《实验医学杂志》。1999年5月3日；189(9): 1383–1390.
Grf40是一个新的Grb2家族成员，通过与SLP-76和LAT的相互作用参与T细胞信号转导
,*‡ ,* ,* ,* ,* ,* ,* ,‡ ,§和*‖
浅田浩史
从*日本东北大学医学院微生物与免疫学系，仙台980-8575；这个‡日本仙台980-8575东北大学发育、衰老与癌症研究所儿科肿瘤学系；这个§宫城县癌症中心研究所，名取981-1293，日本；和‖进化科学与技术核心研究（CREST），日本科技公司，日本东京101-0062
石井直人
从*日本东北大学医学院微生物与免疫学系，仙台980-8575；这个‡日本仙台980-8575东北大学发育、衰老与癌症研究所儿科肿瘤学系；这个§宫城县癌症中心研究所，名取981-1293，日本；和‖进化科学与技术核心研究（CREST），日本科技公司，日本东京101-0062
佐佐木义雄
从*日本东北大学医学院微生物与免疫学系，仙台980-8575；这个‡日本仙台980-8575东北大学发育、衰老与癌症研究所儿科肿瘤学系；这个§宫城县癌症中心研究所，名取981-1293，日本；和‖进化科学与技术核心研究（CREST），日本科学技术公司，日本东京101-0062
Kazuhiro Endo公司
从*日本东北大学医学院微生物与免疫学系，仙台980-8575；这个‡日本仙台980-8575东北大学发育、衰老与癌症研究所儿科肿瘤学系；这个§宫城县癌症中心研究所，名取981-1293，日本；和‖进化科学与技术核心研究（CREST），日本科技公司，日本东京101-0062
Hirotake Kasai公司
从*日本东北大学医学院微生物与免疫学系，仙台980-8575；这个‡日本仙台980-8575东北大学发育、衰老与癌症研究所儿科肿瘤学系；这个§宫城县癌症中心研究所，名取981-1293，日本；和‖进化科学与技术核心研究（CREST），日本科技公司，日本东京101-0062
田中信义
从*日本东北大学医学院微生物与免疫学系，仙台980-8575；这个‡日本仙台980-8575东北大学发育、衰老与癌症研究所儿科肿瘤学系；这个§宫城县癌症中心研究所，名取981-1293，日本；和‖进化科学与技术核心研究（CREST），日本科学技术公司，日本东京101-0062
竹下俊男（Toshikazu Takeshita）
从*日本东北大学医学院微生物与免疫学系，仙台980-8575；这个‡日本仙台980-8575东北大学发育、衰老与癌症研究所儿科肿瘤学系；这个§宫城县癌症中心研究所，名取981-1293，日本；和‖进化科学与技术核心研究（CREST），日本科技公司，日本东京101-0062
筑谷茂（Shigeru Tsuchiya）
从*日本东北大学医学院微生物与免疫学系，仙台980-8575；这个‡日本仙台980-8575东北大学发育、衰老与癌症研究所儿科肿瘤学系；这个§宫城县癌症中心研究所，名取981-1293，日本；和‖进化科学与技术核心研究（CREST），日本科技公司，日本东京101-0062
Tasuke Konno公司
从*日本东北大学医学院微生物与免疫学系，仙台980-8575；这个‡日本仙台980-8575东北大学发育、衰老与癌症研究所儿科肿瘤学系；这个§宫城县癌症中心研究所，名取981-1293，日本；和‖进化科学与技术核心研究（CREST），日本科技公司，日本东京101-0062
杉村和夫
从*日本东北大学医学院微生物与免疫学系，仙台980-8575；这个‡日本仙台980-8575东北大学发育、衰老与癌症研究所儿科肿瘤学系；这个§宫城县癌症中心研究所，名取981-1293，日本；和‖进化科学与技术核心研究（CREST），日本科技公司，日本东京101-0062
从*日本东北大学医学院微生物与免疫学系，仙台980-8575；这个‡日本仙台市东北大学发展、老龄化和癌症研究所儿科肿瘤科980-8575；这个§宫城县癌症中心研究所，名取981-1293，日本；和‖进化科学与技术核心研究（CREST），日本科技公司，日本东京101-0062
1998年10月19日收到；1999年3月1日修订
摘要
我们从分子水平克隆了一个新的Grb2家族成员，命名为Grf40，包含常见的SH3-SH2-SH3基序。Grf40在造血细胞，尤其是T细胞中的表达占主导地位。Grf40通过其SH3结构域与76 kD的含有SH2结构域的白细胞蛋白（SLP-76）的结合比Grb2更紧密。顺便说一句，Grf40可能通过其SH2结构域与T细胞（LAT）激活的连接子结合。Jurkat细胞中野生型Grf40的过度表达诱导了SLP-76依赖性白细胞介素（IL）-2启动子和活化T细胞核因子（NF-AT）在T细胞受体（TCR）刺激下的活化显著增加，而COOH末端SH3缺失的Grf40突变体在IL-2启动子活性方面没有任何可识别的增加。此外，SH2-deleted Grf40突变体显著抑制了这些调节活性，其效果明显强于SH2-deletid Grb2突变体。我们的数据表明，Grf40是一种适配器分子，通过比Grb2与SLP-76和LAT更有效的相互作用参与TCR介导的信号传递。
