淋巴毒素α/β和肿瘤坏死因子在脾脏B、T细胞区基质细胞表达归巢趋化因子中的作用

摘要

小鼠的遗传学研究已经证实，细胞因子TNF、淋巴毒素α（LTα）、，¹和LTβ以及受体TNFR1和LTβR是脾淋巴细胞正常分隔所必需的(1，2). 在TNF和TNFR1缺陷小鼠中，滤泡树突状细胞（FDC）缺乏，B细胞不能形成滤泡簇，而是出现在T区外围的环状结构中(三——6). 小鼠缺乏LTα，即膜LTα1β2异源三聚体和可溶性LTα3复合物缺乏(7)，表现出明显的表型，包括无淋巴结和派尔斑，边缘区细胞、FDC丢失，脾白髓索正常B/T分离(6，8——10). LTβ^−/−小鼠不能产生结合LTβR的LT膜，但继续表达LTα，表现出类似的表型，只是保留了一些淋巴结，脾脏结构受到的干扰比LTα少^−/−小鼠（11、12；Korner，H.和J.D.Sedgwick，未发表的观察结果）。

在平行的研究中，人们开始了解趋化因子受体和趋化因子在控制淋巴组织内细胞运动中所起的作用。缺乏CXCR5（以前称为Burkitt淋巴瘤受体1[BLR1]）的小鼠，该受体是由成熟B细胞表达的趋化因子受体(13，14)脾脏中缺乏极化卵泡，B细胞在T区边界处呈环状(5). 最近，一种CXCR5配体，称为B淋巴细胞趋化因子（BLC）或B细胞吸引趋化因子-1(15，16)，已发现由淋巴滤泡中的基质细胞组成性表达，并被提议作为B细胞归巢趋化因子(15). 已经确定了另外三种在淋巴组织中组成性表达的趋化因子，它们是静息淋巴细胞的有效引诱剂：基质细胞衍生因子1（SDF1[17-19]）、次级淋巴组织趋化因子（SLC）/6C因子(20——24)和EBV诱导的分子1配体趋化因子（ELC）/巨噬细胞炎症蛋白（MIP）-3β(25——28). SDF1是成熟淋巴细胞的有效引诱剂(19)，尽管其在淋巴组织中的表达模式尚未得到很好的表征。SLC和ELC是相关的趋化因子，它们强烈吸引原始T细胞，而对B细胞的吸引较弱。SLC由淋巴结和派耶斑块中的高内皮小静脉（HEVs）以及脾脏T区、淋巴结和派耶斑块中的基质细胞表达(21，22，24)，而ELC由T区DC表示(27). SLC和ELC的强趋化活性及其分区表达模式导致这些分子在淋巴细胞归巢至外周淋巴组织T区中发挥作用(21，27).

TNF-和CXCR5-缺陷小鼠脾脏B细胞分布的显著相似破坏表明，这些分子以共同的途径作用，维持卵泡组织(29). LTα/β缺陷小鼠的脾脏受到更严重的破坏，这表明LT可能在帮助组织细胞进入滤泡和T区的分子上游发挥作用。在此，我们报告了CXCR5配体BLC在TNF-、TNFR1-、LTα-和LTβ-缺陷小鼠中的表达显著降低。SLC和ELC的表达也减少，而SDF1不受影响。可溶性LTβR-Ig或抗LTβ抗体对成人LTα1β2功能的拮抗作用导致BLC和SLC表达降低。我们还观察到，除了滤泡基质细胞缺陷外，LT和TNF缺陷小鼠的T区基质细胞也受到破坏。为了确定哪些细胞类型可能是上调BLC表达所需的LTα/β和TNF的来源，对缺乏造血细胞亚群的小鼠进行了研究。缺乏B细胞（也缺乏滤泡基质细胞）的小鼠BLC表达降低，而T细胞和边缘区巨噬细胞（MZM）缺乏的小鼠则不受影响。这些发现表明，TNF和膜LTα/β异源三聚体传递基质细胞发育和功能所需的信号，基质细胞产生对淋巴组织腔室正常组织必不可少的趋化因子。

