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细胞生物学杂志。2001年5月14日；153(4): 881–888.
数字对象标识：10.1083/jcb.153.4.881
预防性维修识别码：PMC2192381型
PMID：11352946

新生局灶性粘连是迁移成纤维细胞产生强大推动力的原因

凯伦·贝宁戈,一 迈卡·登博,b条 伊琳娜·卡维琳娜,c（c） J.维克托·斯莫尔,c（c）和王玉立一
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摘要

成纤维细胞迁移涉及与底层基质的复杂机械相互作用。尽管几十年来人们一直在研究焦点粘连处的紧密基底接触，但焦点粘连在力传递中的作用仍不清楚。为了解决这个问题，我们绘制了表达绿色荧光蛋白（GFP）-酶蛋白的成纤维细胞产生的牵引应激。令人惊讶的是，局部粘连的总体分布仅部分类似于牵引应力的分布。此外，详细的分析表明，前缘附近微弱的小粘连传递强大的推进力，而大的、明亮的、成熟的焦点粘连则施加较弱的力。这种反向关系在运动细胞的前缘是唯一的，在后缘或静止细胞中没有观察到。此外，延时分析表明，在局灶性粘连出现后不久，牵引力减小，而zyxin的大小和浓度增加。随着病灶粘连的成熟，结构、蛋白质含量或磷酸化的变化可能导致病灶粘连改变其功能，从强大的推进力传递到被动锚定装置，以维持扩散细胞形态。

关键词：局部粘连、细胞运动、细胞粘附分子、肌动球蛋白、荧光显微镜

介绍

细胞迁移在许多生物事件中扮演着重要角色，包括胚胎发育、伤口愈合、免疫反应和癌症转移(Martin 1997年；布雷2001). 尽管人们普遍认为该过程涉及细胞和底层基质之间复杂的机械相互作用(Lauffenberger和Horwitz，1996年；Elson等人，1997年；Galbraith和Sheetz 1998年；Sheetz等人，1998年)对于这些力的来源以及它们在定向迁移过程中是如何协调的，我们知之甚少。长期以来，对干涉反射显微镜（IRM）的研究表明，许多培养的细胞在离基质30 nm以内的地方建立了离散的接触位点——局灶性粘连(阿伯克龙比和邓恩1975；Izzard和Lochner 1976年). 通过整合素和肌动蛋白细胞骨架与细胞外基质的结合，局部粘连构成潜在的焦点，收缩力作用于基底(伯里奇和科尔扎诺夫斯卡·沃德尼卡1995；宫本茂等人，1995年；Schoenwaelder and Burridge 1999年)。

虽然很明显，焦点粘连参与将细胞锚定在基底上，但对于可能通过这些结构传递以推动定向运动的主动收缩力知之甚少。一个特别有趣的问题是，在成纤维细胞迁移过程中，必须协调数百个局部粘连的机械相互作用，以有效地保持迁移方向和细胞形态。为了解决这个问题，关键是要绘制迁移的成纤维细胞下的动态局灶性粘连图和细胞对基底施加的牵引力图。现在，我们通过结合绘图牵引力和绿色荧光蛋白（GFP）技术的最新发展，实现了这一目标。

迁移细胞施加的机械力的输出可以在弹性基底上检测到。起皱硅胶板的早期应用是检测力的一种粗略方法，但提供的定量信息很少或根本没有(Harris等人，1980年；伯顿和泰勒1997). 技术的改进，主要是由于将珠子嵌入到柔性基底中，从而允许通过大规模矩阵计算量化力，将基底变形图（检测为局部珠子运动）转换为牵引应力图（单位面积的力；Oliver等人，1998年；Dembo和Wang 1999). 为了在1分钟内以时间分辨率提供牵引应力大小的图像或电影，该技术已进一步改进为显微镜形式(Munevar等人，2001年). 我们应用这种方法解决了几个重要问题。首先，我们询问是否可以在焦点粘连处检测到强大的推进力，以及较大的焦点粘连是否会产生更强的牵引力。其次，我们分析了在细胞迁移过程中，不同区域的焦点粘连所施加的力是如何协调的：具体来说，是所有的焦点粘着都以类似的方式施加力，还是粘着的一个子集负责细胞迁移。我们的结果表明，前缘的小的、新生的局灶性粘连施加瞬态力使细胞向前移动，而成熟的局灶粘连主要起到锚定基底的作用。这种策略可以使成纤维细胞高效而有反应地迁移，而无需在粘附病灶之间进行复杂的机械输出协调。