关键词：Grb2家族，SLP-76，T细胞受体信号，活化T细胞的核因子
刺激TCR启动细胞质蛋白酪氨酸激酶（PTK）的激活1触发下游信号通路，包括钙和Ras依赖性事件，这些事件最终聚集在细胞核上，以刺激T细胞增殖和效应功能所需的基因转录(1–4). PTK激活后，磷脂酶Cγ1被招募到质膜，被认为将钙依赖性途径引入TCR介导的信号事件(5,6). 另一方面，T细胞PTK活化后Ras活化的途径仍存在争议。Grb2是一种包含SH3-SH2-SH3基序的衔接蛋白，通过NH与鸟嘌呤核苷酸交换因子Sos形成复合物2-TCR结扎后SH3末端结构域(7–9). 因此，Grb2–Sos复合物被认为有助于T细胞中Ras的激活，尽管还没有经验证据支持这一观点。
Grb2的COOH末端SH3结构域已被证明与SH2结构域结合，该结构域包含76 kD的白细胞蛋白（SLP-76），这是一种造血细胞特异性衔接蛋白，在TCR刺激后酪氨酸迅速磷酸化(10–12). 靶向SLP-76基因的小鼠由于前TCR信号受损，导致胸腺和外周T细胞双重阳性T细胞缺陷(13). 此外，缺乏SLP-76表达的Jurkat亚系J14细胞在TCR介导的信号传导中表现出钙和Ras依赖性通路的缺陷。该系统中钙依赖途径的缺陷归因于酪氨酸磷酸化和磷脂酶Cγ1的激活在J14细胞中被显著抑制(14). 尽管SLP-76在Ras激活中的确切功能尚不清楚，但有趣的是，SLP-76 Grb2结合位点的缺失消除了SLP-76通过TCR刺激增加IL-2启动子活性的能力(15,16). 此外，SLP-76还与鸟嘌呤核苷酸交换因子家族成员Vav结合，并与SLP-76和Vav共同转染Jurkat细胞，在TCR刺激下诱导活化T细胞核因子（NF-AT）活化的协同增加(17). 这些观察结果表明，SLP-76是TCR信号传导不可或缺的介质。另一方面，Grb2的SH2结构域已被证明在TCR刺激下与接头结合以激活T细胞（LAT）（一种ZAP-70酪氨酸激酶底物），并且缺乏SH2结构域相互作用位点的LAT突变体对TCR刺激的信号传导具有主要的负向作用(18). 因此，Grb2是一种衔接蛋白，被认为与TCR介导的信号转导有关。我们在此提供证据表明，一个名为Grf40的新Grb2家族成员通过其比Grb2与SLP-76和LAT更有效的相互作用参与TCR介导的信号传递。
材料和方法
cDNA的克隆。
通过酵母双杂交筛选人PHA-PBL cDNA文库分离Grf40 cDNA片段(Clontech公司). 诱饵质粒是通过在pAS2-1中插入编码全长人类AMSH蛋白的cDNA片段（我们尚未公布的方案）来构建的(Clontech公司). 诱饵质粒被转化为酵母菌株CG1945(Clontech公司)，然后用人PHA-PBL cDNA文库进行转化。转化菌株在脱落板（Trp−，亮氨酸−，他的−)使用5 mM 3-氨基三唑。阳性菌落随后检测lacZ的表达。一个克隆被确定含有与Grb2同源的序列(7). 为了获得全长cDNA，用上述克隆的800-bp片段作为探针筛选PHA-PBL的λgt11寡核苷酸（dT）引物cDNA文库。10个克隆的序列完全相同，其中两个克隆包含330个氨基酸的开放阅读框。该序列在第一个蛋氨酸密码子上游114 bp处包含一个帧内终止密码子，围绕第一个蛋碱的序列（核苷酸193-195）与有利的Kozak一致序列相匹配。由此分离出编码Grf40的全长cDNA。
质粒构建。
以上述全长cDNA克隆为模板，通过PCR产生Grf40 cDNA，亚克隆到Myc-Tag-pcDNA3.1（+）中，生成质粒序列（EQKLISEEDL）。pMycGrf40-dSH3N、pMycGrf40-dSCH2、pMyc Grf40-dSH3C和pMyc Grf40-DSCH3NC是从NH的SH3结构域中删除的Myc-tagged Grf40突变体2末端（氨基酸位置Met1–专业56)，删除SH2结构域（氨基酸位置Lys57–苏尔149)，COOH末端的SH3结构域（氨基酸位置Ala278–氩气330)和NH的SH3域2和COOH末端（氨基酸位置Met1–专业56和Ala278–氩气330)分别是。pMycGrb2和pMycGrb2-dSH2是Myc标记的野生型Grb2的表达质粒，以及SH2结构域缺失的Grb2突变体（氨基酸位置Trp60–谷氨酸152)分别是。