材料和方法

结果

TNFR1-、TNF-、LTα-和LTβ-缺陷小鼠中趋化因子表达降低。

为了探讨TNF/TNFR1和CXCR5是否在卵泡组织的共同途径中发挥作用，我们通过流式细胞术测量了TNFR1和TNF缺陷小鼠的CXCR5表达。TNF和TNFR1缺陷小鼠的脾B细胞表达CXCR5，与野生型对照组相比略有升高（39；Ansel、K.M.和J.G.Cyster，数据未显示）。CXCR5表达增加似乎不太可能解释TNF或TNFR1缺陷动物中B细胞组织的破坏，但可能是正常参与和下调CXCR5的配体表达减少所致。因此，我们通过测量TNF和TNFR1缺陷小鼠脾脏中BLC RNA的水平来测试TNF/TNFR1是否调节CXCR5配体的表达（图。​（图1，1、A和B）。与野生型同窝小鼠相比，这两种突变小鼠的BLC表达减少了约三倍。TNFR1缺陷脾脏的原位杂交分析证实滤泡基质细胞BLC表达降低（图。​（图11C） ●●●●。缺乏LTα或LTβ的动物也缺乏卵泡和卵泡基质细胞，尽管缺乏MZM和严重破坏的B/T边界使这些小鼠的脾脏表型不同。与TNF缺乏小鼠相比，LTα和LTβ缺乏动物脾脏中BLC表达的减少更为严重（图。​（图1，1，A和B），残留表达太低，无法在原位杂交分析中检测到（图。​（图11C） ●●●●。在同时缺乏LTα和TNF的小鼠中，BLC表达降低到与LTα单一突变体相似的程度（图。​（图1，1，A和B），这与这些细胞因子在导致BLC表达的共同途径中发挥作用的可能性一致。

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图1

TNF/TNFR1-和LTα/β-缺陷小鼠脾脏中淋巴组织趋化因子表达减少。（A） 对从指定小鼠脾组织中分离的总RNA进行Northern blot分析，并检测BLC、SLC、ELC和SDF1的表达。通过与EF-1α杂交来控制RNA负载。对于SDF1，SDF1α和SDF1β的杂交信号（参考18)类似，显示SDF1α的信号。WT，野生型。（B） 校正相应EF-1α值的RNA负载差异后，通过A和其他印迹中显示的Northern印迹的磷光成像仪分析确定的相对趋化因子mRNA水平。单个小鼠的数据显示为开放圆圈，平均值显示为阴影条。（C） 原位杂交分析野生型、TNFR1缺陷型或LTα缺陷型小鼠脾脏中BLC和SLC的表达。原始放大倍数：×10。ca，中央小动脉；F、 卵泡；T、 T区。BLC和SLC野生型控制面板中的插图显示了表达趋化因子的基质细胞的形态（原始放大倍数：×40）。

细胞因子和细胞因子受体缺陷动物的脾脏T区组织也被破坏，从TNF和TNFR1缺陷小鼠的细微变化到LTα、LTβ和LTα/TNF双突变小鼠的几乎完全丧失T区。为了确定LTα/β和TNF是否也在导致T区趋化因子表达的途径中发挥作用，我们测量了T区产生的相关T细胞吸引趋化因子SLC和ELC的表达。我们还测量了更广泛分布的趋化因子SDF1的表达，SDF1是B细胞和T细胞的有效引诱剂。SLC在TNFR1和TNF缺乏的动物中的表达减少了约2倍，在LTα、LTβ和LTα/TNF双突变的动物中表达减少了20倍以上（图。​（图1，1、A和B）。通过原位杂交分析，表达SLC的基质细胞网络在TNFR1突变小鼠中仍然可见，但在LTα缺陷动物中无法检测到（图。​（图11C） ●●●●。ELC的表达也在所有突变株中降低，尽管比SLC严重（图。​（图1，1、A和B）。相比之下，SDF1的表达在任何突变动物中都没有显著降低（图。​（图1，1，A和B），表明BLC、SLC和ELC的减少与生理相关，而不是趋化因子基因表达总体下降的结果。需要强调的是，本研究中使用的TNFR1突变体和四种细胞因子突变体（6、30、32；Korner，H.、D.S.Rimiton、F.A.Lemckert和J.D.Sedgwick，未发表）均是使用C57BL/6 ES细胞生成的，并维持在C57BL-6背景下，使得我们观察到的趋化因子表达的任何差异都不太可能是由于相关的遗传差异。因此，这些实验表明，脾中BLC、SLC和ELC的正常表达需要TNF/TNFR1和LTα/β。

