巨噬细胞色氨酸分解代谢抑制T细胞增殖

细胞分离和培养。

根据我们的机构审查委员会批准的方案，在适当的知情同意下，通过白细胞分离和逆流离心淘洗从健康志愿者捐赠者中分离出人类外周血单核细胞和淋巴细胞。如前所述，单核细胞（细胞表面标记物纯度>95%）在96个平板中培养(4)使用含10%新生小牛血清（Hyclone）和MCSF（200 U/ml）的RPMI 1640。

如前所述，在共培养中进行T细胞活化研究(4)使用上述介质补充5%的FCS。简言之，莫斯（5×10⁴细胞/孔）在MCSF中分化4-6天，然后自体淋巴细胞（2×10⁵细胞/孔）与丝裂原一起添加。本研究中使用的有丝分裂原为抗CD3单克隆抗体（100 ng/ml，克隆OKT3；美国型培养物收集）和葡萄球菌肠毒素B（5μg/ml；西格玛化学公司。). 两者给出了相同的结果；除非另有规定，否则所示数据来自抗CD3。如前所述，通过标准胸腺嘧啶掺入试验评估T细胞增殖(三). 当在不使用Mös的情况下研究T细胞激活时，添加新鲜自体单核细胞（1:4）作为非抑制性辅助细胞。

添加T细胞48小时后，通过采集上清液，从T细胞和Mös共培养物中制备条件培养基。然后使用条件培养基支持第二轮T细胞激活。在无色氨酸缓冲液中制备有丝分裂原和其他添加剂。

一种化学定义的无血清培养基(19)使用无色氨酸RPMI 1640（选择胺试剂盒；GIBCO巴西雷亚尔)补充胰岛素（10μg/ml）、铁饱和转铁蛋白（5μg/ml）和BSA（1 mg/ml超纯级；游离色氨酸的测量浓度<5 nM）。初步验证实验证实，该培养基中的T细胞增殖无法检测到，但在添加色氨酸时与基于血清的培养基相当。为了研究没有Mös的T细胞，使用吸附在塑料组织培养孔（0.5μg/cm）上的抗CD3单克隆抗体激活T细胞²在碳酸氢盐缓冲液中，pH值为9）加上可溶性抗CD28单克隆抗体（1μg/ml；法尔敏根).

色氨酸和IDO分析。

莫氏菌的色氨酸降解活性反映了IDO表达、色氨酸进入细胞以及翻译后影响酶活性的细胞内条件的多因素组合(20). 因此，当感兴趣的结果是色氨酸缺失时，我们测量了培养上清液中色氨酸随时间的消失率。使用Bloxam和Warren方法测定色氨酸(21). 蛋白质用10%TCA沉淀，用甲醛和FeCl转化为去甲骆驼蓬后测定游离色氨酸_三用荧光光谱法测量反应产物（激发360nm，发射460nm），并与色氨酸的标准制剂进行比较。验证研究表明，该分析在0.1-100μM范围内呈线性，估计阈值灵敏度为0.05μM。

如果需要证明培养物中的色氨酸消耗是由于IDO活性所致，则通过HPLC分析培养上清液中是否存在犬尿氨酸。IDO催化色氨酸氧化为N个-甲酰尿氨酸，在莫斯迅速转化为尿氨酸(22)然后到其他下游代谢物(7). 除了色氨酸加氧酶（仅在肝细胞中发现）外，IDO是唯一一种能够沿犬尿氨酸途径降解色氨酸的酶(8). 因此，培养物中出现的犬尿氨酸是功能性IDO活性的明确证据。然而，由于犬尿氨酸可以转化为其他下游代谢产物，因此该测定不具有定量性。如果需要定量数据，则使用上述色氨酸消耗试验。

HPLC分析由乔治亚医学院分子生物学核心设施进行。通过用1 ml甲醇提取150μl培养上清液制备样品。沉淀的蛋白质通过离心去除，上清液在真空下干燥。将样品重新悬浮在100μl初始流动相（去离子水）中，并将等分样品注入C-18柱（Phenomenex Luna C-18；250×4.6 mm；5μm）。用乙腈在水中的线性梯度洗脱样品（20分钟内0–80%），并在254 nm处测量吸光度。色氨酸、犬尿氨酸和1-甲基色氨酸的标准品在每一次分析中进行测定，以确定保留时间。在初步验证研究中，每个峰的特性和纯度通过质谱进行了确认。

