的基本角色果蝇属组蛋白H3磷酸化、中期染色体排列、动粒分裂和染色体分离中的内着丝粒蛋白（Incenp）和极光B

抗体

在兔子体内产生了多克隆抗DmINCENP和抗DmAurora B抗体。用以下凝胶纯化蛋白免疫兔子：谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）-INCENP_1–348（R801），GST-INCENP公司_654–755（R803）或GST–DmAurora B_1–58（R963）。抗INCENP血清按1:500稀释，用于免疫印迹和免疫荧光。通过用Affigel 10珠（Bio-Rad Laboratories）培养血清来亲和纯化抗极光B抗体_1–58已绑定。在0.5 M NaCl中洗涤后，在0.2 M甘氨酸（pH 2.0）中洗脱10 mM磷酸盐（pH 7.4）抗体，用十分之一体积的1 M Tris（pH 8.0）中和洗脱液，并通宵透析到PBS中。通过超滤浓缩抗体，并在20°C下储存在50%甘油中。对于免疫荧光，抗体使用2μg/ml。

使用的其他抗体包括抗α-微管蛋白（YL1/2大鼠单克隆，1:50使用；Harlan Sera Labs；或小鼠mAb B512，1:2000使用；Sigma-Aldrich）、抗PAV-KLP（R3301，1:500使用；Adams等人，1998年)、抗磷酸化H3（兔多克隆，使用1:200；Upstate Biotechnology；或小鼠单克隆，使用1:100；NEB）、抗Cid（使用1:2000；华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心Steve Henikoff赠送）、抗细胞周期蛋白A和B（Rb270和Rb271，使用1:500；Whitfield等人，1990年; 苏格兰邓迪邓迪大学W.Whitfield的礼物）和小鼠单克隆抗层粘连蛋白（1:50使用；纽约州立大学石溪分校Paul Fisher的礼物）。根据制造商的说明使用了所有荧光共轭二级抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）。FITC–在200 nM条件下使用阴茎倍肽。

对于阻断实验，亲和纯化的抗极光B抗体在PBS+0.1%Triton X-100（Bio-Rad Laboratories）中以1:50的比例与10%FBS在GST–DmAurora B存在下稀释_1–58（0.3 mg/ml），然后在室温下培养1小时，然后直接添加到细胞中并像往常一样处理。

果蝇胚胎和细胞

果蝇属胚胎来源于w个¹¹¹⁸成年人被固定并进行免疫染色，与之前描述的完全一样(Adams等人，1998年). 对用于RNAi实验的Dmel-2细胞进行如下免疫染色。细胞在27°C的培养箱中在LAB-TEK Permanox室载玻片（177429；GIBCO BRL）中生长，或转移到经聚赖氨酸处理的载玻片上，并在每个时间点放置20分钟。在这两种情况下，在固定之前，将载玻片以4000 rpm离心10分钟。细胞固定在细胞骨架缓冲液（1.1 mM Na）中的4%多聚甲醛中₂高性能操作₄，0.4 mM千赫₂人事军官₄，137 mM氯化钠，5 mM氯化钾，2 mM氯化镁₂，2 mM EGTA，5 mM管，5.5 mM葡萄糖，pH 6.1），室温下10分钟，在细胞骨架缓冲液中0.2%Triton X-100中渗透，并在PBS中冲洗。室温下，在PBS+10%FBS中封闭≤30分钟。抗体在PBS+0.1%Triton X-10037°C中孵育1小时，然后在PBS中洗涤4-6分钟五次。DNA在室温下用0.1μg/ml DAPI复染5分钟，并在PBS中冲洗。载玻片安装在Vectashide中，并用指甲油密封。使用DeltaVision显微镜（Applied Precision）收集所选细胞的三维数据集，该显微镜基于Olympus IX-70倒置显微镜，具有冷却的耦合充电设备相机（CH350L，Photometrics）。如果需要，数据集将被取消卷积，投影到单个平面上，并导出为TIF文件，以便使用Adobe进行处理^®Photoshop™。

微管结合试验

30μg纯牛微管蛋白（细胞骨架）在37°C下于20μl BRB80（80 mM管道，pH 6.8，1 mM MgCl）中聚合₂1 mM EGTA，1 mM GTP），通过逐步添加紫杉醇至最终浓度20μM。将BRB80、5μg GST-DmINCENP或5μg谷胱甘肽添加到预制微管中，最终体积为30μl。反应在20°C下培养30分钟，然后在50000下离心克通过含有1 mM GTP和5μM紫杉醇的30%（wt/wt）蔗糖缓冲液持续20分钟。吸取并保留上清液，用BRB80清洗缓冲垫三次。在使用10%SDS–聚丙烯酰胺凝胶进行分析之前，将颗粒重新悬浮在蛋白质样品缓冲液中。