用LTα/β拮抗剂治疗成年小鼠可降低趋化因子的表达。

为了确定BLC和SLC表达中对LTα和LTβ的需求是发育性的还是结构性的，我们用可溶性LTβR-Ig融合蛋白治疗成年小鼠不同时间段(8，40)LTα1β2的拮抗剂和相关分子LIGHT(41). 对照小鼠用LFA3-Ig融合蛋白治疗相同时间(8). 在LTβR-Ig治疗1周后，与对照组相比，脾脏BLC表达降低了两倍（图。​（图22A） ●●●●。BLC表达在治疗2周后进一步减少，治疗3周或4周后没有加重（图。​（图22A） ●●●●。2周的治疗还导致肠系膜淋巴结中BLC水平降低（图。​（图22B） ●●●●。给予LTβR-Ig的小鼠的脾脏和肠系膜淋巴结中SLC的表达降低，尽管抑制程度不同，且比BLC的降低程度轻（图。​（图2，2、A和B）。为了区分LIGHT和LTα1β2的可能作用，用特异性阻断LTα/β异源三聚体功能的抗LTβ单克隆抗体治疗小鼠1或2周(37，40). 脾脏RNA分析显示，抗LTβ单克隆抗体治疗2周后，BLC和SLC表达均降低（图。​（图22A） ●●●●。这些结果确立了LTα1β2在维持正常趋化因子表达中的关键作用。尽管与LTβR-Ig治疗相比，抗体治疗的效果较小（图。​（图22A） 提示LIGHT也可能起作用，正如体外研究中观察到的那样，mAb导致LTα1β2功能的不完全抑制，这同样可以解释结果(40). 为了进一步探讨在突变小鼠中发现的趋化因子缺乏与滤泡组织丢失之间的关系，对LTβR-Ig处理小鼠的脾脏切片进行B细胞标记物、FDC和边缘区标记物染色。如前所述(36)治疗1周后，粘膜寻址蛋白细胞黏附分子（MAdCAM）-1和FDC标记物的表达降低，2周后检测不到，而边缘嗜金属巨噬细胞（MMM）标记物MOMA1的丢失更为缓慢（数据未显示）。治疗1周后，还观察到B细胞滤泡组织的变化（图。​（图22C） 治疗2周后达到最大值（图。​（图22C） 与BLC表达减少平行。这些结果确立了LTα1β2在维持BLC和SLC正常水平方面的构成要求。与LTα相比，经LTβR-Ig治疗的小鼠BLC和SLC表达的下降更为轻微^−/−或LTβ^−/−小鼠可以反映出LTα1β2功能的不完全阻断，但也与LTα1α2在发育中的作用一致，这种作用在成年小鼠中不会持续。

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图2

经LTα1β2拮抗剂治疗的小鼠BLC表达降低。（A） 通过Northern blot和Phosphor Imager分析，对用LTβR-Ig（100μg/wk，i.p.）或仓鼠抗LTβmAb（200μg/wkk，i.p.）治疗指定时间段的小鼠的总脾脏RNA，测定相对趋化因子mRNA水平。LTβR-Ig治疗的对照小鼠用等量的LFA3-Ig治疗，mAb治疗的对照鼠用仓鼠抗KLH单克隆抗体治疗。使用EF-1α探针获得的值校正每个样本的RNA负载差异。通过将每只治疗小鼠的校正值除以该时间点对照组的平均校正值，计算趋化因子表达在对照组中的百分比。单个小鼠的数据显示为实心圆圈，平均值显示为阴影条。（B） 用LTβR-Ig（100μg/wk，i.p.）治疗2周的动物脾脏和肠系膜淋巴结中的相对趋化因子mRNA水平。计算方法如A.（C）LTβR-Ig治疗小鼠卵泡组织破坏。将用LFA3-Ig处理2周或用LTβR-Ig处理1或2周的小鼠的脾脏组织切片并用B220（深灰色）染色以检测B细胞。