蛋白质合成和氨基酸分析。

将氚化亮氨酸（4μCi/ml）加入24 h后，测量总蛋白质合成。将TCA不溶性蛋白质沉淀并在5%TCA中洗涤三次，并通过液体闪烁计数分析沉淀。在我们的临床新生儿营养实验室中，用HPLC测定培养上清液中的氨基酸浓度。

逆转录聚合酶链反应。

用EDTA和制备的总RNA收获Mös。样本RNA（1μg）用禽成髓细胞增多症病毒（AMV）-RT逆转录，并用以下引物扩增182-bp片段：正向，发布序列的bp 237–254(23); 反向，bp 402-418，跨越外显子3-4。产物形成通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色进行评估。从凝胶中分离PCR产物，并用内部引物扩增以确认特异性。

流式细胞术。

双色FACS^®如前所述，使用直接结合的单克隆抗体进行分析(24). 通过在CD3阳性细胞上门控来鉴定T淋巴细胞，并在第二种颜色中测量CD69、CD25和CD71的表达。

用MCSF衍生Mös表达IDO。

通过将Mös和T细胞与有丝分裂原共培养24小时，以上调色氨酸消耗途径，然后添加新鲜色氨酸并在其消失后，测量色氨酸消除的动力学。如图所示。​图3三A、 色氨酸通过半衰期为2–3小时的一级动力学消除。当色氨酸不受限制时，初始消除速率高达20000 pmol/10⁶细胞/h。这远远超过了细胞代谢产生的消耗量（参见对照，图。​图3三A） ，因为没有活化T细胞的Mös以300±130 pmol/10的速率耗尽色氨酸⁶细胞/小时（7天内获得的累积测量值；未显示数据）。这意味着被激活的莫氏菌消耗色氨酸的大部分是由于一个诱导系统，我们怀疑这是IDO。

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图3

共培养物中色氨酸的消除动力学和MCSF衍生Mös表达IDO。（A） 将MCSF衍生的Mös与自体T细胞培养24 h，无论是否含有（•）(▪) 抗CD3单克隆抗体。然后用新鲜培养基和在所示时间采集的复制培养物上清液替换培养基。色氨酸浓度按材料和方法中所述的分光光度法测定。（B） MCSF源性骨髓中IFN-γ-诱导的IDO mRNA。RT-PCR显示重组IFN-γ激活24小时之前（第4道）和之后（第1-3道）MCSF-衍生Mös中IDO的表达。1–3道中逆转录酶反应的起始RNA分别来自20000、2000和200个激活的摩尔，以及4道中20000个未激活的摩尔。第5栏显示了人类IDO质粒模板的扩增，得到预期的182-bp产物。（C） Mø培养上清液的HPLC分析显示色氨酸的降解和犬尿氨酸的产生。用IFN-γ预激活MCSF衍生的Mös 24h以诱导IDO表达，然后用新鲜培养基替换90:10的废培养基。微量1显示添加新鲜培养基后立即对上清液的分析（时间0）；迹线2显示24小时后的条件培养基。这些实验中的摩尔数保持在较低水平，以便在实验结束时可以检测到一些色氨酸。所示痕量代表洗脱梯度在28%至42%乙腈（7.00–10.50分钟）之间的部分，在此期间出现了犬尿氨酸（K）和色氨酸（T）。峰标签位于纯化标准洗脱点处，洗脱点位于相应样品峰的±3 s范围内。培养基中的化合物在OD时也被吸收₂₅₄（未标记的峰）很容易从色氨酸和犬尿氨酸中分辨出来，T和K峰通过质谱法得到证实（见材料和方法）。实验表明，所用的纯化莫氏液经重组配体活化；在与T细胞和丝裂原共培养中激活Mös时，获得了相同的结果。显示了四个实验中的一个。

与这一发现一致，激活后通过RT-PCR在莫氏中检测到丰富的IDO mRNA，而激活前，IDO信息无法检测到（图。​（图3三B） ●●●●。为了确认IDO活性的存在，对培养上清液中的犬尿氨酸进行了分析。如图所示。​图3三C、 色氨酸的消耗伴随着尿氨酸生成的相应增加，证实了功能性IDO活性的存在。