通过PCR产生SLP-76 cDNA并亚克隆到pFLAG-CMV-2(伊士曼柯达公司。)生成质粒pFlagSLP，该质粒具有NH2-终端标记表位标签（DYKDDDDK）。pFlagSLP-157-533、pFlag SLP-217-533、pFlang SLP-241-533和pFlagSRP-281-533是缺失氨基酸位置Met的标记SLP-76突变体的表达质粒1–亮氨酸156，已见1–他的216，已见1–赖氨酸240、和Met1–专业280分别为。pCX-SLP76是克隆到pCXN2载体中的野生型SLP-76的表达质粒(19). 荧光素酶报告子结构如下：pNFATLuc是通过将与人IL-2启动子（−64到+47）连接的NF-AT结合区（人IL-2的−286到−249）的三个串联拷贝插入pGL3-基本载体而构建的(普罗米加) (20); pIL2Luc是通过将人IL-2启动子（−541至+57）插入pGL3-basic载体而构建的(21). pENL是一种β-半乳糖苷酶表达质粒(22). 对所有构建体进行测序，以使用DNA测序仪（型号377；Applied Biosystems，Inc.）进行验证。
细胞培养。
使用的细胞系为人类T细胞系、Jurkat和MOLT-4；人类B细胞系、Daudi、Raji和Ramos；人单核细胞系THP-1；人类嗜酸性细胞系Eol-3；人GM-CSF应答细胞系TF-1；人肺成纤维细胞系WI-26；人类上皮细胞系HeLa；和SV40转化的猴肾细胞系COS7。TF-1维持在添加10%FCS和重组GM-CSF的RPMI 1640培养基中。WI-26和COS7维持在补充有5%FCS的DME中。其他细胞系在添加10%FCS的RPMI 1640中保存。
防抱死制动系统。
本研究中使用了以下抗体：抗CD3εmAb OKT3（美国型培养物收集）；抗磷酸酪氨酸单克隆抗体4G10、抗Myc多克隆抗体和抗LAT抗体（Upstate Biotechnology）；抗磷酸酪氨酸单抗PY-20（ICN生物医学）；抗Myc单克隆抗体（9E10）和抗Grb2抗体（sc-255）(圣克鲁斯生物技术); 抗标记单抗（M2；伊士曼柯达公司。). 用肽（Val）免疫制备抗-Grf40兔抗血清174–专业194)人类Grf40。通过免疫肽（Gly）制备抗SLP-76兔抗血清302–谷氨酸321)人类SLP-76。使用抗B19人细小病毒单克隆抗体（Par1）作为对照单克隆抗体。
免疫沉淀和免疫印迹。
如前所述进行免疫沉淀和免疫印迹(23). 简而言之，用细胞提取缓冲液（1%NP-40，20 mM Tris-HCl[pH7.5]，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM-Na）溶解细胞三VO（旁白）4，2mM PMSF和20μg/ml抑肽酶），并用所示的Abs或抗血清进行免疫沉淀。免疫沉淀物通过SDS-PAGE分离，然后转移到聚偏二氟乙烯过滤器(Millipore公司). 在含有2%BSA和0.1%吐温20的PBS中培养后，用指示的Abs探测过滤器，并使用ECL检测系统进行可视化(阿默沙姆
法玛西亚生物技术公司).
北方印迹法。
如前所述进行Northern印迹分析(24). 简言之，含有poly（a）的多组织Northern印迹+购买了来自各种人体组织的RNA制剂(Clontech公司). 用Grf40和β-actin的放射性标记cDNA片段对其进行探测。使用生物图像分析仪BAS 1500（富士胶片和照片公司）对信号进行分析。
瞬时转染和荧光素酶检测。
用OPTI-MEM I中的指示质粒电穿孔COS7细胞(GIBCO巴西雷亚尔)密度为6×106细胞/700μl/试管，基因脉冲发生器（Bio-Rad Laboratories）设置为1000 V和200μF，然后在转染48 h后进行Western blot分析。对于荧光素酶分析，用2.5μg pENL和指示剂量的pIL2Luc或pNFATLuc以及5×10密度的OPTI-MEM I中SLP-76和Grf40或Grb2的表达质粒对Jurkat细胞进行电穿孔6200 V和950μF条件下，电池/400μl。细胞在37°C下培养24小时，然后用10μg/ml OKT3加50 ng/ml PMA或单独用10μg/ml OKT3刺激8小时。然后在300μl PicaGene ReporterLysis Buffer（Toyo Ink）中对细胞进行裂解，并如前所述检测荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性(25).