DmINCENP/DmAurora B结合的体外检测

全长GST-DmINCENP–他的₆表示为E类.大肠杆菌并用标准方法在镍上纯化²⁺-琼脂糖珠（QIAGEN）。在0.25 M咪唑洗脱后，将蛋白质透析到TEN缓冲液中（10 mM Tris:HCl，pH 8.0，100 mM NaCl，2 mM EGTA），并结合到谷胱甘肽-琼脂糖珠（Amersham Pharmacia Biotech）。这一程序提高了全长INCENP的产量，而不是截短的INCENP。清洗珠子，并在4°C下与TEN单独或5μg DmAurora B孵育30分钟。为了去除非特定结合蛋白，在含有0.05%Triton X-100的20体积TEN200（TEN+100 mM NaCl）中清洗珠子五次。作为对照，DmAurora B与GST涂层的sepharose珠培养。洗涤后，通过在蛋白质样品缓冲液中煮沸来洗脱蛋白质，并在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳。

磷化氢与有丝分裂染色体凝集相对水平的测定

用DeltaVision显微镜收集三维数据集，数据集位于CH350L相机的线性范围内，进行去卷积，并使用Quick Projection算法平均分割有丝分裂染色体中平面的四个图像平面的图像强度。然后，我们使用数据检查器工具，在适当的波长分别测量侧面5个像素的盒子的积分强度，以检测磷酸-H3和DAPI。这假设25像素框内的DNA数量与该框内染色质凝聚的总体水平成正比。每个中期进行三次测量，以及三次局部背景测量。这些值是在Microsoft^®Excel™电子表格，并通过减去局部背景来校正617和457 nm处的强度。对于处于前中期、中期、后期、末期和间期的对照细胞，该方法得出以下相对冷凝度：分别为2.4±0.55、2.8±1.26、2.7±0.49、1.7±0.49,1.0±0.27。要生成如中所示的绘图图7G、 我们平均每个细胞的三个校正值，根据增加的DAPI荧光对DAPI测量值进行排序，并对每个数据集进行线性回归。在本实验中，我们从44个前中期细胞获得了去卷积的三维数据集，其中34个正常，10个“矮胖”。正常和矮胖染色体的平均校正磷化氢染色强度分别为2194±1779和74±123。这些对应于317±109和474±249的DNA浓缩值，表明矮胖染色体的浓缩程度不低于正常染色体。

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图7

组蛋白H3磷酸化需要INCENP和DmAurora B，但不需要与动粒蛋白CENP-A/Cid结合。（A–F）磷-H3（绿色）和CENP-A/Cid（红色）。（A） 浓缩染色体缺乏可检测的磷酸化H3（来自同一图像的两个细胞，INCENP RNAi，36小时）。（B–D）标记CENP-A/Cid和磷酸化H3的正常有丝分裂染色体：中期（B）、早期后期（C）、晚期后期（D）。（E） 浓缩染色体缺乏可检测的磷酸化H3（来自同一图像的两个细胞，极光B RNAi，36小时）。（F） 磷酸化H3减少的矮胖染色体（极光B RNAi，36小时）。（G） 可检测的磷酸化H3水平（绿色方框）和局部染色质凝集（蓝色圆圈）之间只有微弱的相关性。注意磷-H3水平的极端分散。坐标：平均像素强度。横坐标：每个配对的蓝色圆圈和绿色方框分别表示457 nm和617 nm处三个背景校正像素强度测量值的不同单元格的平均值。457-nm测量值根据像素强度按升序排序。（H和I）表达（H）或缺乏（I）Dm Aurora-B（绿色，均来自极光B RNAi，36小时）的有丝分裂细胞中的染色质凝集水平相似。（J和K）前中期细胞中高水平的细胞周期蛋白B蛋白（红色）：对照RNA干扰（J）和极光B RNA干扰（K），表示合并；〃，表示磷-H3或极光B；‴，表示DNA（DAPI）。棒材，5μm。

RNA干扰

RNAi输入果蝇属根据公布的方案进行S2和Dmel2组织培养细胞(克莱门斯等人，2000年). 在两种细胞系中观察到类似的表型，此处仅显示Dmel2数据。来自5′端的700-bp PCR片段DmINCENP公司和DmAurora B型使用Megascript试剂盒（Ambion）将基因用作RNA合成的模板。实验在六孔板或室载玻片中进行。在每个时间点，收集来自实验和对照组的细胞并进行免疫印迹或免疫荧光处理。用于免疫印迹，10⁶通过离心收集细胞，将其重新悬浮在50μl样品缓冲液中，进行超声处理，并煮沸3分钟，然后加载到10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。用于免疫染色的细胞样本如上所述进行处理。