抑制IDO可防止Mö介导的T细胞抑制。

接下来，我们询问IDO的药物抑制是否可以阻止共培养中T细胞的抑制。据报道，当使用纯化酶进行体外测试时，化合物1-甲基色氨酸是一种有效的IDO活性竞争抑制剂(16,17). 为了确定该试剂是否可以抑制完整莫氏菌中的IDO活性，我们向活化莫氏菌添加了1-甲基色氨酸。如图所示。​图44A、 1-甲基色氨酸的存在显著降低了莫氏菌对色氨酸降解，这伴随着对犬尿氨酸生成的相应抑制（例如，在图中比较24小时后色氨酸与犬尿氨素的比率）。​图3三C） ，证实抑制剂的靶点是IDO。

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图4

抑制IDO活性可防止莫介导的抑制。（A） 1-甲基色氨酸抑制MöIDO酶活性。用IFN-γ激活MCSF衍生的Mös 24小时以诱导IDO表达，然后按照图所示添加新鲜培养基。​图3，三以及1-甲基色氨酸（1 mM）。在添加新鲜培养基（微量1）后立即和24小时后（微量2）通过HPLC分析上清液中的色氨酸（T）和犬尿氨酸（K）。在使用的设置下，1-甲基色氨酸峰（M）超出范围。这些实验的对照培养物（含IFN-γ但不含1-甲基色氨酸的莫氏菌）在24小时时色氨酸均匀减少>90%，而尿氨酸相应增加，如图所示。​图3。三实验表明，所用的纯化莫氏液经重组配体活化；在与T细胞和丝裂原共培养中激活Mös时，获得了相同的结果。（B） 1-甲基色氨酸可防止共培养中的T细胞抑制。将T细胞添加到MCSF衍生的Mös中，并用抗CD3单克隆抗体激活。用不同浓度的1-甲基色氨酸处理复制培养物。72小时后通过胸腺嘧啶掺入法测量增殖。对照组（○）显示，在所用抑制剂的最高浓度下，不含Mös的T细胞增殖（在所示浓度范围内，仅抑制剂对T细胞没有影响）。（C） IDO活性的第二种抑制剂，6-硝基色氨酚，对Mø-介导的T细胞抑制表现出类似的逆转。实验设计如B.（D）中所示，补充高浓度色氨酸可防止莫介导的抑制。在低密度（CC-lo；5×10⁴细胞/孔）和高密度（CC-hi；2×10⁵细胞/孔）和添加5倍正常色氨酸浓度的培养基。在第72小时测量扩散。对照组显示仅由莫氏细胞（M）和T细胞（T）增殖。

从功能上讲，向共培养物中添加1-甲基色氨酸会以剂量依赖的方式消除莫氏抑制T细胞增殖的能力（图。​（图44B） ●●●●。尽管这一发现与IDO在Mø-介导的抑制中的作用一致，但理论上可能表明1-甲基色氨酸本身具有意想不到的免疫刺激作用。为了排除这种可能性，我们合成了第二种色氨酸类似物，6-硝基色氨酸，也有报道称其在体外抑制纯化的IDO酶(17). 如图所示。​图44C、 6-硝基色氨酸还以剂量依赖的方式阻止了莫介导的抑制（图。​（图44C） ●●●●。最后，我们测试了补充色氨酸对抑制作用的影响。如图所示。​图44D、 高水平的色氨酸确实阻止了T细胞的抑制，前提是共培养物中的莫氏菌数量保持较低。在我们通常的莫氏浓度下，事实证明不可能补充足够的色氨酸来克服其快速降解。因此，通过使用两种IDO药物抑制剂和补充色氨酸，我们系统中的T细胞抑制机制似乎是IDO耗尽色氨酸。

T细胞活化的早期信号协同诱导色氨酸降解活性。

莫斯并没有因为与T细胞接触而降解色氨酸。相反，有一个强制性要求，即T细胞试图激活（图。​（图3三A） ●●●●。根据现有研究表明干扰素-γ是IDO的诱导剂(25–27)，我们怀疑来自活化T细胞的IFN-γ可能是IDO诱导的信号。与这一想法一致，在T细胞激活的4-6小时内，共培养物中存在低水平但可检测到的IFN-γ，这与色氨酸降解开始的时间一致（图。​（图55A） ●●●●。针对IFN-γ的中和抗体降低了色氨酸降解活性的诱导（图。​（图55B） 并减少莫氏对T细胞的抑制（图。​（图55C） ，支持IFN-γ在信号通路中的作用。然而，使用重组IFN-γ的剂量-反应关系表明，完全诱导色氨酸降解活性需要相对较高浓度的IFN-γ（图。​（图55D） ●●●●。因此，我们询问是否存在与IFN-γ协同作用的额外信号。CD40L在T细胞激活早期上调，已知与IFN-γ协同作用以激活其他Mö功能(28). 图。​图55D显示，CD40L与IFN-γ发挥了显著的协同作用，将IFN-γ的剂量-反应曲线移动了一到两个数量级，因此在IFN-γ浓度<1 U/ml时开始出现明显的色氨酸消耗。