结果和讨论
我们之前报道了一种信号转导衔接分子STAM，它与Janus激酶（Jak）2和Jak3相关，并参与IL-2和GM-CSF介导的信号转导(26). 我们最近还克隆了一个cDNA克隆，编码一个新的分子，命名为AMSH，它与STAM结合（我们尚未发表的结果）。为了阐明AMSH的功能意义，我们尝试使用酵母双杂交分析系统鉴定与AMSH相关的分子。从人PHA-PBL cDNA文库中分离出一个全长cDNA克隆。cDNA克隆编码一个与Grb2同源的分子，命名为Grf40（表示40 kD的Grb2家族成员）。Grf40基因的核苷酸序列已保存在GenBank，可从EMBL/GenBank/DDBJ获得，登录号：。{“type”：“entrez-notide”，“attrs”：{“text”：”AF042380“，”term_id“：”3800743“，”term_text“：”AF04 2380“}}AF042380型Grf40的推导氨基酸序列由330个氨基酸残基组成。Grf40的示意结构与Grb2进行了比较(7)和Grap，另一个Grb2家族成员(27,28). NH2-Grf40的COOH末端SH3结构域和中间SH2结构域与Grb2和Grap的结构域高度同源，而唯一的插入区域（氨基酸位置Arg156–氩气277)Grf40中含有脯氨酸/谷氨酰胺丰富的序列，但Grb2和Grap中没有（图。A） ●●●●。这些结果表明Grf40是Grb2家族的一个新成员。
Grf40的示意结构和表达。（A） 将Grf40的示意图结构与Grb2和Grap进行了比较。Grf40的SH3和SH2结构域与Grb2和Grap的氨基酸同源性百分比以其SH3和SH2结构域表示。（B） 10个7用抗Grf40、抗Grb2或免疫前（对照[Cont]）血清对多种人类细胞系的细胞进行免疫沉淀（IP）和免疫印迹（IB）。（C） 对所示的各种人体组织进行Northern印迹分析。这些印迹首先与Grf40探针杂交，然后与β-actin探针再杂交。
用抗Grf40抗体免疫印迹法检测各种人类细胞系的Grf40表达。两种T细胞系MOLT-4和Jurkat的40-kD Grf40呈强阳性表达，两种B细胞系Daudi和Raji呈弱阳性，但其他细胞系，包括B细胞系（Ramos）、，髓系细胞系（THP-1、TF-1和Eol-3）和非造血细胞系（HeLa和WI-26）的这种表达均为阴性（图。B） ●●●●。与Grf40相比，Grb2在所有细胞系中均有明显表达（图。B） ●●●●。对各种人类细胞系和组织的Northern印迹分析显示，在Jurkat、MOLT-4、三种髓细胞系（KU812、K562和M-TAT）和PHA-PBL（数据未显示）以及在人类免疫组织如胸腺、脾脏、小肠和PBL中，有两种3.5和1.5kb的Grf40特异性转录物，而在其他组织中检测到转录物的边缘水平，包括前列腺、睾丸、卵巢、结肠、心脏、大脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏和胰腺（图。C） ●●●●。这些结果表明，与Grb2不同，Grf40主要表达于免疫组织和造血细胞，尤其是T细胞。
由于Grb2已被证明与SLP-76和LAT结合，这两种蛋白分别是TCR介导信号传导所必需的76-和36/38-kD酪氨酸磷酸化蛋白(10,11,18)，我们问自己Grf40是否也与SLP-76和LAT相关。我们在Jurkat细胞中检测到76-和36/38-kD酪氨酸磷酸化蛋白，在TCR与OKT3交联刺激后与Grf40共免疫沉淀（图。A） ●●●●。然后，我们用OKT3刺激Jurkat细胞，确认76-kD和36/38-kD酪氨酸磷酸化蛋白分别为SLP-76和LAT。用抗Grf40抗体对其裂解物进行免疫沉淀，然后用抗LAT、抗-SLP-76或抗-Grf40抗体对免疫沉淀进行免疫印迹。Grf40沉淀SLP-76，与TCR刺激无关，但仅在TCR刺激后沉淀LAT（图。B） ●●●●。这些结果表明Grf40与Jurkat细胞中的SLP-76和LAT相关。为了确定Grf40与SLP-76的结合位点，我们在Grf40和SLP-76不同缺失突变体之间进行了进一步的联合免疫沉淀分析。用Myc标记的野生型Grf40和NH缺失的四个Grf40突变体瞬时转染COS7细胞2-末端SH3结构域（Grf40-dSH3N）、COOH-末端SH3区域（Grf40-dSH3C）、NH2-和COOH末端SH3结构域（Grf40-dSH3NC）或SH2结构域（Grf40-dSH2）。用抗-SLP-76 Ab或抗-Myc mAb免疫沉淀转染的COS7细胞，然后用抗-Mycs mAb或反-SLP-76Ab免疫印迹。野生型Grf40、Grf40-dSH2和Grf40-dSH3N突变体与SLP-76共免疫沉淀，但未测试Grf40.dSH3C和Grf40.dSH3NC突变体（图。C） ●●●●。相反，SLP-76与Grf40-dSH2、Grf40-dSH3N和野生型Grf40共免疫沉淀，但与Grf40.dSH3C和Grf40.dSH3NC突变体无共免疫沉淀（数据未显示）。这些结果表明Grf40的COOH末端SH3结构域是SLP-76的结合位点。接下来，我们利用各种SLP-76突变体确定了Grf40的SLP-76结合位点。将SLP-76的标记野生型和四个突变体与Myc-tagged Grf40一起导入COS7细胞，然后用抗标记抗体和抗Myc抗体进行免疫沉淀和免疫印迹。Myc-tagged Grf40与含有氨基酸位置Glu的SLP-76突变体共免疫沉淀217–专业533，但不包括由氨基酸位置Pro组成的SLP-76突变体241–专业533这些结果表明Grf40结合位点位于氨基酸位置Glu217–赖氨酸240SLP-76（图。D） ●●●●。SLP-76的Grf40结合位点几乎与氨基酸位置Asn重叠224–天冬氨酸244，已显示为Grb2结合位点(15). 另一方面，已证明Grb2与LAT的结合位点是Grb2的SH2结构域，该结构域被认为与磷酸化酪氨酸残基结合(18). 结合这一概念，我们发现LAT是酪氨酸磷酸化的，随后在TCR刺激后与Grf40共免疫沉淀，这表明Grf40的SH2结构域可能是LAT的结合位点。
