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《实验医学杂志》。2000年4月3日；191（7）：1233-1240。
数字对象标识：10.1084/jem.191.7.1233
预防性维修识别码：PMC2193168型
PMID：10748240

肿瘤坏死因子受体相关因子（Traf）6在白细胞介素17信号转导中的需求

拉尔夫·施万德纳,一 山口京子,一和曹兆丹一
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

白细胞介素（IL）-17通过其广泛分布的细胞表面受体发出信号，增强编码促炎分子的基因的转录。尽管已有大量文献证明IL-17激活转录因子核因子（NF）-κB和c-Jun NH2-末端激酶（JNK），上游信号传导事件基本未知。在这里，我们报告了IL-17诱导的NF-κB和JNK活化对肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF）6的需求。在TRAF6基因敲除小鼠的胚胎成纤维细胞（EFs）中，IL-17未能激活IκB激酶（IKKs）和JNK。因此，IL-17诱导的IL-6和细胞间黏附分子1在TRAF6缺陷细胞中的表达被消除。TRAF6缺乏似乎是观察到的对IL-17无反应的唯一缺陷，因为TRAF6表达质粒瞬时转染到TRAF6缺陷细胞后，在荧光素酶报告试验中恢复了IL-17诱导的NF-κB活化。此外，TRAF6缺陷EF上IL-17受体（IL-17R）的水平与野生型对照细胞上的水平相当。TRAF2缺陷EF中未观察到IL-17反应缺陷。此外，当TRAF6和IL-17R在293细胞中共存时，TRAF6与IL-17R共同免疫沉淀。总之，这些结果表明TRAF6（而非TRAF2）是导致炎症反应的IL-17信号通路中的关键成分。

关键词：细胞因子、炎症、信号传导、激酶、转录

介绍

IL-17，以前称为CTLA-8（细胞毒性T细胞淋巴细胞相关抗原8；参考1)，是一种20-30 kD的蛋白质，由活化的CD4细胞分泌，主要是Th0和Th1细胞2 三在不同的细胞类型中，IL-17诱导多种炎症前分子的表达，包括IL-1β、IL-8、诱导型一氧化氮合酶、环氧化酶-2和细胞间粘附分子（ICAM）-1三 4 5 6据报道，IL-17还可诱导造血细胞因子，如GM-CSF、白血病抑制因子和IL-67因此，IL-17似乎在T细胞活化和炎症反应之间提供了直接联系。事实上，IL-17与Th1介导的炎症性疾病有关，如类风湿性关节炎和器官移植排斥反应7 8 9 10 11.

与引发类似细胞反应的TNF和IL-1一样，IL-17也激活转录因子核因子（NF）-κB和激活蛋白（AP）-1，后者是促炎细胞因子所显示的基因调节活动的重要介质6 12 13 14AP-1由丝裂原活化蛋白激酶介导的磷酸化事件激活，包括c-Jun NH2-末端激酶（JNK）-115而NF-κB活化之前是IκB激酶-α和-β（IKK）的活化，它们以杂合物的形式存在于大多数细胞类型中16 17 18 19 20 21IKK磷酸化IκB蛋白上的两个特异性丝氨酸残基，标记它们进行蛋白水解22 23 24 25 26抑制性IκB蛋白的降解导致NF-κB蛋白质的释放和核移位，NF-κ子B蛋白质转录激活靶基因。

TNF和IL-1通过不同的细胞表面受体传递信号，并利用不同的受体-最大信号分子。TNF诱导其I型受体（相对于II型受体的主要信号受体）三聚体化，从而启动信号级联，与适配器TRADD（TNF受体相关死亡域蛋白）、丝氨酸/苏氨酸激酶RIP（受体相互作用蛋白）和TNF受体关联因子（TRAF）2相连接27 28 29IL-1诱导两种不同受体链的异型复合物形成，即I型受体（IL-1R1）和受体辅助蛋白（IL-1RAcp）30 31 32这触发了涉及适配器分子MyD88、丝氨酸/苏氨酸激酶IRAK（IL-1受体相关激酶）和TRAF6的信号事件33 34 35TRAF2和TRAF6介导IKK和JNK的激活36因此，TRAF蛋白代表一类适配器，将不同细胞因子的不同上游信号通路引导到一个聚合点。