材料和方法

细胞培养与免疫荧光

用增强的GFP-zyxin稳定转染金鱼鳍成纤维细胞（CAR，CCL71；美国型培养物收藏），并按照前面所述进行维护(Kaverina等人，1999年). 对于paxillin和vinculin免疫荧光，细胞被镀在胶原蛋白涂层的玻璃盖上，并按照前面所述进行处理(Pelham和Wang 1997,Pelham和Wang 1999)使用来自Sigma-Aldrich的抗体。

聚丙烯酰胺基板的制备

制备柔性聚丙烯酰胺基材，并用I型胶原涂覆，如下所述Wang和Pelham 1998（a）使用浓度为5%的丙烯酰胺和0.08%的双丙烯酰胺；（b）荧光乳胶珠的浓度增加6.25倍，以获得更高密度的变形载体。基底的杨氏模量为2.4×104牛顿/米2，按照我们之前的研究进行测量(Lo等人，2000年). 这种灵活性足够高，可以可靠地测定牵引引起的变形，但不会像以前报道的那样，在较软的表面上引起细胞形态或生长的剧烈变化(Pelham和Wang 1997；Wang等人，2000年)。

显微镜

用Axiovert 100TV显微镜（卡尔蔡司公司）观察聚丙烯酰胺基底上的细胞。采用尼康60×Plan-Apo水浸物镜克服聚丙烯酰胺基质引入的球差。使用优化的GFP过滤装置检测GFP-zyxin，使用TRITC过滤装置（Chroma Technologies）检测红色荧光珠。使用100W石英卤素灯进行外照射，以尽量减少对电池的辐射损伤。使用带有EEV57背光芯片和ST133控制器（Roper Scientific）的冷却CCD相机采集荧光图像，间隔1–2分钟，持续30–60分钟。相机上的每个像素的图像面积为0.2×0.2μm。在记录结束时，用微针将细胞取出，以便在无细胞牵引力的情况下记录珠子的分布。通过从荧光滤光片上拆除发射滤光片，并减小外照射场光阑的尺寸，对玻璃盖玻片上的固定细胞进行IRM。

牵引应力计算及蒙特卡罗模拟

牵引应力的测定如前所述(Dembo和Wang 1999；Munevar等人，2001年). 简而言之，通过比较细胞存在和不存在时嵌入珠的分布，将基底的变形确定为载体矩阵。以每2.25μm一个的密度生成载体2，其中沿x或y方向的变形密度至少为两个像素，每9μm一个像素2其他地方。然后将细胞的投影面积分成中心距为1-2μm的小四边形。每个四边形中心的牵引应力通过使用超级计算机的最大似然算法进行赋值，这样，整个单元的牵引应力加在一起就得到了观察到的基底变形模式(Dembo和Wang 1999). 然后通过插值生成四边形中心之间的牵引应力。在将牵引应力的大小渲染为不同的强度或颜色后，牵引应力的分布被可视化为向量图或图像。为了分析牵引应力与zyxin强度之间的关系，确定了焦粘连内GFP-zyxin强度最高的像素，并根据相应的牵引应力大小绘制。

通过在35×35μm正方形内的随机位置分配16个不同大小的力矢量，进行蒙特卡罗模拟。假设基底的刚度与实验中使用的刚度相同。为了模拟真实单元格中的情况，在方向上施加了一个偏差，使得这些力在局部区域内有相互平行并指向正方形中心的趋势。以每2.8μm一个密度计算基板的精确位移矢量2每个矢量与6.5×6.5μm区域内的相邻矢量进行平均。这发生在实际检测基板变形期间，基于有限区域内焊道图案的互相关。然后将相当于0.3像素（0.065μm）的高斯随机噪声添加到位移的x和y分量中，并将大小四舍五入到最接近的等效像素数。然后将这些修改后的位移作为重建原始牵引场的基础。

结果

牵引应力计算

通过在I型胶原涂层的柔性聚丙烯酰胺基底上电镀细胞来测定牵引应力，并分析细胞施加的力导致基底变形的模式。虽然细胞的确切行为可能与在玻璃或塑料表面上看到的不同(Pelham和Wang 1997)它可能更接近于细胞在柔性基底膜或组织表面迁移的行为。计算没有对牵引应力的分布或大小进行先验假设，除了牵引应力在单元边界内的限制，以及力和转矩的整体平衡(Dembo和Wang 1999). 这使我们能够以公正的方式确定牵引应力和局部粘连之间的关系。