DmINCENP和DmAurora B激酶是染色体乘客蛋白质

为了证明INCENP的特征行为在果蝇属有丝分裂时，我们提高了对蛋白质两个非重叠区域的抗体(图1). 两种血清在胚胎提取物的免疫印迹上都识别出一种110 kD的单一蛋白(图2A） ●●●●。这大于预测的分子量83.5 kD，但与来自其他物种的INCENP的行为一致，这些INCENPs也在蛋白质凝胶上异常迁移。

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图2

（A） 用GST-INCENP抗体R801检测苍蝇胚胎总蛋白提取物的免疫印迹_1–348.可以看到110 kD的单个频带。（B–Q）DmINCENP在胚胎和培养细胞中的定位。用R801（红色）、α-微管蛋白（绿色）和DNA（蓝色）对所有面板进行INCENP染色。（B） 合胞前期（注意DmINCENP分布于凝聚染色体的臂部和着丝粒）；（F） 合胞中期和早期后期；（J） 合胞体后期。（C、G和K）分别从B、F和J中选择的有丝分裂像的放大。（D、H和L）相应的INCENP染色；（E、I和M）相应的DNA染色。箭头显示H和I的着丝粒染色，以及K（N）细胞化胚胎有丝分裂域的中区染色，显示细胞处于有丝分裂的不同阶段。m、 中期；a、 后期；t、 末期。（O–Q）Dmel2细胞分别处于中期、后期和末期。棒材，5μm。

在合胞体胚胎中，DmINCENP在前期与浓缩染色质相关(图2，B–E），在聚焦到中期染色体的着丝粒区域之前(图2，F–I，箭头）。进入后期后，蛋白质离开染色体，在分离的染色单体之间形成一个斑点环(图2，J–M）。每个点似乎都位于微管束的会聚焦点上(图2K、 箭头）。随着末期的进展，DmINCENP环的直径逐渐减小，直到在中央纺锤体微管束之间形成一个单一的中体样结构。在细胞化的胚胎中也观察到类似的INCENP分布(图2N） 和Dmel2培养细胞(图2，O–Q）。

为了在胚胎和组织培养细胞中定位DmAurora B，我们提高了NH抗体₂-蛋白质的58个氨基酸末端与GST融合。尽管我们采集的两份血清中没有一份在胚胎提取物的免疫印迹上检测到蛋白质，但两者都能识别细菌中表达的重组蛋白（数据未显示）。亲和纯化抗体对胚胎和细胞的间接免疫荧光都很有效。这种免疫染色可能对DmAurora B具有特异性，原因有三。首先，亲和纯化抗体的染色模式与高等真核生物中极光B激酶抗体的高度特征模式基本相同(图3，A–K）(舒马赫等人，1998年;Terada等人，1998年). 第二，用纯化的重组GST-aurora B预孵育抗体_1–58取消培养细胞的所有特异性染色(图3五十） ●●●●。第三，用DmAurora B dsRNA处理Dmel2细胞24小时后消除了许多有丝分裂细胞中的所有染色，证实在固定细胞中显示的表位是DmAurora B公司/国际实验室基因（参见图7一） ●●●●。

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图3

（A–L）DmAurora B在胚胎和培养细胞中的免疫定位。DNA（蓝色）、DmAurora B（红色）和微管蛋白（绿色）如图所示。（A） 合胞核进入有丝分裂。黑色箭头表示核（在C中放大）正好位于有丝分裂波之前，缺乏可检测的极光B染色。白色箭头指向进入前期的细胞核（在图D中放大），DmAurora B积聚在着丝粒处。（E–H）DmAurora B在不同有丝分裂阶段的合胞核定位。注意DmAurora B从前期到中期仅位于着丝粒。DmAurora B在后期重新分布到纺锤体中区。（B） 细胞化周期14胚胎的有丝分裂域显示DmAurora B处于前中期（pm）、中期（m）、晚期（a）和末期（t）。（I–K）Dmel2染色分别在中期、后期和末期。白色箭头指向着丝粒（I）和中体（K）染色。（L） Aurora B的免疫染色通过与重组Aurora B蛋白共孵育来阻止（黑色箭头显示没有染色）。棒材，5μm。

在整个有丝分裂过程中，DmAurora B的分布与DmINCENP的分布相似。然而，间期细胞核没有检测到DmAurora B染色（它们对INCENP染色），当细胞核进入前期时，DmAurola B首先出现在着丝粒上：沿着染色体臂没有观察到染色。图3A显示胚胎的一个区域被一波有丝分裂所穿过。刚进入有丝分裂的细胞核（即与间期核相邻的细胞核）仅在着丝粒处积聚DmAurora B(图3，比较C和D中增大的细胞核）。DmAurora B一直保持在着丝粒上，直到中期到后期的转变，然后转移到中心轴，然后转移到中心体(图3，E–H）。在细胞化胚胎中也观察到这种分布(图3B） 在培养细胞中(图3，I–K）。我们得出结论，DmINCENP和DmAurora B是染色体乘客蛋白，其在有丝分裂中的分布类似于脊椎动物对应物。

