结原基是通过间充质结缔组织内陷到生长中的淋巴囊管腔中而形成的。由此形成的淋巴管网络形成淋巴丛，可产生淋巴结。因此，间充质结缔组织内陷是LN实质的原基，其中包含网状细胞、成纤维细胞、一些白细胞、毛细血管和血管环。因此，原始淋巴结主要是由淋巴管内皮细胞包围的细胞网状结构，形成包膜下窦。胎儿LN的血液供应在此阶段已经存在，通过穿过结缔组织内陷柄的血管。正是在LN原生质中形成专门的内皮细胞，支持白细胞从血流进入下层LN实质。

第四阶段。

LN原液中的细胞密度和白细胞含量增加，形成包膜下窦。在淋巴结形成的这一阶段，大多数造血谱系前体细胞可能会定植于淋巴结薄壁组织。

PCR分析。

为了对小鼠进行基因分型，以50μl PCR反应（10 mM Tris-HCl，pH 8.3，50 mM KCl，1.5 mM MgCl）对苯酚/氯仿提取的尾部活检DNA或胎肝基因组DNA进行基因组PCR₂200μM dNTPs和0.5 U Taq聚合酶；Sigma-Aldrich）。引物的组成和浓度，以及所用的产物大小和PCR条件如下：5′-TRANCE（0.5μM），5′-CAAGAGTGGATTCTAAATCCTG-3′；3′WT（0.2μM），5′-GGTTGGACACCTGAATGCTAATTTC-3′（345 bp）；和3′NeoRec（0.2μM），5′-ATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCG-3′（575 bp）；94°C，5分钟；30次循环（94°C，30 s；58°C，45 s，72°C，1 min）；和72°C，7分钟。

对第一链合成的胸腺细胞cDNA进行半定量逆转录PCR25所用的引物如下：5′-次黄嘌呤核糖基转移酶（HPRT），5′-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3′；3′-HPRT，5′-ccagcaagcttgcaaccttacca-3′；5′-TRANCE-R，5′-CCCGAATTCTACTACAGGAGGAGAG-3′；3′-TRANCE-R，5′-CCTGCTGGATTAGGAGCAGTG-3′；5′-轨道，5′-CCTGAGACTCACATAA-CGC-3′；和3′-TRANCE，5′-TAACCCTTTAGTTCCGTTGC-3′。

LN枚举。

在徕卡M16解剖显微镜下进行检查时，获得了视频采集的双目立体显微镜图像（×10倍放大）。此外，在处死前3小时，将一些小鼠皮下注射Evan蓝染料（1:10稀释）。

Abs和流式细胞术。

使用以下试剂和抗体进行染色：TRANCE-R-hIgG₁（TR-Fc[25]）；1E6.66（大鼠抗TRANCE-R单克隆抗体）GK5.1（抗CD4）；RM4-5（抗CD4）；145-2C11（抗CD3）；53-6.7（抗CD8）；104（抗CD45.2）；H57-597（抗TCR）；RA3-6B2（抗B220）；R6-60.2（抗IgM）；11-26C.2a（抗IgD）；HL-3（抗CD11c）；M1/70（抗CD11b）；PC61（抗CD25）；IM7（抗CD44）；S7（抗CD43）；mLT-βR-hIgG₁ 11; AF.H6（激动性抗-mLT-βR mAb[13]；DATK-32（抗-LPAM-1）；MECA-367（抗粘膜地址素细胞粘附分子[MAdCAM]-1）；和3D6.112（antisialoadhesin；Serotec）。样品经红细胞裂解并用抗CD16/32 FcR单克隆抗体2.4G2（1:50稀释）预处理，然后使用带有氩和氦氖激光的FACSCalibur™进行四色荧光测定（Becton Dickinson）。

免疫荧光分析。

为了对冰冻切片进行免疫荧光分析，采集、冷冻、切片小鼠器官，并在PBS中预先用2.4G2封闭后，按所述进行染色11 12 26简而言之，让低温恒温器部分（5μm厚）风干并固定在丙酮中。将切片与初级抗体孵育45分钟，在PBS中冲洗，与次级抗体孵养30分钟，用PBS冲洗，并使用防褪色安装介质盖玻片。使用的主要抗体是Alexa-488结合的抗CD4抗体和生物素标记的抗MAdCAM-1抗体。对于整体免疫荧光分析，用FITC-偶联抗CD4抗体和PE-标记抗MAdCAM-1对新分离的第0天MLN或MLN雏形（rMLNs）进行染色。为此，将整个MLN或rMLN与抗体在4°C下孵育3-4小时，清洗三次，并使用配备SensiCam CCD相机（Cooke Corporation）的Axioplan 2荧光显微镜（蔡司）使用SlideBook软件（智能成像公司）获取视觉数据。