IL-17受体（IL-17R）是一种表观分子量为130 kD的1型跨膜蛋白37它与TNF、IL-1或其他细胞因子的受体没有序列同源性。目前对IL-17R的分子信号机制知之甚少。在本研究中，我们使用TRAF2-和TRAF6-缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）来研究TRAF分子在IL-17诱导的NF-κB和JNK激活中的作用。我们的结果表明，TRAF6是IL-17信号通路中的一个关键信号分子。

材料和方法

细胞培养和生物材料。

主要EF来自T.W.Mak的实验室（安进研究所/加拿大安大略省多伦多市安大略癌症研究所）。如前所述，这些细胞来自妊娠第14.5天的胚胎38 39EFs和人类胚胎肾（HEK）293细胞在添加10%认证FBS、10mM谷氨酰胺和50μg/ml链霉素和青霉素（GIBCO BRL）的高糖二甲醚（Cellgro）中培养，培养箱中含有5%CO2小鼠TNF由Genentech提供；人IL-1β和小鼠IL-17购自Biosource。

荧光素酶报告分析。

重建IL-17应答，TRAF6+/−和TRAF6−/−将MEF接种在6孔（35 mm）板中，第二天转染0.5μg荧光素酶报告基因（由一个基本启动子和6个NF-κB结合位点控制）、2μg pRSV-β-gal和50 ng载体DNA或TRAF6表达质粒DNA34根据制造商推荐的方案使用效应基因转染试剂（QIAGEN Inc.）。转染后36 h，用TNF（25 g/ml）或IL-17（100 g/ml）刺激细胞8 h。分别用荧光素酶测定系统（Promega公司）和Tropix化学发光试剂测定荧光素素酶活性和β-半乳糖苷酶活性。

电泳迁移率测定。

测定NF-κB–DNA结合活性，2×105将EFs接种在3.5厘米的培养皿中24小时。细胞在无血清培养基中培养1小时，然后添加细胞因子。在指定的时间（参见图1)在细胞因子诱导后，用含有1mM EDTA的PBS收获细胞。如前所述，进行核提取物制备和凝胶电泳迁移率变化分析（EMSA）40.

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NF-κB在MEFs中的激活。（A） TRAF6缺陷细胞对IL-1和IL-17缺乏NF-κB激活。从TRAF6制备核提取物+/+或TRAF6−/−用25 ng/ml mTNF、50 ng/ml IL-1或100 ng/ml m IL-17治疗MEF指定的时间长度。测试每个样本中6μg蛋白质与EMSA中包含NF-κB结合位点的合成DNA片段的结合能力。（B） TRAF2缺陷细胞对IL-17的正常NF-κB激活。对来自TRAF2缺陷小鼠胚胎及其野生型同胎鼠的MEF进行了与A中相同的实验。

体外激酶分析和免疫印迹分析。

EF（106)要么未经治疗，要么接受了指定的细胞因子治疗（参见图2)在没有血清的情况下持续10分钟。用冷PBS冲洗细胞，并在裂解缓冲液（50 mM Hepes，pH 7.6；125 mM NaCl；1.5 mM MgCl）中在冰上裂解20 min2; 10%甘油；0.5%NP-40；1 mM EGTA；蛋白酶抑制剂混合物[Boehringer Mannheim]；20 mMβ-甘油磷酸；1 mM原钒酸钠；和5毫微米第页-硝基苯基磷酸盐）。通过14000 rpm离心20 min将细胞碎片丸化。使用抗NEMO兔抗血清免疫沉淀上清液中的IKK–NEMO（NF-κB必需调节剂）蛋白复合物，并检测磷酸化重组IκB-α（氨基酸1–250）的活性，如前所述40用抗JNK-1 mAb（PharMinen）沉淀JNK，并使用重组GST-c-Jun 1-79融合蛋白作为底物在体外激酶试验中检测激酶活性（圣克鲁斯生物技术）。