DmINCENP直接与微管和DmAurora B结合

在后期，INCENP与中央纺锤体的微管共定位。此外，INCENP在培养的脊椎动物细胞中过度表达或小鼠INCENP的破坏导致微管网络的显著重塑(Mackay等人，1998年;Cutts等人，1999年). 为了测试DmINCENP是否直接结合微管，我们在细菌中表达可溶性全长GST DmINCENP，对其进行纯化，并将其与由纯化的微管蛋白制备的紫杉醇稳定的微管孵育。作为对照，GST单独与聚合微管蛋白孵育。然后通过蔗糖垫沉淀反应混合物。GST-DmINCENP，而非GST，与微管共培养(图4A） ●●●●。这表明在有丝分裂过程中，DmINCENP与微管的结合可能是直接的。

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图4

（A） DmINCENP直接与微管结合。（车道M）分子量标记。（1-5道）微管颗粒经蔗糖垫沉淀后的考马斯蓝染色凝胶。64%添加的INCENP（第4道），但没有GST（第5道）与微管结合。INCENP在没有微管的情况下不会沉淀，但会留在上清液中（通道2和7）。（通道6–10）上清液部分的考马斯蓝染色凝胶。36%的INCENP，但所有GST，都与微管（9和10道）无关。（B） DmINCENP在体外与DmAurora B结合。考马斯蓝染色凝胶，显示DmAurora B输入（通道1，5%负载）。（通道2–3）GST-结合珠与缓冲液（通道2）或DmAurora B（通道3，50%负载）孵育。没有DmAurora B与GST珠相关。（4–5道）GST-INCENP-结合珠与缓冲液（4道）或DmAurora B（5道，50%装载）一起培养。19%的新增DmAurora B与GST-INCENP合作。

INCENP储存于爪蟾与极光B激酶复合的卵子(Adams等人，2000年).果蝇属包含两种可识别的类极光蛋白激酶：中心体分离所需的家族创始成员极光（DmAurora A）和最近描述的DmAurola B/ial(Reich等人，1999年)，其功能和定位未知。为了确定DmAurora B是否能与INCENP结合，我们用含有GST-DmINCENP的珠培养细菌中表达的DmAurola B。作为对照，该激酶与单独携带GST的珠培养。在这些条件下，DmAurora B特异性结合GST DmINCENP，但不单独结合GST(图4B） ●●●●。

RNAi方法

我们已经使用RNAi从培养细胞中消除了DmINCENP和DmAurora B/ial。将dsRNA添加到Dmel-2组织培养细胞的指数生长培养物中（见材料和方法），并在不同时间点采集样本，通过免疫印迹和间接免疫荧光进行分析。同时分析了两个阴性对照：未添加dsRNA的细胞和我们添加dsRNA合成自人类内含子序列的细胞，随机选择以排除dsRNA对细胞周期的非特异性影响。后者没有造成任何缺陷，与未经处理的对照组没有区别。

RNAi实验的分析很复杂，因为这项技术会导致研究中的蛋白质逐渐耗竭，并且蛋白质不一定以相同的速度从群体中的所有细胞中丢失。此外，抑制INCENP或极光B功能会导致培养物变成多倍体，很难排除这些实验中出现的异常有丝分裂的某些方面是由多倍体有丝分裂期间出现的并发症引起的。为了最大限度地减少这些并发症，我们在RNAi治疗开始后的不同时间检查了此处描述的表型，并可以表明某些表型方面，例如组蛋白H3磷酸化和有丝分裂染色体组装缺陷，在某些情况下，在第一个细胞周期内的细胞中观察到，在培养物高度多倍体之前。此外，在可能的情况下，我们将我们的表型结论局限于明显缺乏INCENP或极光B（可通过间接免疫荧光检测到）的细胞。

RNAi消除DmINCENP和DmAurora B/ial功能

用DmINCENP-dsRNA处理的细胞的免疫印迹分析表明，在培养物中加入dsRNA 36–48小时后，培养物中的DmINGENP水平显著降低(图5A′，顶部）。在最佳实验中，蛋白质损失≤95%。极光B的RNAi治疗效果更快，24小时后大多数有丝分裂细胞的间接免疫荧光检测不到该蛋白(图5A〃，看图7H） ●●●●。在这两种情况下，蛋白质的损失都是暂时的，稍后会开始恢复。