SLP-76和LAT与Grf40在Jurkat细胞中的共免疫沉淀。用（+）或不用（−）OKT3刺激Jurkat细胞3分钟，并用抗Grf40或免疫前（对照）血清对其裂解物进行免疫沉淀（IP）。用SDS-PAGE分离免疫沉淀物，然后用抗磷酪氨酸单克隆抗体（A）和抗-SLP-76抗血清或抗LAT抗体（B）免疫印迹（IB）。将10μg Myc标记野生型Grf40（野生）或4个Myc标记Grf40突变体（dSH3C、dSH2、dSH3N和dSH3NC）表达质粒与10μg SLP-76表达质粒通过电穿孔瞬时转染COS7细胞，然后培养48 h。用抗-SLP-76或免疫前（对照）血清对其裂解物进行免疫沉淀，然后用抗Myc单克隆抗体或抗-SLP-86抗血清（C）进行免疫印迹。将10μg的标记野生型SLP-76（野生型）表达质粒、4个标记SLP-76突变体（157-533、217-533、241-533和281-533）或空载体（对照）与10μg Myc-tagged Grf40表达质粒通过电穿孔瞬时转染COS7细胞，然后孵育48 h。他们的裂解产物用抗标记单克隆抗体进行免疫沉淀，然后用抗Myc或抗标记单抗（D）进行免疫印迹。
由于Grb2的COOH末端SH3域被证明是SLP-76的结合位点(10,11)，我们检测了Grf40和Grb2与SLP-76之间的竞争性结合能力。将2.5μg Myc-tagged Grf40和Myc-tag Grb2质粒与不同剂量（0–1.0μg）的标记SLP-76质粒联合瞬时转染COS7细胞。将其裂解产物用抗标记单克隆抗体免疫沉淀，然后用抗Myc多克隆抗体免疫印迹。将SLP-76质粒剂量降至0.05μg后，Myc-tagged Grf40与SLP-76的协同免疫沉淀逐渐减少，而Myc标记的Grb2与SLP-76共免疫沉淀仅在1.0μg剂量的SLP-76质粒下可检测到（图。A） ●●●●。通过免疫印迹法对引入的质粒的表达水平进行量化，证实Myc-tagged Grf40和Myc-tag Grb2之间的数量没有显著差异（图。A） ●●●●。这些结果表明，与Grb2相比，Grf40与SLP-76的相关性更强。为了进一步证实这一点，用低剂量的SLP-76质粒（0.2μg）和Myc-Grf40质粒（2.5μg）以及不同剂量的Myc-tagged Grb2质粒（0-10μg）瞬时转染COS7细胞。用抗标记单克隆抗体对其裂解产物进行免疫沉淀，然后用抗Myc多克隆抗体进行免疫印迹。即使在高达10μg质粒剂量的Myc-tagged Grb2共转染时，Myc-taged Grf40与SLP-76的共免疫沉淀仍保持不变（图。B） ●●●●。此外，尽管Myc标记的Grb2的表达增加取决于其质粒剂量，在10μg质粒剂量的Myc标记的Grb2下，其显著高于Grf40，但Myc标记的Grb2与SLP-76没有共免疫沉淀（图。B） ●●●●。这些结果表明，Grf40在与SLP-76的结合方面与Grb2竞争，Grf40-SLP-76的结合亲和力明显高于Grb2。由于SLP-76突变体删除了与Grf40结合位点重叠的Grb2结合位点，因此在TCR刺激下未能增加IL-2启动子活性(15,16)，可能不仅Grb2而且Grf40在SLP-76依赖性IL-2启动子活性增加中起关键作用。
Grf40和Grb2对SLP-76的竞争性结合能力。用指示剂量的pFlagSLP（SLP-76）、2.5μg pMycGrf40（Grf40）和2.5μg的pMycGrb2（Grb2）（A），或0.2μg pFlagSLP、2.5μg/pMycGraf40和指示剂量的pMycGrb2（B）瞬时转染COS7细胞。将细胞孵育48 h，用抗标记单克隆抗体免疫沉淀（IP）其裂解物，然后用抗Myc多克隆抗体或抗标记单抗（顶部和中部）免疫印迹（IB）。用抗Myc单克隆抗体（底部）免疫印迹法定量Myc-tagged Grf40和Myc-tag Grb2的表达水平。
为了说明Grf40在TCR介导的信号传导中的功能重要性，我们使用包含IL-2启动子和NF-AT结合域的报告基因进行荧光素酶分析。野生型Grf40的过度表达不会导致IL-2启动子和NF-AT的基础或TCR介导的激活（数据未显示）。由于Grf40与Jurkat细胞中的SLP-76相互作用，已知SLP-76过度表达可增强TCR介导的IL-2启动子刺激和NF-AT活性(15,16)，我们使用瞬时转染SLP-76的Jurkat细胞来检测Grf40在TCR介导的信号传导中的作用。将野生型Grf40和Grf40-dSH3N突变体转染到过度表达SLP-76的Jurkat细胞中，在OKT3和PMA刺激下，导致IL-2启动子活性显著增加，而与空载体转染相比，转染Grf40-dSH2突变体诱导IL-2启动程序活性显著抑制（图。A） ●●●●。这些结果表明，Grf40-dSH2突变体在TCR刺激中具有显性负效应，表明Grf40的SH2结构域与TCR介导信号的一个基本分子相互作用，这可能是LAT(18). 用OKT3刺激Jurkat细胞进行NF-AT荧光素酶分析也获得了类似的结果（图。B） ●●●●。此外，删除COOH末端SH3结构域（SLP-76的结合位点）的Grf40突变体（Grf40-dSH3C和Grf40-dSH3NC）也失去了增加IL-2启动子活性的能力（图。A） ，表明依赖SLP-76的TCR刺激需要Grf40–SLP-76复合物形成。这些结果表明，Grf40参与了OKT3和PMA介导的IL-2启动子刺激和NF-AT活性的信号传递。