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从TRAF6缺陷MEF中分离的IKK复合物和JNK的激酶活性。（A） 用25 ng/ml mTNF、50 ng/ml IL-1或100 ng/ml m IL-17处理TRAF6缺陷（−/−）和杂合EF（+/−）10分钟。使用抗NEMO多克隆抗体免疫沉淀IKK复合物，并检测磷酸化IκB-α（氨基酸1–250）的活性（顶面板[KA]，体外激酶分析）。通过SDS-PAGE分离免疫沉淀材料，并用IKK-α和IKK-β抗体的混合物进行免疫印迹（下图[IB]，免疫印迹）。分子质量标准以千道尔顿为单位。（B） JNK-1是从野生型、TRAF2缺陷型和TRAF6缺陷型MEF中沉淀出来的，用指定的细胞因子处理，并检测其磷酸化重组c-Jun的活性（顶面板）。沉淀JNK-1的数量通过免疫印迹法测定（底部）。

为了检测用抗NEMO抗血清进行免疫沉淀的IKK-α和IKK-β，用10%SDS-PAGE分离免疫沉淀，转移到硝酸纤维素膜上，并用前面描述的抗-IKK-α和抗-IKK-β多克隆抗体进行免疫印迹（Santa Cruz Biotechnology）40用抗JNK-1兔多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology）检测JNK-1。

表达质粒、转染和免疫共沉淀。

其他地方描述了Flag标记的CD40和Flag标记的IL-1R1的表达质粒33 41将缺乏信号肽编码序列的PCR-产生的cDNA插入表达载体pFlag-CMV-1（Eastman Kodak Co.），构建标记IL-17R的哺乳动物表达质粒。对于共沉淀实验，2×106将HEK 293细胞接种在10厘米的培养皿上，并在第二天用指定数量的表达构建物进行转染（参见图5). 18小时后，收集细胞，用PBS洗涤一次，并用裂解缓冲液在冰上裂解20分钟。细胞裂解物与反Flag M2珠培养2小时（Sigma Chemical Co.）。在用裂解缓冲液进行大量洗涤后，用400μM Flag肽（Sigma Chemical Co.）洗脱珠子，用SDS-PAGE分离，并转移到硝化纤维素膜上。用抗Myc或抗HA（血凝素）单克隆抗体（Babco）进行免疫印迹分析。通过免疫印迹小份细胞裂解物验证转染构建物的表达。

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TRAF6和IL-17R的相互作用。将标记有标志的IL-1R1、IL-17R或CD40的表达质粒DNA与标记有Myc-标记的TRAF6或标记有HA的TRAF2一起转染293细胞18小时。细胞被裂解，受体被抗Flag珠免疫沉淀。顶面板上，用SDS-PAGE溶解Flag免疫沉淀物，并用Myc和HA抗体进行印迹，以检测共沉淀TRAF6和TRAF2。中央面板，用Flag抗体对Flag免疫沉淀物进行印迹，以检查沉淀物受体的数量。下图，用Myc和HA抗体印迹转染细胞的裂解物，以确定TRAF2和TRAF6蛋白的表达水平。

MEF分泌IL-6的测定。

EFs以3×10的密度播种424孔板中每孔的细胞数并培养24小时。细胞未经处理或用TNF、IL-1或IL-17刺激15小时。使用制造商的协议，通过ELISA（Endogen）测定培养上清的IL-6浓度。

细胞表面IL-17R和ICAM-1的免疫染色。

检测IL-17R、EFs（5×105)首先用含有山羊抗鼠（m）IL-17R抗血清（Santa Cruz Biotechnology）或对照血清的PBS孵育1小时。用PBS洗涤两次后，将细胞与山羊IgG的FITC-结合抗体孵育1小时（圣克鲁斯生物技术公司）。使用FACSCalibur™分析仪（Becton Dickinson）进行流式细胞术。为了检测ICAM-1，用10 ng/ml的TNF、IL-1或IL-17处理细胞15小时，或者不进行处理。首先用ICAM-1单克隆抗体（PharMinen）培养细胞，然后用小鼠IgG的FITC-结合抗体（Santa Cruz Biotechnology）染色。