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图5

RNAi对细胞生长和有丝分裂的影响概述。（A′和A〃）通过免疫染色（INCENP和aurora B RNAi）和免疫印迹（仅INCENP-RNAi）评估RNAi的疗效。图表显示了缺乏可检测INCENP或极光B染色的细胞百分比(n个= 75). 部分耗尽的细胞未被评分为空。在NIH图像中对INCENP免疫印迹进行定量，并根据微管蛋白负荷控制进行标准化，水平表示为t吨=0级。（B） 对照细胞和dsRNA处理细胞的生长曲线。（C） 多倍体（多核和异常大）细胞百分比的时间进程。（D–F）直方图，显示不同有丝分裂阶段对照、INCENP阴性或极光B阴性有丝分裂细胞的百分比。INCENP地址：t吨=0，24；极光B在t吨=0时，由于缺乏空细胞，对整个有丝分裂群体进行评分。对于每个时间点，n个= 50.

INCENP和aurora B RNAi后观察到的表型很复杂，揭示了有丝分裂周期多个阶段的缺陷。为了跟踪RNAi发病后各种表型的出现，在暴露于dsRNA后24、36、48和72小时采集培养物，并评估以下参数：细胞数量、死亡（台盼蓝阳性）细胞频率、明显多倍体细胞频率、有丝分裂指数、，间接免疫荧光法检测INCENP或DmAurora B阴性的有丝分裂细胞的百分比，以及有丝分裂中细胞的不同有丝分裂期的分布。

RNAi处理使Dmel2细胞的细胞倍增时间从21小时（暴露于对照dsRNA后的细胞为21.6小时）增加到暴露于DmAurora B和DmINCENP的dsRNA后培养物的36.1和27.5小时(图5B） ●●●●。在DmAurora B实验中，多倍体细胞从24小时开始增加(图5C、 DmINCENP为36小时）。这与首次观察到大量有丝分裂细胞分别缺乏DmAurora B和DmINCENP的情况相符。

引人注目的是，INCENP的RNAi消除了细胞实现中期染色体比对的能力(图5，比较D和E）。在极光B RNAi中观察到类似的表型(图5F） ●●●●。相反，有丝分裂细胞的数量开始由具有前中期样染色体排列的细胞控制。重要的是，前中期细胞百分比的增加并没有反映出有丝分裂的停滞，因为在整个实验过程中，培养物的有丝分裂指数始终保持在～5%的控制水平上(图5，D–F）。如下所述，我们认为这些培养物中的许多细胞必须直接从前期退出有丝分裂，而不能实现中期染色体比对。

DmINCENP和DmAurora B在细胞周期中的正确定位相互依赖

INCENP是正确定位人类细胞中极光B激酶和C类.雅致早期胚胎(Adams等人，2000年;Kaitna等人，2000年). 然而，尚不清楚极光B激酶是否在INCENP定位中起作用。

RNAi消除DmINCENP完全消除了DmAurora B在有丝分裂过程中的定位：该蛋白在染色体、中央纺锤体微管或中体上未检测到(图6E和图F). 相反，DmAurora B RNAi在前中期并没有阻断DmINCENP与染色体臂的关联，但削弱了其集中于着丝粒的能力(图6B） 并消除了转移到身体中部(图6C） ●●●●。因此，INCENP在前期以染色体为靶点的初始阶段不需要极光B功能，但在后期有丝分裂中，它对INCENP的行为是必要的。

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图6

INCENP和DmAurora B在正确定位方面相互依赖。（A） 控制中期在离散着丝粒斑点中显示INCENP（红色）。（B） 来自DmAurora B dsRNA处理细胞的罕见中期。INCENP在染色体臂上的分布比在对照组更为广泛。盒子仅显示INCENP染色。（C） DmAurora B RNAi后，INCENP在末期不会转移到纺锤体中央区或中心体（箭头）。（D） 在中身用DmAurora B（红色）控制末期。在INCENP RNAi后，DmAurora B从染色体（E）或末期中体（F）中完全游离。总之，微管是绿色的；DNA，蓝色）。棒材，5μm。

组蛋白H3磷酸化、有丝分裂染色体结构和中期染色体比对需要DmINCENP和DmAurora B功能

在未处理和对照培养物中，有丝分裂的染色体在丝氨酸上总是显示出高水平的组蛋白H3磷酸化¹⁰，用特定抗体检测(图7，B–D）。抑制DmAurora B或DmINCENP功能导致可检测组蛋白H3磷酸化水平降低(图7A和图E)以及在暴露于dsRNA后24小时开始的畸形染色体的发病率增加(图7F） ●●●●。磷酸化H3染色因细胞而异，但在DmAurora B RNAi后24小时，79%的极光全前中期细胞的H3磷酸化水平显著降低（DmINCENP RNAi 36小时后74%的INCENP-null细胞；图7A和图E). 这个结果表明C类.挽歌(Hsu等人，2000年)，DmAurora B至少部分负责果蝇属细胞。