滤泡和T区TNF-和LTα1β2依赖性基质细胞。

上述实验表明，脾脏基质细胞正常表达趋化因子BLC和SLC需要TNF、LTα和LTβ。几项研究已经证实，TNF-、LTα和LTβ缺陷小鼠的FDCs组织被破坏(1)，表明正常产生BLC的细胞类型可能被破坏。然而，FDC组织的破坏不能解释SLC表达的减少，因为FDC不会延伸到T区。为了测试是否可以在T区基质细胞中检测到除了SLC表达降低之外的变化，我们检测了BP-3的表达，它是T区和滤泡中基质细胞广泛网络的标记(38，42). 引人注目的是，BP-3网络⁺TNF-和TNFR1-缺陷小鼠的B区和T区的细胞均显著减少（图。​（图3，三在LTα和LTβ缺陷小鼠中检测不到，但偶尔观察到少量形态改变的细胞除外（图。​（图3）。三). TNF-和LTα/β-缺陷型脾脏中表达BP-3的基质细胞的破坏似乎比淋巴细胞缺乏型（RAG-1）更严重^−/−)脾（图。​（图3）。三). 用LTβR-Ig或抗LTβ抗体治疗1周后，T区和卵泡中的BP-3表达也显著中断，治疗2周后几乎检测不到（图。​（图3，三和数据未显示）。这段时间的治疗也足以破坏MAdCAM-1和FDC标记的染色(36，43). 为了确定滤泡中BP-3表达细胞与之前定义为TNF-和LTα及β依赖性细胞类型之间的关系，对野生型小鼠切片进行MAdCAM-1或CR1（CD35）和BP-3双重染色（图。​（图44A） ●●●●。外卵泡中的BP-3表达细胞似乎排列在边缘窦，在某些情况下，这些细胞与MAdCAM-1共同存在（图。​（图44A） ●●●●。许多BP-3⁺位于卵泡中心的细胞与CD35共染（图。​（图44A） ，而BP-3⁺滤泡其他部位的细胞，尤其是边缘窦附近的细胞，CD35低或阴性（图。​（图44A） ●●●●。因此，表达BP-3的基质细胞群包括T区基质细胞（图。​（图3三和图。​图44A） FDC标记物低或阴性的FDC、边缘窦衬里细胞和滤泡基质细胞（图。​（图44A） ●●●●。突变小鼠中BP-3表达的严重中断，以及BLC和SLC表达的减少和FDC的丢失，表明TNF、LTα和LTβ在诱导和维持淋巴组织T区和B区基质细胞完整性方面发挥着广泛的作用。

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图3

阻断TNF-、TNFR1-、LTα-和LTβ-缺陷小鼠和LTβR-Ig治疗小鼠滤泡和T区BP-3的表达。对所示突变小鼠或经可溶性LTβR-Ig治疗1-2周的小鼠或野生型对照小鼠的脾组织进行切片和染色，以检测T细胞（抗CD4和抗CD8的组合；棕色）和BP-3（红色）。RAG-1中的CD4和CD8染色^−/−脾脏不代表T细胞，因为没有CD3染色（未显示）。CA，中央小动脉；F、 卵泡；T、 T区。原始放大倍数：×10。

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图4

BP-3的成本⁺基质细胞亚群与MAdCAM-1和CD35（CR1）、正常滤泡组织和BP-3表达操作/操作老鼠。（A） 对野生型小鼠的脾组织进行切片和染色，以检测MAdCAM-1（棕色）和BP-3（黑色；左侧和中间面板），或CD35（棕色）以及BP-3（红色；右侧面板）。中央面板中的箭头表示MAdCAM-1和BP-3双重染色的细胞。浅棕色CD35染色对应于CD35^高的边缘区B细胞和CD35^低的滤泡B细胞。原始放大倍数：如图所示，为×10、×20或×40。（B） 野生型脾组织（左）或操作/操作（中央和右侧）小鼠切片并染色以检测：IgM（棕色）和MOMA1（红色；左侧和中央），或CD4和CD8（棕色）以及BP-3（红色；右侧）。注意缺少MOMA1⁺MMM染色操作/操作突变体。原始放大倍数：×10。CA，中央小动脉；F、 卵泡；T、 T区。