结果和讨论

IL-17诱导的NF损伤-κTRAF6缺陷细胞中的B激活。

从TRAF6获得的EFs−/−用IL-17、TNF或IL-1刺激胚胎或其野生型同胞。用EMSA检测NF-κB–DNA结合活性。在野生型细胞中，在IL-17治疗10分钟后检测到NF-κB激活，随后持续增加至40分钟(图1A） ●●●●。杂合子EF细胞（TRAF6）也获得了类似的结果+/−; 数据未显示）。然而，在TRAF6中−/−在检测的时间范围内未检测到NF-κB活化。与之前的报告一致，TRAF6−/−细胞对IL-1也没有反应38相反，TNF诱导的NF-κB活化未被TRAF6基因破坏所改变，这表明TRAF6缺乏只会导致对特定细胞因子的反应缺陷。

因为TRAF2也与某些细胞因子对NF-κB的激活有关39 42 43 44，我们检查了IL-17诱导的NF-κB活化是否受到TRAF2缺陷的影响。TRAF2的治疗−/−具有IL-17或IL-1诱导的NF-κB活性的MEF与在野生型对照细胞中观察到的活性相当(图1B） ，而TNF处理20分钟诱导的NF-κB活化显著降低。这些结果表明，如前所述，TRAF2参与TNF的信号转导39但IL-1或IL-17不表达。

在TRAF6缺乏细胞中IL-17诱导的IKK激活的消除。

IL-1、TNF和LPS诱导的NF-κB活化需要激活IKK。我们研究了IL-17诱导的NF-κB活化是否也由IKK介导，如果是，IL-17介导的IKK活化是否在TRAF6敲除细胞中受损。TRAF6中的IKK复合体+/−或TRAF6−/−未经治疗或用TNF、IL-1或IL-17治疗的EFs与抗NEMO抗体共同免疫沉淀，NEMO是IKK复合物中的一种稳定成分17 19免疫印迹分析表明，从未经治疗或细胞因子治疗的TRAF6中免疫沉淀出类似数量的IKK-α和-β+/−和TRAF6−/−单元格(图2). 然后测定免疫沉淀物磷酸化含有IKK底物丝氨酸32和36的重组IκB-α（氨基酸1-250）的活性。TRAF6的治疗+/−含有TNF、IL-1或IL-17的细胞显著增强了IKK活性，如IκB-α、NEMO和IKK的磷酸化增加(图2A） ●●●●。另一方面，TRAF6中的IKK活性−/−细胞只被TNF增强，而不被IL-1或IL-17增强。这些结果表明，与TNF和IL-1一样，IL-17通过诱导IKK的催化活性激活NF-κB，并且IL-17诱导的IKK激活涉及TRAF6。

在TRAF缺乏的细胞中测量JNK活性时也得到了类似的结果(图2B） ●●●●。IL-17和IL-1诱导的JNK激活在TRAF6敲除细胞中被消除，但在TRAF2敲除细胞内保持不变。与之前的报告一致39在TRAF2缺乏的细胞中观察到TNF诱导的JNK活化减少。

IL-17未能诱导TRAF6缺陷细胞中IL-6和ICAM-1的表达。

为了研究IL-17激活IKK和NF-κB的失败是否会转化为其不能激活靶基因，我们通过TRAF6缺陷的MEF测定了IL-6的分泌。对照MEF对TNF、IL-1和IL-17有反应，IL-6分泌显著增加(图3A） ●●●●。另一方面，TRAF6敲除细胞对IL-17或IL-1的反应未能产生增加的IL-6水平。TNF治疗后，TRAF6缺陷细胞分泌的IL-6增加，尽管与对照细胞分泌的水平相比略低。由于TNF诱导IL-1的释放，这可能有助于TNF处理细胞分泌IL-6的净增加，因此TNF反应的轻微减少可能是由于TRAF6中观察到的IL-1反应缺陷所致−/−细胞。

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TRAF6缺陷MEF中的靶基因激活。（A） IL-17未能通过TRAF6缺陷EF增加IL-6的产生。野生型（+/+）或TRAF6缺陷型（−/−）EFs在10 ng/ml mTNF、10 ng/ml IL-1或10 ng/mlmIL-17存在下培养15 h。通过ELISA测定细胞培养液中的IL-6。所示数据为三个独立实验的平均值±SD。（B）IL-17未能增加TRAF6缺陷细胞上ICAM-1的表达。野生型或TRAF6−/−用细胞因子处理细胞，如A所示。通过FACS测定细胞表面ICAM-1蛋白的水平®使用ICAM-1特异的小鼠单克隆抗体进行分析。点线，未经处理的细胞；固体系，细胞因子处理的细胞。