重要的是，组蛋白H3-氨基酸的水平¹⁰磷酸化与染色质浓缩的整体程度只有微弱的相关性。图7G显示了一个图，其中比较了一系列前中期细胞的磷酸化-H3标记和DAPI染色的定量测量，显示了广泛的磷酸化-H3标记（见材料和方法）。尽管丝氨酸组蛋白H3磷酸化水平¹⁰随着染色质凝集的增加，其密度也会增加，很明显，细胞间的数据存在巨大的分散性。在其他研究中，我们观察到染色体完全缺乏可检测到的极光B激酶，它显示出明显正常的浓缩水平(图7，将H与I进行比较）。

一种异常的矮胖前中期染色体形态(图7F） RNAi后，在46%的INCENP-阴性细胞和60%的极光B阴性细胞中发现。与正常形态的染色体相比，这些矮胖染色体的磷酸化H3染色水平低28倍（见材料和方法）。Dumpy染色体呈无定形，未发现明确的姐妹染色单体。在许多情况下，矮胖的染色体似乎与异常的前中期排列相对应，其特征是核膜被拆卸（数据未显示），细胞周期蛋白B蛋白持续高水平(图7，将J与K进行比较）。尽管它们最初看起来比正常有丝分裂染色体的浓缩程度低(图2O、 3，I和L，以及7，B–D），事实上，它们的冷凝水平是正常的(图7G、 包括正常和矮胖染色体的测量；另请参见材料和方法）。相反，染色体高阶结构和行为的其他方面似乎是异常的。这可能是由于凝聚素结合缺陷造成的(Giet和Glover 2001).

Dumpy染色体具有动粒，如CENP-A/Cid染色的双点所示。Cid是果蝇属CENP-A直系亲属(Henikoff等人，2000年)，并为动粒内板提供标记(Warburton等人，1997年).

DmINCENP和DmAurora B在后期和末期的作用

正如预期的那样，由于缺乏正常的中期细胞，我们几乎看不到INCENP或aurora B阴性的正常后期细胞。相反，后期/末期细胞有一系列异常，包括染色体沿其长度分布的类后期纺锤体(图8A和图B)，处于各种试图胞质分裂状态的细胞，大量无定形滞后染色质覆盖在分离染色质后面(图8C和图D)以及奇异的细胞，其中banana形细胞核被有丝分裂样的双极微管阵列包围(图8，E–G）。图8E显示INCENP RNAi中两个相邻的有丝分裂细胞，其中一个仍在表达INCENP，处于正常中期，另一个为INCENP阴性，正在形成细长的香蕉状细胞核。

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图8

INCENP和极光B RNAi中的异常着丝粒分离和滞后染色质。（A和B）极点处有成对CENP-A/Cid斑点（红色）和滞后染色质的异常后期（INCENP RNAi，36小时）。（C和D）异常末期，在中体/中区有Cid斑点（INCENP RNAi，36小时）。（E） 中期和末期/G1细胞，后者显示具有双极微管阵列的伸长细胞核（INCENP RNAi，36小时）。中期细胞仍表达INCENP，但在异常的末期/G1细胞中未检测到。（F和G）香蕉形细胞核类似于E中所示的细胞核，显示由染色质连续体连接的Cid斑点簇分隔良好（极光B RNAi，36小时），表示合并（绿色，α-微管蛋白）；〃，用双箭头表示CENP-A/Cid，显示成对的Cid点‴，表示DNA（DAPI）。棒材，5μm。

在染色体沿着纺锤体分布的细胞或具有banana形细胞核的细胞中，着丝粒要么聚集在相反的两极附近(图8，A–D）或位于伸长核的相对尖端(图8F和图G). 这强烈表明动粒附着在微管上，并且发生了染色体的后期A运动。

在似乎处于末期的细胞中，我们经常注意到一对或多对着丝粒似乎停滞在纺锤体两极之间(图8C和图D; 和数据未显示）。如果这些着丝粒成功地成为生物定向体，但在染色体后期运动开始时无法分离，那么这种组织就是可以预测的。在正常的后期，着丝粒通常在分离染色单体的前缘紧密聚集在一起，这种现象从未出现过(图7C和图D). 与姐妹动粒分离的困难一致，我们在纺锤体两极附近也看到了许多成对的动粒斑点，好像未分离的染色单体对一起移动到了一个单极(图8A〃、B〃和F〃，双箭头）。