BLC生产不需要MZM。

除了FDC中的缺陷外，MAdCAM-1⁺单元格和BP-3⁺细胞、LTα和LTβ缺陷小鼠也缺乏MZM和MMM(1，11，12). 为了测试LTα中这些巨噬细胞群缺乏的可能性^−/−和LTβ^−/−小鼠BLC表达显著降低，滤泡组织丢失，我们从以下方面对脾脏进行了表征操作/操作小鼠，由于集落刺激因子1基因突变导致MMM和MZM缺乏(44，45). B细胞滤泡的组织在操作/操作脾脏（图。​（图44B） BLC的表达没有减少（图。​（图5）。5). BP-3、MAdCAM-1和CD35的表达也没有受到干扰（图。​（图44B、 和数据未显示）。这些发现表明，MZM和MMM对BLC的构成性生成没有显著贡献，并且还证明，这些细胞不需要作为TNF或LTα1β2的来源来维持BLC的表达或卵泡组织。

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图5

BLC表达的MZM独立性和B淋巴细胞依赖性。（A） 猪脾组织总RNA的Northern blot分析操作/操作，TCR-β^−/−δ^−/−（TCR）^−/−)，μMT（BCR^−/−)和RAG-1^−/−小鼠，检测BLC和EF-1α的表达。（B） 校正相应EF-1α值的RNA负载差异后，通过A和其他印迹中显示的Northern印迹的磷光成像仪分析确定的相对趋化因子mRNA水平。

讨论

这些研究为TNF和LTα/β促进脾白髓索淋巴细胞正常分隔的机制提供了新的见解。研究结果扩展了先前定义的滤泡基质细胞发育和功能中对TNF和LTα/β的需求，也包括脾脏T区的基质细胞。结果表明，依赖LTα/β和TNF的基质细胞的一个关键功能是生成化学因子，这些化学因子强烈吸引静止的淋巴细胞，并表明这些化学因子与基质的其他性质一起起作用，将细胞分隔成滤泡和T区。

趋化因子受体CXCR5由所有成熟B细胞表达，是唯一已知的BLC受体，BLC是静止B细胞的有效引诱剂(13，15，16). 因为CXCR5的丢失足以破坏脾滤泡的组织(5)有理由认为，TNF-、TNFR1-、LTα-和LTβ-缺陷小鼠BLC表达的大幅降低直接导致了这些动物脾脏滤泡组织的破坏。TNF-缺乏小鼠的淋巴结和在某些条件下LT-缺乏小鼠淋巴结中也无法形成极化卵泡(6，11，12，37，49). 经LTβR-Ig处理的小鼠肠系膜淋巴结中BLC表达降低的发现表明，LTα/β在指导淋巴结中的BLC表达中起作用。然而，BLC是否有助于B细胞组织进入淋巴结滤泡目前尚不清楚，因为CXCR5似乎不需要(5).