Grf40突变体对TCR介导的IL-2启动子激活和NF-AT活性的影响。向Jurkat细胞转染10μg IL-2-Luc（A）或10μg NF-AT-Luc（B），以及10μg SLP-76和10μg空载体（载体）、Myc-tagged野生型Grf40（野生）或各种Grf40突变体（dSH3N、dSH3C、dSH3NC和dSH2）。用10μg/ml OKT3加50 ng/ml PMA刺激细胞（白色条）或不刺激细胞（黑色条），并检测荧光素酶活性。结果显示，荧光素酶活性的诱导倍数与转染空载体的未刺激细胞的活性相比（～5000相对光单位[RLU]）。这些结果代表了三个可比较的实验。
由于Grb2也被认为参与了TCR介导的信号转导的调节(9)，我们比较了Grf40和Grb2在TCR介导的IL-2启动子活性刺激中的功能意义。将Grf40和Grb2的野生型和SH2缺失突变体与IL-2启动子驱动的荧光素酶构建物联合转染过表达SLP-76的Jurkat细胞。用OKT3加PMA刺激它们，并检测荧光素酶活性。与Grb2-dSH2突变体相比，野生型Grf40的IL-2启动子活性显著增强，但野生型Grb2几乎没有增强，而Grf40-dSH2突变在IL-2荧光素酶分析中显示出显著的显性负效应（图。A） ●●●●。比较Grf40-dSH2和Grb2-dSH2突变体在IL-2荧光素酶检测中的质粒剂量依赖性。在不同质粒剂量下，Grf40-dSH2突变体对荧光素酶活性的抑制作用显著强于Grb2-dSH2突变（图。B） ●●●●。这些结果表明Grf40比Grb2更有效地参与TCR介导的信号传导。这一结论与Grf40与SLP-76的结合亲和力高于Grb2的观察结果相一致。
Grf40-dSH2和Grb2-dSH2对TCR介导的IL-2启动子活性刺激的阻断作用的比较。（A） 将10μg IL-2-Luc、10μg SLP-76和10μg空载体（载体）、Myc-tagged Grf40野生型、Grf40-dSH2、Grb2野生型或Grb2-dSH2转染Jurkat细胞。细胞未受刺激（白色条）或用OKT3加PMA刺激（黑色条）。（B） 向Jurkat细胞转染10μg IL-2-Luc、10μg SLP-76和指示剂量的Grf40-dSH2（正方形）或Grb2-dSH2。这些细胞未被刺激（开放符号）或被OKT3加PMA刺激（填充符号），并检测荧光素酶活性。与转染空载体（～5000 RLU）的未刺激细胞相比，三个独立实验显示荧光素酶活性为平均诱导倍数±SE。
本研究显示Grf40在TCR介导的SLP-76依赖性信号传导中起关键作用。人们可能会考虑Grf40突变体通过改变SLP-76的表达水平在TCR介导的信号传递中发挥作用的可能性。然而，这种可能性可以忽略不计，因为证实pCX-SLP76的表达不受Grf40、Grb2及其突变体在COS7细胞中的瞬时表达的影响（数据未显示）。因此，Grf40与SLP-76和LAT的相互作用被认为对TCR介导的信号传导至关重要。
NH2-已知Grb2的末端SH3结构域是Sos的结合位点，Sos是Ras鸟嘌呤核苷酸交换因子，被认为参与TCR刺激后Ras的活化(9). 我们证实了Grb2与Jurkat细胞中Sos的关联；然而，在这些细胞中无法检测到Grf40和Sos之间的复杂形成（数据未显示）。因此，我们怀疑Grf40不直接调控TCR介导的Ras激活信号。然而，与Grb2相比，Grf40对TCR介导的IL-2启动子和NF-AT的激活作用更为有效，这表明Grf40在TCR-介导的信号传导中起关键作用。在这种情况下，有趣的是，与Grf40相关的SLP-76也与Rac/Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子Vav结合，并且SLP-76和Vav之间的相互作用已被证明在TCR刺激时参与IL-2基因的激活(17). 这些观察提供了一个模型途径，在TCR连接后激活ZAP-70酪氨酸激酶磷酸化LAT(18)，然后绑定到预成型的Grf40–SLP-76复合物并将其招募到ZAP-70(29)，进一步磷酸化SLP-76与Vav相关，导致TCR的下游信号传导。
Northern印迹和免疫印迹分析表明，Grf40主要表达于免疫组织和造血细胞，尤其是T细胞，而Grb2则相反。与Grb2相比，Grf40的这种限制性分布可以反映Grf40更有效地参与TCR介导的信号传导。虽然Grap也被证明对造血细胞和淋巴细胞有特异性(28)，Grap的功能意义尚不清楚。
GRB2L的基因组序列已在GenBank/EMBL/DDBJ中注册（注册号：。{“type”：“entrez-notide”，“attrs”：{“text”：”Z82206“，”term_id“：”2677628“，”term_text“：”Z82 206“}}Z82206号)，包含Grf40的整个序列。由于GRB2L已被定位到人类染色体22q12，Grf40被认为具有相同的染色体位置。此外，与Grf40相同的cDNA克隆被报告为Grap2(30)和人类Gads(31)和他们的小鼠同系物Mona(32)和鼠标Gads(33)提交本文后，也报告了。尽管关于人类Gads的报告显示了与我们的研究相似的结果，但他们没有显示Gads和Grb2之间的任何比较研究。我们这里显示的证据表明，Grf40在TCR介导的信号传导中比Grb2发挥更关键的作用。