TRANCE中脾B细胞滤泡的改变^−/−老鼠。

TRANCE的整体脾结构没有重大缺陷^−/−小鼠，如报告所示17然而，脾脏切片的免疫荧光分析显示，70%以上的TRANCE患者脾脏微结构发生改变^−/−小鼠。虽然淋巴细胞分离成离散的T和B细胞区，但B细胞滤泡的形成和边缘区的完整性存在缺陷。TRANCE中这些缺陷的程度^−/然而，即使在同一只小鼠中，小鼠的差异也很大：我们观察到T细胞丰富的小动脉周淋巴鞘只有稀疏的B细胞环但没有卵泡，有B细胞环却没有卵泡或B细胞卵泡明显正常(图2A） ●●●●。为了评估边缘区的完整性，我们用唾液粘附素（边缘区巨噬细胞的标记物）特异性抗体对脾脏切片进行染色。野生型（WT）和TRANCE^+/−小鼠显示出一个紧密明亮的染色环，覆盖整个边缘区，仅被桥接通道打破（数据未显示）。相比之下，大多数TRANCE^−/−小鼠有反复中断和弥散的可变染色。约占TRANCE的75%^−/−小鼠表现出边缘区完整性缺陷；剩下的~25%看起来相对正常。TRANCE公司^−/−边缘区染色相对正常的小鼠，其B细胞滤泡也相对完整（数据未显示）。尽管存在这些缺陷，但用T细胞依赖性抗原硝基酚标记的KLH免疫后，TRANCE的脾脏中形成了GC^−/−与WT小鼠相当的小鼠(图2B） ●●●●。这些结果表明，TRANCE有助于脾脏中B细胞滤泡的正确形成，但不是必需的。

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图2

TRANCE脾脏中原代B细胞滤泡发生改变，但GC的形成明显正常^−/−小鼠。（A） WT，TRANCE代表性脾脏切片的免疫荧光显微照片^+/−和TRANCE^−/−小鼠。从3-4周龄小鼠的脾脏进行解剖，并用抗B220（FITC）和抗CD4（PE）染色。（B） 50μg NP免疫小鼠10天后制备的脾脏切片的代表性免疫荧光显微照片₁₂-KLH吸附到明矾上。采用免疫荧光显微镜检测GC的形成（PNA-生物素/链霉亲和素-PE和抗IgM-FITC）。

TRANCE中缺少LN^−/−老鼠。

TRANCE公司^−/−小鼠表现出LN发育缺陷(图3A） 但正常PPs（未显示数据），与之前的报告一致17虽然大多数TRANCE^−/−小鼠未能发育出任何PLN或MLN，我们偶尔观察到颈部LNs（CLN）在TRANCE发育^−/−小鼠（约占TRANCE的30%^−/−受检小鼠含有一个CLN；图3B） ●●●●。这种CLN似乎是真正的LN，T细胞和B细胞分离成离散区(图3B） ●●●●。然而，B细胞未能在这些CLN中形成滤泡，类似于在～70%TRANCE的脾脏中观察到的缺陷^−/−小鼠。

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图3

TRANCE对于正确开发PLN至关重要。（A） 将Evan的蓝色染料注射到所有脚垫中，获得了PLN的图像。图示为MLN、髂骨和骶骨（囊）LN。除CLN（见面板B）外，100%的TRANCE^−/−小鼠缺乏所有的PLN和MLN。（B） TRANCE中的CLN^−/−小鼠。TRANCE中发现的CLN的代表性图像^负极/−小鼠（左侧）。从TRANCE获得的CLN的代表性免疫荧光分析^−/−抗CD4–PE和抗B220–FITC（右）。（C） TRANCE对PLN发育的单倍体不足效应。TRANCE的代表性形象^+/−缺乏一个腹股沟（Ing.）LN的小鼠。

我们还注意到，少数TRANCE^+/−具有中等水平TRANCE表达的小鼠未能发育出一些PLN（约占TRANCE的7%^+/−小鼠缺乏一个腹股沟LN和～3%的TRANCE^+/−小鼠缺少一个髂骨LN；图3C） ●●●●。然而，没有TRANCE^+/−小鼠在MLN的形成方面表现出任何异常。因此，这些结果表明TRANCE对某些PLN的形成具有单倍体不足效应。

TRANCE和TRANCE-R在正在发育的LN细胞中的表达。

如上所述，TRANCE基因缺失最显著的影响是对PLN和MLN的发育。由于LN结构的形成在小鼠早期发育过程中受到调节，我们检测了TRANCE和TRANCE-R在发育LN中的表达。在本研究中，我们从新生的WT小鼠（第0天的MLN）中分离出MLN。