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图5

IFN-γ和CD40L协同诱导IDO。（A） MCSF衍生的莫氏菌与T细胞和抗CD3单克隆抗体共培养。添加淋巴细胞后，在所示时间采集培养上清液并检测IFN-γ(▪, 左轴）和色氨酸浓度（•，右轴）。（B） 在不同浓度的中和抗干扰素γ抗血清存在下，Mös和T细胞与有丝分裂原共培养。培养上清液中的色氨酸浓度在18小时后测定。这些实验使用低密度的莫氏液，以免掩盖IFN-γ的作用。（C） 如图所示，在一定的播种密度下培养骨髓，然后添加T细胞和抗CD3单克隆抗体(▪) 或没有（•）IFN-γ的中和抗体（100中和U/ml）。IFN-γ抗体降低了Møs抑制T细胞的有效性，尤其是在Møs数量有限的情况下。（D） 将MCSF衍生的莫氏菌与不同浓度的重组IFN-γ培养24小时(▪) 或缺乏重组CD40L（500 ng/ml）。在激活期结束时，对培养上清液进行色氨酸残留浓度分析。单圆点显示色氨酸降解是对CD40L的单独反应。

脱色氨酸对T细胞蛋白质和DNA合成的影响。

我们之前已经证明，在与MCSF衍生Mös共培养中激活的T细胞最初进入细胞周期，但在第一次G1/s转变之前停止(4). 因此，我们询问当T细胞在缺乏色氨酸的情况下被激活时，是否会出现类似的现象。将纯化的T细胞（不含单核细胞或Møs）在不含色氨酸的培养基中培养，使用固定化的抗CD3加抗CD28mAb作为活化刺激物。在这个系统中，在色氨酸存在下刺激的T细胞正常激活，而在没有色氨酸的刺激下，T细胞在进入第一个S期之前被阻止，如DNA合成完全缺失所示（图。​（图6）。6). 这种阻滞不是由于缺乏蛋白质合成，因为没有色氨酸的T细胞成功上调了CD69、CD25（高亲和力IL-2受体）和CD71（转铁蛋白受体）（图。​（图7）7)分泌IL-2和IFN-γ（图。​（图8），8)所有这些都需要新的蛋白质合成(29). 总蛋白合成，以放射性标记亮氨酸在激活的前24小时内的掺入量进行测量，以40–55%的对照组速率继续进行(n个= 3; 见材料和方法），尽管缺乏外源色氨酸。然而，没有进入S阶段。因此，在缺乏外源色氨酸的情况下，T细胞被激活，其阻滞方式与我们之前在共培养中观察到的方式类似。

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图6

在缺乏色氨酸的情况下，T细胞不会进入S期。用固定化抗CD3单克隆抗体和抗CD28在化学定义的无色氨酸介质中激活T细胞(▪) 或在添加25μM色氨酸（•）的相同培养基中。在所示时间，通过胸腺嘧啶掺入分析DNA合成。

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图7

在缺乏色氨酸的T细胞上表达激活标记物。使用固定化抗CD3/CD28（重示踪）在无色氨酸的培养基中激活T细胞，或在相同条件下培养，但不使用抗CD3/CD28（轻示踪）。在所示的时间，两组均被采集并染色，以表达材料和方法中所述的激活标记。

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图8

缺乏色氨酸的T细胞产生IFN-γ和IL-2。在无色氨酸培养基中用抗CD3单克隆抗体激活T细胞(▪) 或在添加25μM色氨酸（•）的相同培养基中，在所示时间测定培养上清液中IFN-γ（A）和IL-2（B）的浓度。