致谢
我们感谢H.Onodera博士提供Myc-Tag-pcDNA3.1（+），感谢S.Moffatt博士和L.C.Ndhlovu博士批判性阅读手稿。
这项工作得到了日本科技公司进化科学技术核心研究（CREST）的部分支持；由日本教育、科学、体育和文化部的优先领域科学研究拨款资助；以及由日本科学技术厅特别协调基金提供的赠款。
本文中使用的缩写
| 拉丁美洲 | T细胞活化连接器 |
| NF-AT公司 | 活化T细胞核因子 |
| PTK公司 | 蛋白酪氨酸激酶 |
| SLP-76型 | 含有SH2结构域的76 kD白细胞蛋白 |
| STAM公司 | 信号转导适配器分子 |
工具书类
1Weiss A，Littman DR。淋巴细胞抗原受体的信号转导。单元格。1994;76:263–274.[公共医学][谷歌学者] 2Cantrell D.T细胞抗原受体信号转导途径。免疫学年度回顾。1996;14:259–274.[公共医学][谷歌学者] 三。Wange RL、Samelson LE。复合物：TCR处的信号。免疫。1996;5:197–205.[公共医学][谷歌学者] 4Koretzky GA。Grb2相关蛋白在T细胞激活中的作用。今日免疫学。1997;18:401–406.[公共医学][谷歌学者] 5Sieh M、Batzer A、Schlesinger J、Weiss A.GRB2和磷脂酶Cγ1在T细胞受体刺激后与36至38千道尔顿的磷酸酪氨酸蛋白结合。分子细胞生物学。1994;14:4435–4442. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Motto DG、Musci MA、Ross SE、Koretzky GA。Grb2相关蛋白的酪氨酸磷酸化与T细胞磷脂酶Cγ1激活相关。分子细胞生物学。1996;16:2823–2829. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Lowenstein EJ、Daly RJ、Batzer AG、Li W、Margolis B、Lammers R、Ullrich A、Skolnik EY、Bar-Sagi D、Schlessinger J.SH2和SH3域相关蛋白GRB2将受体酪氨酸激酶与ras信号传导联系起来。单元格。1992;70:431–442.[公共医学][谷歌学者] 8Egan SE、Giddings BW、Brooks MW、Buday L、Sizeland AM、Weinberg RA。Sos-Ras交换蛋白与Grb2的关联涉及酪氨酸激酶信号转导和转化。自然。1993;363:45–51.[公共医学][谷歌学者] 9.Buday L、Egan SE、Rodriguez P、Viciana、Cantrell DA、Downward J。Grb2衔接蛋白、Sos交换因子和36-kDa膜结合酪氨酸磷酸蛋白的复合物与T细胞ras激活有关。生物化学杂志。1994;269:9019–9023.[公共医学][谷歌学者] 10Reif K，Buday L，Downward J，Cantrell DA。T细胞中带有两种蛋白质的适配器分子Grb2复合物的SH3结构域：鸟嘌呤核苷酸交换蛋白Sos和一种75-kDa蛋白，该蛋白是T细胞抗原受体活化酪氨酸激酶的底物。生物化学杂志。1994;269:14081–14087.[公共医学][谷歌学者] 11Jackman JK、Motto DG、Sun Q、Tanemoto M、Turck CW、Peltz GA、Koretzky GA、Findell PR。SLP-76（一种与T细胞Grb2相关的76-kDa酪氨酸磷酸蛋白）的分子克隆。生物化学杂志。1995;270:7029–7032.[公共医学][谷歌学者] 12Wardenburg JB、Fu C、Jackman JK、Flotow H、Wilkinson SE、Williams DH、Johnson R、Kong G、Chan AC、Findell PR。T细胞受体功能需要ZAP-70蛋白酪氨酸激酶对SLP-76进行磷酸化。生物化学杂志。1996;271:19641–19644.[公共医学][谷歌学者] 13Clements JL、Yang B、Ross-Barta SE、Eliason SL、Hrstka RF、Williamson RA、Koretzky GA。正常T细胞发育对白细胞特异性适配蛋白SLP-76的要求。科学。1998;281:416–419.[公共医学][谷歌学者] 14Yablonski D，Kuhne MR，Kadlecek T，Weiss A.SLP-76缺陷T细胞中非受体酪氨酸激酶与PLC-gamm1的解偶联。科学。1998;281:413–416.[公共医学][谷歌学者] 15Motto DG、Ross SE、Wu J、Hendricks-Taylor LR、Koretzky GA。GRB2相关磷蛋白SLP-76在T细胞受体介导的白细胞介素2生成中的意义。《实验医学杂志》。1996;183:1937–1943. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Musci MA、Moto DG、Ross SE、Fang N、Koretzky GA。