随着RNAi处理后时间的增加，我们观察到INCENP和aurora B RNAi中多倍体细胞的数量急剧增加，因此到72小时时，大多数细胞群体已经变成高度多倍体(图5C） ●●●●。我们观察到的许多双核细胞起源的最简单解释(图9C和图F)染色体分离和核重组发生了，但胞质分裂是有缺陷的。我们还观察到有一个巨核的细胞(图9G） ●●●●。这些可能是由于染色单体分离反复失败而产生的。除了染色体缺陷外，我们还观察到INCENP和极光B RNAi中的纺锤体异常。

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图9

去除DmINCENP会导致胞质分裂缺陷。（A、D和D′）未经处理的细胞的Telophase图。所有其他面板显示INCENP RNAi处理后的细胞。（A–C）将图像与INCENP（红色）、微管蛋白（绿色）和DNA（蓝色）合并。在INCENP RNAi后，与A中未经处理的细胞相比，B（箭头）中末期的中体缺少INCENP（红色）。（C）卵裂失败后两个细胞核之间保留的微管结构示例。（D–F）将肌动蛋白（红色）和DNA（蓝色）图像合并。晚期卵裂沟处肌动蛋白的积累不受INCENP去除的影响（与D和E相比）。然而，在双核细胞（F）的细胞核之间不存在肌动蛋白。（D′–F′）相应的INCENP图像。通过RNAi程序可以有效去除INCENP。（G） INCENP RNAi后72小时出现粗大多倍体细胞。微管放射状排列延伸到这些大大扩大的细胞的细胞皮层。棒材，5μm。

总之，这些观察结果表明，DmINCENP和DmAurora B可能对各种后期/末期事件至关重要，包括姐妹染色单体和动粒分离、后期的染色体结构和有丝分裂纺锤体结构。

DmINCENP对细胞分裂的启动不是必需的

可以观察到缺乏可检测到的DmINCENP的细胞，在这种细胞中，卵裂沟的收缩已经显著推进，并且形成了中体(图9B） ●●●●。这些细胞在分裂沟处显示出肌动蛋白的积累，与未经处理的细胞相似(图9D和图E)尽管肌动蛋白在细胞剩余部分的分布比正常情况下更多。在双核细胞中，细胞核之间不再有肌动蛋白染色的焦点，表明收缩环已经解体(图9F） ●●●●。相反，双核细胞在两个细胞核之间始终显示出异常高密度的微管蛋白(图9C） ●●●●。这可能是中心纺锤的残余。

DmINCENP和DmAurora B是染色体乘客蛋白，在有丝分裂过程中相互依赖于其靶向

有丝分裂中INCENP的靶向依赖于NH的基序₂蛋白质的末端(Mackay等人，1993年;Ainsztein等人，1998年). 因此，尽管NH高度分化₂-末端氨基酸序列DmINCENP类似于一种经典的染色体乘客蛋白，在前期首先沿着染色体臂出现，然后在着丝粒积累并转移到中央纺锤体和中体。这在早期合胞体有丝分裂期间都是正确的果蝇属在培养的Dmel2细胞中。这是INCENP在正常细胞发育过程中的首次定位：以前的研究都使用了各种转化细胞系。DmAurora B也是一个染色体乘客，但在胚胎有丝分裂早期的行为上与DmINCENP存在细微差异：DmAurola B在早期前期与染色体无关，当在晚期前期/早期中期首次检测到时，它已经集中在着丝粒上。

在这里，我们首次表明，在有丝分裂中INCENP定位的某些方面（但不是所有方面）需要DmAurora B。在缺乏DmAurora B的情况下，INCENP在前期正常定位于染色体；然而，它随后无法集中于着丝粒并转移到中央纺锤体或中体。正如先前研究所预测的那样，INCENP对极光B靶向至关重要：在INCENP-RNAi之后，DmAurora B不会定位于染色体、中区微管或中体。因此，染色体乘客蛋白相互依赖，以便在有丝分裂期间进行适当的靶向。

这种相互依赖性，加上这两种蛋白质储存在11S复合体中爪蟾鸡蛋，表明它们可以在体内发挥蛋白质复合物的作用。DmINCENP在体外结合微管，并可能负责将极光B靶向中心纺锤体，因为该激酶似乎缺乏自身的微管结合活性（数据未显示）。然而，着丝粒定位的差异果蝇属早期胚胎表明，这两种蛋白可能在专性复合体中不起作用，至少在发育前期是这样。

DmINCENP是DmAurora B高效发挥组蛋白H3激酶功能和有丝分裂染色体组装所必需的

S公司.酿酒极光/Ipl1p和C类.雅致H3-海水需要aurora B/AIR-2¹⁰有丝分裂中的磷酸化(Hsu等人，2000年). 这里，我们已经证明INCENP不仅对有丝分裂细胞中极光B的正确靶向至关重要，而且这种靶向对于丝氨酸上正常水平的组蛋白H3磷酸化也是必需的¹⁰这是首次证明INCENP是体内极光B激酶功能所需的必要辅因子。