用蒙特卡罗模拟测试了牵引应力计算的分辨率。假设的δ牵引力，在模式和大小上与3T3成纤维细胞观察到的相似(Dembo和Wang 1999)，应用于柔性曲面的定义区域。计算变形并降级，以模拟数据收集期间的分辨率损失（材料和方法）。然后将修改后的变形图作为数据处理，以计算重建的牵引应力分布，并与原始牵引场进行比较。在不同条件下进行的30次模拟结果表明，我们的测量能够分辨出一对大小和方向相似的δ函数牵引，它们之间的距离为5-6μm(图1). 垂直力的分辨率大约提高了两倍。只要变形大于噪声，分辨率就不会受到应力大小的显著影响。

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牵引应力分析的蒙特卡罗模拟。牵引应力的小块首先分配在正方形区域（a和b）内的随机位置。精确的变形矩阵是以有限的分辨率和密度（c）从该图生成的。在应用随机噪声和邻域平均来模拟测量值（d）的分辨率极限后，使用修改后的变形矩阵来计算原始牵引应力（e和f）。由～4.4μm分隔的一对力显示为一个大补丁（箭头），而由～8.0μm隔开的一对则清晰可见（箭头）。面板b和f显示了大小的颜色渲染，红色对应强牵引应力，蓝色对应弱牵引应力。棒材：（a）4×106达因/厘米2; （b） 20μm（牵引力之间的距离）；（c） 2μm（基底变形）；（e） 2×105达因/厘米2计算牵引应力。

粘附斑块和牵引应力的分布不同

由于IRM在聚丙烯酰胺和细胞膜的界面上不起作用，我们使用了一种稳定表达GFP-zyxin（一种已知的局部粘连成分；Kaverina等人，1999年)用于检测局部粘连。当这些细胞被镀在玻璃上时，GFP-zyxin的荧光斑与IRM显示的局灶性粘连的暗斑直接相关(图2、a和b）。此外，这些细胞对帕西林的免疫染色(图2c和图d)另外两种局灶性粘连成分vinculin（未显示）的分布与GFP-zyxin在整个细胞中的分布相似。这些结果与zyxin先前的特征一致(贝克尔1986,贝克尔1997)建立GFP-zyxin作为局灶性粘连的通用标记物。

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GFP-zyxin作为局灶性粘连的标记物。将转染GFP-zyxin的鱼鳍成纤维细胞贴在胶原涂层的盖玻片上。IRM（b）显示GFP-zyxin在大小灶粘连处的定位（a）。paxillin（d）的免疫荧光染色显示在前缘与GFP-zyxin（c）有类似的共定位。棒材，10μm。

图3显示了典型迁移金鱼成纤维细胞的局灶性粘连，相应的牵引应力分布显示为矢量图和假彩色图像，牵引应力大小呈现为不同的颜色。牵引应力的一般模式与用3T3细胞观察到的相似(Dembo和Wang 1999). CAR细胞的一个独特特征是前肢足和板层之间缺乏清晰的边界。在距前缘10–20μm的区域内，持续不同步地形成微小的新生灶性粘连，其中一些发展为显著的灶性粘着，随着细胞向前迁移而保持静止，而另一些则在短时间后消失。因此，该区域包含不同大小和年龄的局灶性粘连。

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牵引应力分布与局部粘连的差异。0、6和10分钟时的牵引应力分布显示为矢量图（a、d和g）或将大小转换为颜色（b、e和h）后的彩色图像。GFP-zyxin的相应分布与牵引应力（c、f和i）的相关性有限。一些焦点粘连包含低浓度的GFP-zyxin，但产生强大的作用力（开放箭头），而其他焦点粘连显示出较强的GFP-zyxin定位，但产生相对较弱的作用力（填充箭头）。g中的箭头，105达因/厘米2巴，20μm。