出生时，MLN包含各种类型的血淋巴细胞。特别是，第0天MLN被CD45定植⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻细胞，表达表面LTαβ(图4)和其他基因产物（如RelB、IL-2Rγ_c（c）链或BLR-1[27]），已证明在LN发展中发挥重要作用22 23 28 29。我们未能通过FACS检测到第0天MLN的新鲜分离细胞中的表面TRANCE表达^®使用TRANCE-R-IgG进行分析₁融合蛋白（数据未显示）。然而，在培养基中对第0天的MLN细胞进行短暂培养后，我们可以检测到CD45上特异性的表面TRANCE表达⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻单元格(图4). 1至2 h的培养时间长度不影响TRANCE表达水平（数据未显示），这表明表面TRANCE可能由于在MLN发育过程中与受体持续相互作用而脱落。TRANCE在CD45上的限制性表达⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻细胞与表面LTαβ相似(图4).

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图4

CD45型⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻第0天的MLN细胞表达TRANCE和TRANCE-R。从第0天培养的MLN中获得的细胞用抗CD4、抗CD45和TRANCE-R-IgG染色₁（用于TRANCE）、1E6.66（用于抗TRANCE-R）、LT-βR-IgG₁（对于表面LTαβ）或AF.H6（对于抗-LT-βR）（粗线）。通过机械破坏第0天的MLN分离细胞。通过胶原酶消化第0天的MLN分离细胞时也获得了类似的结果（数据未显示）。为了检测表面TRANCE，在TRANCE-R-IgG1染色之前，将从第0天MLN中获得的细胞在培养基中培养1-2小时。灰色直方图为阴性对照。用于TRANCE-R-IgG₁和LT-βR-IgG₁，与人IgG孵育₁作为阴性对照。对于抗TRANCE-R mAb（1E6.6）和抗-LT-βR Ab（AF.H6），分别使用大鼠IgG和仓鼠抗KLH（Ha/48）作为阴性对照。

我们还通过FACS检测了表面TRANCE-R的表达^®使用抗TRANCE-R单克隆抗体（1E6.66）对第0天MLN的细胞进行分析。与TRANCE不同，TRANCE-R很容易在新分离的CD45中检测到⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻细胞以及一些CD45⁺CD4细胞⁻单元格(图4). 右TRANCE-R⁺CD45型⁺CD4细胞⁻这些细胞还表达B220、CD19和表面IgM，表明它们是B细胞（数据未显示）。然而，CD45上未检测到TRANCE-R⁻细胞。与TRANCE-R在血淋巴系细胞上的表达相反，LT-βR仅在CD45亚群中检测到表达⁻第0天MLN中发现的基质细胞或内皮细胞(图4).

因此，这些结果表明，尽管TRANCE和LTαβ在相同的细胞群（即CD45）上表达⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻)TRANCE-R和LT-βR在发展中的LNs定植时在离散的细胞群上表达，表明TRANCE和LTαβ可能影响发展中LNs中的不同细胞类型。

CD45对发育中LNs的定植作用⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻细胞一直备受关注，因为这些细胞表达表面LTαβ和其他对LN生成至关重要的基因产物27与LTαβ类似，TRANCE也在CD45上特异表达⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻我们推测，这些细胞在LN发育过程中的命运可能受到TRANCE或LTαβ的调节。为了验证这个假设，我们从WT小鼠和新生TRANCE的rMLNs（MLNs本应发育的区域）中收集了第0天的MLNs^−/−和LTα^−/−小鼠(图5A） ●●●●。第0天TRANCE的rMLNs^−/负极(图5A） 和LTα^−/−小鼠（数据未显示）在处死时与小肠的淋巴管相连，充满乳白色液体（可能是乳糜），表明TRANCE^−/−小鼠已经形成淋巴管（II期），LTα也是如此^−/−小鼠。

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图5

CD45减少定植⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻TRANCE中的细胞及其未能形成簇^−/−或LTα^−/−小鼠。（A） 新生WT小鼠的MLN和新生TRANCE中发现的rMLN的代表性图像^−/−小鼠。圆点表示隔离的MLN或rMLN。在新生儿LTα中观察到类似的rMLNs^−/−小鼠（数据未显示）。淋巴管呈白色，可能是由于乳糜从肠道排出所致。（B） 来自WT小鼠第0天MLN或来自TRANCE的rMLNs细胞的代表性流式细胞术分析^−/−和LTα^−/−小鼠。（C） CD45的百分比⁺显示CD4的细胞⁺CD3（CD3）⁻WT小鼠第0天MLN或TRANCE的rMLNs的表型^−/−和LTα^−/−小鼠。（D） WT或TRANCE第0天肠道冰冻切片的代表性免疫荧光分析^−/−小鼠。切片用抗CD4–Alexa-488和抗MAdCAM-1–PE染色。