SLC和ELC都通过CCR7刺激细胞，CCR7是T和B淋巴细胞表达的受体，这些趋化因子是迄今为止所描述的T细胞最有效的引诱剂(21，25，27，50). 我们认为，LTα/β缺陷小鼠T区SLC表达的严重降低直接导致了这些动物正常T细胞分区的丧失。成熟树突状细胞上调CCR7，并被建议迁移至淋巴组织以应对CCR7配体(51)，使得SLC的减少也可能导致成熟DC在T区的积累减少。与这种可能性相一致，LTα水平降低的小鼠淋巴结中的DC比对照组少三倍(52)我们观察到LTα缺陷小鼠脾脏的DC频率也有类似的下降（我们的未发表的观察结果）。DC积聚减少可能至少部分是ELC表达减少的原因，ELC是一种由T区DC产生的趋化因子(27). ELC水平降低可能加剧SLC缺乏的影响，并导致T区组织的丧失。TNF和TNFR1也是SLC和ELC最大表达所必需的。然而，缺乏TNF或TNFR1的小鼠确实继续表达大量SLC和ELC，这与这些突变动物中相对未受影响的T区组织一致(三，4，6，53). 与TNFR1缺乏小鼠相比，TNF-缺乏小鼠中趋化因子表达的普遍减少不应归因于背景基因效应，因为所有动物都是在C57BL/6背景下生成的；更可能的是，TNFR2传递一些趋化因子表达所必需的TNF信号。支持这种可能性的是，在TNFR2缺乏的小鼠中，Langerhans细胞向淋巴结的迁移受到抑制(54). 有趣的是，在对几个被安置在传统动物设施中的TNFR1缺陷小鼠进行分析的过程中，我们发现，尽管BLC和SLC水平仍然降低，但ELC表达与野生型对照组相同（我们未发表的观察结果）。这些观察结果与其他发现类似，表明TNF在静息状态下的一些非冗余功能可以在免疫反应期间被克服(43).

LT和TNF缺乏小鼠中FDCs的缺乏已得到很好的表征(1). 超微结构研究表明，FDC是更广泛的滤泡基质细胞网络的一部分(55)，并使用分子BP-3作为标记物，可以表明这种更广泛的基质细胞网络也依赖于LT和TNF（见图。​图3）。三). 优雅的骨髓嵌合体和过继移植实验已经证实，FDC的发育需要滤泡基质中TNFR1和LTβR的表达以及造血细胞特别是B细胞中细胞因子（LT和TNF）的表达(39，46——48). B细胞在BLC最大表达中的必要性（见图。​图5）5)与这些结果一致，并表明存在反馈回路，有助于使产生BLC的滤泡基质细胞的数量与B细胞的数量成比例。与B细胞缺乏动物相比，LTα和LTβ缺乏小鼠的BLC表达更为降低，这与研究表明B细胞不能成为卵泡形成的LTα/β的唯一来源相一致(47，48). 也许表达LTα/β的CD4⁺CD3（CD3）⁻早期进入淋巴组织的细胞(56)诱导基质细胞表达BLC。T区基质细胞的发育要求不如FDC的发育要求明确，但我们的结果表明它们在TNF和LTα/β依赖性方面相似。目前正在进行实验，以确定T细胞、B细胞或其他细胞类型是否必须表达TNF或LTα/β才能诱导正常SLC表达。在这个阶段，尚无法确定LT和TNF是否直接诱导趋化因子表达，或者它们是否在上游发挥作用，诱导和维持趋化因子表现的基质细胞的发育和生存能力。尽管用可溶性LTβR-Ig治疗成年小鼠会在1周内导致BLC和SLC的表达降低，但治疗也会导致基质细胞的快速破坏，如各种标记物所定义的（36；见图。​图3）。三). 未来的研究必须更详细地定义表达BLC和SLC的LT和TNF依赖性基质细胞的亚群，并描述控制趋化因子表达的信号通路。

本报告中的研究确定了LTα/β在促进脾脏淋巴区表达趋化因子的基质细胞功能方面的主要作用，而TNF的作用较小但很重要。对LTβR-Ig治疗小鼠淋巴结的分析提供了初步证据，证明LTα/β也是淋巴结中正常趋化因子表达所必需的。考虑到所有外周淋巴组织正常组织对LTα/β和TNF的需求，以及外源性表达的LTα促进B和T淋巴细胞在淋巴聚集物中积聚的能力(57)似乎LTα/β和TNF在调节淋巴组织趋化因子表达中发挥广泛作用。卵泡和T区样结构中细胞在非淋巴样部位的积聚也是几种人类疾病的典型特征，包括类风湿关节炎和I型糖尿病，局部产生的LT和TNF诱导表达BLC和SLC的基质细胞发育的可能性值得研究。

致谢

本文中使用的缩写

脚注

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