在前缘和尾端检测到强烈的牵引应力。与3T3细胞尾部的力不同，3T3细胞尾部的力是散发的和可变的(Dembo和Wang 1999；Munevar等人，2001年)CAR细胞的尾部始终存在强大的作用力。我们怀疑这种差异可能是由于两个细胞系之间尾部区域的粘连密度、稳定性或分布不同所致。在一些CAR细胞中，强牵引斑也与沿侧缘的局灶性粘连共存。然而，与3T3细胞一样，推进力的分布仅限于细胞的前部，而中央和后部的局灶性粘连主要介导对细胞迁移的阻力。此外，粘连图像和牵引应力的对比表明，粘连部位有许多明亮的部位，很少或没有牵引应力(图3，填充箭头），前缘附近也有强牵引应力斑块，没有相应的高强度GFP-zyxin(图3，打开箭头）。牵引力分析的空间分辨率极限无法解释这些差异。他们表明，当整个细胞升高时，牵拉应力的大小与病灶粘连的大小或酶蛋白浓度之间没有简单的关系。

较小的Fainter斑块在主要层片中施加强大的牵引力

为了进一步确定牵引应力与GFP-zyxin强度之间的关系，我们将重点放在细胞迁移推进力所在的额叶板层区域。与我们最初的推测相反，牵引应力与酵素强度的散点图显示出相反的关系。尽管数据点分布广泛，但部分原因是与该区域的高密度病灶粘连相关的空间分辨率有限，以及斑块的异质性，很明显，微弱的病灶粘连通常比明亮的病灶粘着施加更强的牵引应力(图4a） ●●●●。对焦点粘连长度的分析得出了与牵引应力类似的反向关系(图4b） ●●●●。从领先层的高倍视图(图4d） 很明显，牵引应力不仅仅是与前缘距离的函数。此外，当对尾部进行类似分析时，GFP-zyxin强度与牵引应力之间的反向关系不再被检测到(图4c） ●●●●。

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GFP-zyxin强度与牵引应激的关系。焦点粘连处GFP-zyxin的强度与相应牵引应力之间的关系如前缘板层（a）或尾部（c）的散点图所示。每个点代表一个焦点粘附，并以给定单元格内最大值的百分比表示。前片层中的推进牵引应力与GFP zyxin的强度呈反比（a），而尾部的阻力牵引没有这种关系（c）。该图由五个单元格的测量值生成。粘着斑的长尺寸和牵引应力之间的关系在前片层中显示出类似的反比关系（b）。图d显示了领先板层中GFP-zyxin的高倍图像，几个焦点粘连标记了各自的强度（括号中的第一个数字）和牵引应力（括号内的第二个数字），均以最大值的百分比表示。GFP-zyxin在局部黏附时的强度(▪) 在其最初出现后增加以达到一个平台，而相应的牵引应力（•）显示出短暂的增加，随后是稳定的下降（e）。荧光强度和牵引应力均以该细胞最大值的百分比表示。面板f在单独的单元格中显示此过程的图像。瞬时牵引应力出现在新生的焦点粘连处，随着牵引应力降至背景水平（箭头），粘连继续发展。随着牵引应力的降低，一些局部粘连消失（箭头所示）。颜色条显示颜色与牵引应力大小之间的关系，单位为dyn/cm2。以分钟为单位显示时间。棒材，5μm。

病灶粘连成熟过程中牵引应力降低

牵引应力和前片层中GFP zyxin之间的反向关系表明，牵引力可能与局灶性粘连的成熟有关，在此过程中，粘连的大小和蛋白质浓度增加。因此，我们在特定的新生局灶性粘连的成熟过程中跟踪牵引应力和GFP-zyxin强度的时间变化。通过一次研究一个孤立的病灶粘连，我们也能够避免与病灶粘连异质性相关的问题。图4e和图f，显示了此类时间分析的典型结果。牵引应力在病灶粘连最初出现后短暂增加，在最初检测5分钟后达到峰值，然后下降到背景，而GFP-zyxin的强度持续增加，达到一个平台(图4e） ●●●●。对总共15个新生斑块进行了30–45分钟的分析，观察到了这种行为。

讨论

我们的结果表明，焦点粘连和基底之间的机械相互作用在其最初出现在前缘附近后，会发生定量和定性的变化。我们观察到新生的局灶性粘连，在一些研究中被称为局灶性复合体(Small等人，1998年)应用强大的推进牵引力驱动细胞迁移。随后，这种力量减少，而许多局部粘连的大小随着它们成熟为大斑块而继续增加。最终，大多数静止的焦点粘连都集中在迁移细胞中，尽管它们具有持续的基底粘连，但只对前向迁移施加阻力。与这些结果一致的是，自发和诱导局部释放的观察结果表明，前部推进力是由主动收缩产生的，而尾部的力反映了对前部力的被动抵抗（Munevar，S.，Y.-l.Wang和M.Dembo，准备中的手稿）。阻力负荷可能分布在中央/后部粘连部位，并且在某些条件下可能与局部粘连的大小呈正相关，尽管在本研究中除了尾端的强力外，没有检测到这种关系。