SLP-76的三个结构域是其在T细胞系中发挥最佳功能所必需的。免疫学杂志。1997;159:1639–1647.[公共医学][谷歌学者] 17Wu J、Motto DG、Koretzky GA、Weiss A.Vav和SLP-76在IL-2基因激活中相互作用和功能合作。免疫。1996;4:593–602.[公共医学][谷歌学者] 18Zhang W、Sloan-Lancaster J、Kitchen J、Trible RP、Samelson LE。LAT：连接T细胞受体和细胞激活的ZAP-70酪氨酸激酶底物。单元格。1998;92:83–92.[公共医学][谷歌学者] 19Niwa H，Yamamura K，Miyazaki J.使用新型真核载体高效选择高效表达转染剂。基因。1991;108:193–199.[公共医学][谷歌学者] 20Northrop JP，Ullman KS，Crabtree GR.活化T细胞（NF-AT）复合物的淋巴特异性核因子的核和细胞质成分的表征。生物化学杂志。1993;268:2917–2923.[公共医学][谷歌学者] 21Lee HJ、Koyano-Nakagawa N、Naito Y、Nishida J、Arai N、Arai-K、Yokota T。cAMP通过涉及小鼠胸腺瘤细胞株EL-4中蛋白激酶A的信号通路，与佛波酯协同激活IL-5启动子。免疫学杂志。1993;151:6135–6142.[公共医学][谷歌学者] 22Ohbo K，Takasawa N，Ishii N，Tanaka N，Nakamura M，Sugamura K。人类白细胞介素2受体γ链基因启动子的功能分析。生物化学杂志。1995;270:7479–7486.[公共医学][谷歌学者] 23Asao H、Sasaki Y、Arita T、Tanaka N、Endo K、Kasai H、Takeshita T、Endoy Y、Fujita T、Sugamura K。Hrs与信号传递接合器分子STAM相关。其对细胞因子诱导的细胞生长的抑制作用。生物化学杂志。1997;272:32785–32791.[公共医学][谷歌学者] 24Asao H、Takesita T、Ishii N、Kumaki S、Nakamura M、Sugamura K。纤维母细胞上功能性白细胞介素2受体复合物的重组：γ链细胞质域参与两种不同的信号通路。美国国家科学院程序。1993;90:4127–4131. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Tanaka N、Abe H、Yagita H、Okumura K、Nakamura M、Sugamura K.Itk是T细胞特异性酪氨酸激酶，是人类T细胞系Jurkat中CD2介导的白细胞介素-2启动子活化所必需的。欧洲免疫学杂志。1997;27:834–841.[公共医学][谷歌学者] 26Takeshita T、Arita T、Higuchi M、Asao H、Endo K、Kuroda H、Tanaka N、Murata K、Ishii N、Sugamura K。STAM是信号转导适配器分子，与Janus激酶相关，参与细胞生长和c-myc诱导的信号传递。免疫。1997;6:449–457.[公共医学][谷歌学者] 27Feng GS，Ouyang YB，Hu DP，Shi ZQ，Gentz R，Ni J.Grap是一种新的SH3-SH2-SH3衔接蛋白，将酪氨酸激酶偶联到Ras通路。生物化学杂志。1996;271:12129–12132.[公共医学][谷歌学者] 28Trub T，Frantz JD，Miyazaki M，Band H，Shoelson SE。T细胞受体信号传导中淋巴限制的类Grb2 SH3-SH2-SH3蛋白的作用。生物化学杂志。1997;272:894–902.[公共医学][谷歌学者] 29Zhang W，Trible RP，Samelson LE。LAT棕榈酰化：在T细胞激活期间，其在膜微域靶向和酪氨酸磷酸化中的基本作用。免疫。1998;9:239–246.[公共医学][谷歌学者] 30邱M，华S，阿格拉瓦尔M，李G，蔡J，陈E，周H，罗Y，刘M。人grap-2的分子克隆和表达，grap-2是一种新的白细胞特异性SH2-和SH3-，包含与gab-1结合的适配器样蛋白。生物化学与生物物理研究委员会。1998;253:443–447.[公共医学][谷歌学者] 31Liu SK、Fang N、Koretzky GA、McGlade CJ。造血特异性适配器蛋白Gads通过与SLP-76和LAT适配器的相互作用在T细胞信号传导中发挥作用。当前生物。1999;9:67–75.[公共医学][谷歌学者] 32Bourette RP、Arnaud S、Myles GM、Blanchet JP、Rohrschneider LR、Mouchiroud G.Mona是一种与巨噬细胞集落刺激因子受体相互作用的新型造血特异性适配器，与单核细胞/巨噬细胞的发育有关。欧洲分子生物学组织（EMBO）J。1998;17:7273–7281. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33Liu SK、McGlade CJ。Gads是一种新的SH2和SH3结构域衔接蛋白，与酪氨酸磷酸化的Shc结合。致癌物。1998;17:3073–3082.[公共医学][谷歌学者] 