在Mid-G1中鉴定一个色氨酸敏感的停搏点。

早期G1标记的上调表明G1的某些部分是色氨酸非依赖性的。为了验证这一假设，在没有色氨酸的情况下激活T细胞不同时间，然后添加色氨酸并确定进入S期的时间。用色氨酸培养的对照细胞在初次TCR作用后28–32小时可重复进入S期（时间报告为4小时范围，以反映分析的精确度极限）。相比之下，在无色氨酸条件下预激活的T细胞在添加色氨酸后仅需12–16小时即可进入S期（图。​（图99A） ，表明在缺乏色氨酸的情况下发生了通过G1的显著进展。色氨酸敏感的停搏点是稳定的，T细胞在没有色氨酸的情况下存活>72小时，没有丧失活力。当将色氨酸添加到滞留细胞中时，进入S期的时间始终为12–16小时，无论细胞是否在没有色氨酸的情况下预激活了36、48或72小时。这表明阻滞发生在G1的特定点，并且在色氨酸恢复之前，细胞周期中的这个位置一直保持不变。

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图9

进入色氨酸敏感阻滞状态的T细胞保持在G1中期。（A） 使用固定化抗CD3/CD28（•）在无色氨酸的培养基中激活T细胞。在一段时间的预激活后（24–72小时，结果相似；在所示实验中为48小时），添加色氨酸，并确定进入S相的时间（定义为胸腺嘧啶掺入的起始时间）。在没有48小时预培养期的含色氨酸的培养基中激活细胞的复制等分试样(▪). 每种情况下的延迟时间定义为从细胞同时看到色氨酸和抗CD3的点开始S期的时间。箭头显示，由于在缺乏色氨酸的情况下预激活，到S期的延迟时间缩短了12–16小时，这表明G1的这一部分在细胞停止之前完成。在36、48和72小时的七个实验中具有代表性，所有实验都显示到S阶段的延迟时间相同。（B） T细胞被抗CD3/CD28激活(▪) 或缺乏色氨酸。14小时后（根据A估计的假定停止点时间），将色氨酸添加到缺乏色氨酸的培养物中，并确定进入S期。与对照组相比，第14小时获救的T细胞没有延迟。

根据前面的实验，我们估计G1的色氨酸依赖部分为～14小时（计算为静止T细胞到S期的平均时间与预激活细胞到S阶段的时间之差）。为了验证这一估计，我们在激活的最初14小时内剥夺了T细胞的色氨酸，然后在假定的停止点之前添加色氨酸。如图所示。​图99B、 培养物在最初14小时内缺乏色氨酸，进入S期的过程与T细胞始终供应色氨酸的过程相同，支持了G1的初始部分不依赖色氨酸这一假设。在其他实验（未显示）中，延迟添加色氨酸超过14小时会导致进入S期的相应延迟，支持在接近14小时时定位所提议的停止点。

T细胞可以在没有色氨酸的情况下进行细胞分裂。

静止（G0）T细胞需要TCR信号才能进入G1，但随后的细胞周期进展迅速变得与TCR无关（综述见参考文献29). 在我们的系统中，TCR参与后6小时内首次检测到TCR非依赖性细胞分裂，大多数细胞在12小时前发生分裂。如图所示。​图10，10在相关时间段内，无论色氨酸是否存在，这种承诺都是一致的。只要不允许细胞停止生长（即在色氨酸敏感检查点之前提供色氨酸），细胞分裂就可以正常进行。

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图10

在缺乏色氨酸的情况下，T细胞会进行正常的TCR非依赖性激活。在色氨酸存在（亮条）或不存在（暗条）的情况下，将T细胞暴露于固定化的抗CD3/CD28中2–12小时。在显示的时间，细胞被从抗CD3接触中移除。转移后，将色氨酸添加到色氨酸缺乏的培养物中，所有组继续培养至48小时。将细胞转移到其自身的条件培养基中，无需清洗，并始终接受抗CD28抗体。48小时时，通过胸腺嘧啶掺入法对所有组的增殖进行分析。将2小时的时间点（转移后无增殖）作为对照，以确认新培养物中没有携带抗CD3抗体。

作者感谢蔡俊晖（J.-F.Tsai）提供的专家技术援助、T.Stoming（T.Stomin）开发和执行的HPLC分析，以及C.Rossignol和J.Bhatia（J.Bhatia）提供的氨基酸分析。

这项工作得到了美国国立卫生研究院（向D.H.Munn授予K08 HL03395、R21 AI44759和R01 HL60137）的支持，以及卡洛斯和玛格丽特·梅森信托基金的慷慨支持。