虽然已经提出了几个模型来解释成纤维细胞迁移的协调性，但大多数模型在细胞-基质的机械相互作用方面是模糊的。虽然通常认为这种相互作用是由局部粘连介导的，但我们的观察表明，在细胞迁移的循环过程中，粘连和推进力之间的关系更为复杂(图5). 这一过程始于跛足的延伸和整合素与细胞外基质的结合。随后在新生的局灶性粘连处细胞骨架成分的募集(宫本茂等人，1995年)导致基板上产生推进牵引力脉冲。在某些条件下，这些焦点粘连也可能是可移动的(Davies等人，1994年；Smilenov等人，1999年；Zamir等人，2000年). 然后斑块要么分解，要么成熟为大的局灶性粘连，其功能从主动推进变为被动锚定。这种机制有几个显著的优点。首先，前缘的推进粘连和锚定粘连之间的分工，这是先前推测的(Rottner等人，1999年)，将允许细胞迁移，同时保持其扩散形态。其次，由于细胞迁移是由前缘板层中的瞬时推进力脉冲驱动的，因此在多个焦点粘连处的机械相互作用之间需要最小的协调。最后，我们的机制通过将新生的焦点粘连转移到一个新的突出区域，促进了对环境提示的快速重新定向。因为大而成熟的焦点粘连需要很长时间才能组装，并且基本上固定在方向和位置上(Smilenov等人，1999年)如果这种成熟的粘连能够推动运动，那么很难看到牵引力和细胞迁移如何改变和适应。

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成纤维细胞迁移过程中局部粘连与机械力的关系。焦点粘连的形成伴随着推进力脉冲的产生，推动着向前运动。细胞迁移是由新生的局灶性粘连的反复形成维持的，因此推进力的反复脉冲也会持续。成熟的局灶性粘连在将细胞锚定到基底上时仅起到被动作用。

了解新生病灶粘连时推进力的调节机制非常重要。因为肌动蛋白丝仍然与成熟的局灶性粘连相关，收缩力要么被关闭，要么与细胞外基质脱离(Smilenov等人，1999年)例如，通过刚性皮层或其他细胞骨架结构吸收力。更重要的是，在局部粘连成熟过程中，机械特性的转变可能不是自发发生的，而是对特定信号的响应。微管和新组装的局部粘连之间的瞬时接触的发现在这方面尤其重要(Bershadsky等人，1996年；Kaverina等人，1998年,Kaverina等人，1999年). 此外，越来越清楚的是，局灶性粘连并不是一成不变的，而是异质性的结构，它们的形态、蛋白质组成和磷酸化状态随着化学或物理参数的变化而发生了有趣的变化(Zamir等人，1999年,Zamir等人，2000年；Katz等人，2000年). 尽管zyxin、vinculin和paxillin似乎是基本的构建块，但其他蛋白质可能与推进力呈正相关，因此在细胞-底物机械相互作用的调节中发挥作用。对牵引力相关的这些变化的详细描述可能会对成纤维细胞迁移机制产生重要的见解。

致谢

作者感谢波士顿大学科学计算中心使用他们的超级计算机设施。

这项研究得到了美国国立卫生研究院对Y.l.Wang、K.A.Beningo和M.Dembo的资助。

证据中添加的注释：最近的一篇论文（Balaban，N.Q.、U.S.Schwartz、D.Riveline、P.Goichberg、G.Tzur、I.Sabanay、D.Mahalu、S.Safran、A.Bershadsky、L.Addadi和B.Geiger，2001）。力和焦点粘附装配：使用弹性微模板基板研究的密切关系。自然细胞生物学。3:466–473）描述了相对静止单元中牵引力的测量。有关这两项研究之间关系的讨论，请参阅简介。

脚注

这项工作于2000年12月在加利福尼亚州旧金山举行的美国细胞生物学学会第43届年会上提出。

本文中使用的缩写：绿色荧光蛋白；IRM，干涉反射显微镜。

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文章来自细胞生物学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社