当通过流式细胞术测量ICAM-1细胞表面表达时，获得了类似的结果。所有三种细胞因子均诱导野生型MEF上ICAM-1的表达，TNF治疗后诱导作用最强(图3B） ●●●●。尽管TNF诱导的ICAM-1表达增加在TRAF6中保持不变−/−IL-1和IL-17的作用减弱。这些结果进一步支持了IL-17诱导的应答基因激活是由NF-κB介导的，TRAF-6对IL-17的基因调控活动是不可或缺的。

TRAF6缺乏对IL-17应答的决定作用。

排除TRAF6中观察到的对IL-17无反应的可能性−/−细胞可能是由于IL-17R的表面表达不足，用小鼠IL-17R抗血清对EFs进行免疫染色，并用流式细胞仪进行分析。结果表明TRAF6+/−和TRAF6−/−细胞表达相似水平的IL-17R(图4A） ●●●●。

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瞬时将TRAF6蛋白导入MEF后IL-17R的表面表达及IL-17应答的恢复−/−细胞。（A） TRAF6上IL-17R的测定+/−和TRAF6−/−FACS的MEF®使用小鼠IL-17R多克隆抗体进行分析。点线，小鼠匹配的同种IgG；实线，抗IL-17R。（B） IL-17应答的重建。用RSV-β-gal载体、NF-κB依赖的荧光素酶报告子构建物以及50 ng载体DNA或TRAF6表达质粒转染野生型或TRAF6-deficient EFs。细胞未经处理（开放条）或用25 ng/ml TNF（封闭条）或100 ng/ml IL-17（阴影条）刺激8 h。荧光素酶活性根据β-gal活性测定并归一化。

为了进一步消除TRAF6故障的可能性−/−细胞对IL-17的反应可能是由TRAF6缺陷以外的缺陷引起的，我们测试了IL-17诱导的NF-κB活化是否可以通过向这些细胞中引入外源性TRAF6来恢复。变压器6−/−将NF-κB驱动荧光素酶报告构建物与TRAF6表达质粒或对照载体瞬时转染细胞。用EMSA测量NF-κB活性(图1)，IL-17未能诱导TRAF6中的荧光素酶活性−/−细胞，尽管对TNF的反应似乎正常(图4B） ●●●●。变压器6−/−转染TRAF6表达质粒的细胞对IL-17产生反应，荧光素酶活性增加，与对照细胞相似。

TRAF6与IL-17R的结合。

先前的研究表明，TRAF6可以以两种模式被招募到信号通路中。它可以直接与受体胞内结构域结合，如CD40的信号传导和NF-κB的受体激活剂38 45 46 47或被适配器蛋白招募到途径中，如IL-1、IL-18和LPS的信号传导48 49为了确定TRAF6是否与IL-17R相互作用，我们在293细胞中共同表达Flag标记的IL-17R、IL-1R1或CD40以及Myc标记的TRAF6。与我们早期的发现一致，TRAF6没有与IL-1R1共同免疫沉淀34相反，TRAF6与IL-17R或CD40共同免疫沉淀(图5). 为了确定这种IL-17R–TRAF6相互作用是否对TRAF6特异，同一组标记的受体也与HA标记的TRAF2共表达。TRAF2在CD40的免疫沉淀物中发现，与先前的报道一致47 50但在IL-17R复合物中未检测到。这些观察结果进一步支持TRAF6而非TRAF2参与IL-17信号传导。由于在IL-17R和CD40复合物中检测到类似数量的TRAF6，因此TRAF6可能直接与IL-17R结合，尽管我们不能排除这种相互作用可能由丰富的适配器分子介导的遥远可能性。当获得良好的IL-17R抗体时，将详细讨论TRAF6和IL-17R相互作用的性质。

致谢

我们感谢Dave Goeddel、Mike Rothe和Holger Wesche的有益讨论；Mark Lomaga、Wen-Chen Yeh和Tak W.Mak针对TRAF2-和TRAF6-缺陷的MEF；表达载体为Lei Ling。

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文章来自实验医学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社