在WT第0天的MLN中，约50%的CD45⁺细胞为CD4⁺CD3（CD3）⁻所有细胞都表达α₄β₇整合素（用FACS测量^®使用抗α分析₄β₇单克隆抗体，LPAM-1；图5B和图C)，它是MAdCAM-1的配体，MAdCAM1是高内皮微静脉中发展MLN的主要寻址蛋白26 27 30当这些CD45的拓扑结构⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻通过对新分离的全天0个MLN进行染色来检查正在发育的LN中的细胞，我们发现这些细胞在第0天MLN的离散区域中组织成紧密的簇(图6). 此外，CD45⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻细胞被鉴定为与MAdCAM-1共定位的簇⁺内皮微静脉(图6).

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图6

CD45形成簇需要TRANCE和LT-α⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻细胞和MAdCAM-1的形成⁺正在发育的LN中的内皮细胞网络。新生儿WT或TRANCE新鲜分离MLN的全贴装染色的代表性图像⁽−^/−^，Tg）小鼠和TRANCE的rMLN^−/−或LTα^−/−小鼠。用抗CD4–FITC和抗MAdCAM-1–PE对整个MLN或rMLNs进行染色。

TRANCE的第0天rMLN^负极/−小鼠，CD45的总百分比⁺与第0天WT小鼠的MLN相比，细胞显著减少（约减少四倍）（数据未显示）。除了CD45的整体减少外⁺细胞，CD45的百分比选择性降低⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻TRANCE中第0天rMLN的细胞^−/−小鼠(图5B和图C)只有～10%的CD45⁺细胞为CD45⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻细胞。CD45虽然数量减少⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻TRANCE第0天rMLN中发现的细胞^−/−小鼠仍表达α₄β₇与WT细胞水平相当的整合素(图5B和图C). 除了CD45数量减少之外⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻FACS观察到的第0天rMLN细胞^®分析，免疫荧光分析显示⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻发现存在的细胞散布在整个rMLN上，与聚集形成的CD45形成对比⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻WT第0天的细胞MLN(图6). 此外，MAdCAM-1网络⁺WT小鼠第0天MLN中观察到的内皮微静脉在TRANCE中显著发育不全^−/−小鼠(图6).

为了进行比较，我们还检测了新生儿LTα的rMLNs^−/−小鼠，也不能产生LN。与TRANCE相似^−/−小鼠，LTα^−/−小鼠CD45的百分比降低⁺第0天rMLN中的单元格（未显示数据）。此外，CD4的百分比显著降低（约两倍）⁺CD3（CD3）⁻CD45内的细胞⁺在LTα的第0天rMLNs中观察到种群^负极/−小鼠(图5B和图C). 其余细胞表达正常水平的α₄β₇整合素(图5B和图C). 与TRANCE的第0天rMLN相比^−/−小鼠，更多CD45⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻在LTα中观察到细胞^−/−第0天rMLN(图5B和图C). 然而，正如TRANCE^−/−小鼠，CD45⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻细胞散布在rMLN中(图6). MAdCAM-1网络⁺与第0天WT小鼠的MLN相比，内皮微静脉及其厚度也显著减少(图6).

与正在发育的LN相反，WT小鼠和TRANCE第0天的肠道^−/−小鼠含有相当比例的CD4⁺CD3（CD3）⁻CD45内的细胞⁺人口（未显示数据），标识为集群(图5D） ●●●●。第0天LTα的肠道^−/−小鼠先前被证明含有CD4⁺CD3（CD3）⁻个单元，但未能形成簇31.

综上所述，这些结果表明TNF家族成员TRANCE和LTαβ通过血淋巴系细胞，特别是CD45，调节正在发育的LN的定植⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻细胞，通过影响其迁移到正在发育的LN或通过影响其在LN原基中的持久性/分化。此外，CD45的能力⁺CD4细胞⁺CD3（CD3）⁻在LNs发育过程中形成簇的细胞也受到TRANCE和LTαβ的调节。

我们感谢Choi、Rennert和Mebius实验室的成员。我们还感谢丹·利特曼博士和胡安·拉法耶博士，以及耶尔俱乐部的成员们，感谢他们的讨论和慷慨。

这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款AI44264（Y.Choi）、美国白血病学会（S.Jung）特别研究员、霍华德·休斯医学研究所（J.D.MacMicking）生命科学研究研究员、罗氏器官移植研究基金会（R.Josien）的部分支持，荷兰皇家艺术与科学学院（R.E.Mebius）和荷兰科学研究组织（T.Cupedo）的拨款901-05-340。Y.Choi也是霍华德·休斯医学研究所的助理研究员。