丝氨酸磷酸化H3水平的染色体有丝分裂细胞的可用性¹⁰使我们能够评估普遍持有的假设，即H3磷酸化与染色质浓缩程度相关。当用定量荧光显微镜比较磷酸化H3水平和染色质致密程度时，只观察到两个值之间的微弱相关性。相反，对INCENP和极光B功能的干扰似乎与组装正常形态有丝分裂染色体的困难密切相关。缺乏磷酸化H3的有丝分裂染色体具有典型的矮胖形态，没有姐妹染色单体分离的证据。这类似于中看到的缺陷果蝇属凝集素SMC4亚基的突变体(Steffensen等人，2001年)当ts突变体C类.雅致极光B/AIR-2在非允许温度下进入有丝分裂(Severson等人，2000年). 极光B对组蛋白H3或其他染色体底物的磷酸化可能是凝聚素结合所必需的(Giet和Glover 2001)或其他赋予有丝分裂染色体特征形态的染色体蛋白质。

有丝分裂染色体需要INCENP和Aurora B才能实现稳定的中期比对

后来，在添加dsRNA后，我们观察到前中期有丝分裂细胞的百分比急剧增加，同时中期细胞的数量也相应减少。这在INCENP RNAi中尤其引人注目，我们在中期未能观察到任何INCENP-阴性细胞。令人惊讶的是，这并没有导致培养物有丝分裂指数的增加。因此，在没有INCENP和/或极光B功能的情况下，果蝇属Dmel2细胞必须从中期退出有丝分裂。消除INCENP和极光B功能不会触发Dmel2细胞中的有丝分裂检查点。然而，由于这些细胞在秋水仙素的有丝分裂过程中不会停滞(图5D） 无论如何，他们似乎缺乏一个健壮的中期检查点。

这些前中期细胞的最终命运是什么？我们排除了通过细胞死亡将其清除的可能性。尽管在包括对照组在内的所有培养物中，培养物中垂死细胞的数量在12-24小时时都显示出短暂的增加（可能是由于用于诱导dsRNA摄取的血清休克方案的某些方面），但在整个实验的剩余时间里，它随后下降，并在所有培养物中保持不变，为~5%（数据未显示）。

有丝分裂指数没有增加的另一种解释是，如果细胞直接从前中期过渡到后期或末期，就像基本动粒蛋白Ndc10p中的芽殖酵母细胞突变一样(Goh和Kilmartin 1993). 与此相一致的是，我们在处于后期或下一个细胞周期早期的细胞中看到了各种显著的异常（见下文）。虽然我们可以观察到后期/末期细胞在染色质团的相反两极有动粒，但动粒通常没有正常紧密聚集（相比之下图7D带图8D） ●●●●。这可能反映了后期运动的开始，而没有在中期板上预先对齐染色体。

为什么INCENP和/或极光B功能的废除会阻止细胞获得稳定的中期染色体排列？一个明显的可能性是动粒功能受损，就像硬皮病患者的抗中心粒抗体被微量注射到人类培养细胞中一样(Bernat等人，1990年)或者当细胞表达疱疹病毒蛋白ICP0时，会导致动粒蛋白CENP-A和CENP-C的破坏(Everett等人，1999年). 在芽殖酵母中，极光激酶Ipl1p磷酸化必需的动粒组分Ndc10p(Biggins等人，1999年). 因此，在后生动物中，为了使动粒在有丝分裂中发挥作用，一个或多个动粒成分必须被极光B磷酸化。一个明显的候选者是CENP-A/Cid。CENP-A保留与丝氨酸同源的位点¹⁰，这是丝氨酸⁵在Cid中(Henikoff等人，2000年). 重要的是要确定CENP-A/Cid是否以极光B激酶依赖的方式磷酸化。

我们的观察结果表明，动粒组装正确，至少就CENP-A/Cid结合而言，并在后期/末期向纺锤体极移动，这与该模型相矛盾。这意味着在INCENP和极光B功能消失后，动粒结合微管和进行后期A运动的能力得以保留。然而，动粒功能的其他方面，即形成双极纺锤体附着和后期分离的能力（见下文）似乎存在缺陷。INCENP或极光B的RNAi如何导致染色体生物定向缺陷尚不清楚，但这不太可能是由于对凝聚素亚基结合的干扰所致，如贫瘠的突变体成功完成中期染色体比对(Bhat等人，1996年). 此外，我们不能排除染色体行为的某些异常方面反映微管和/或纺锤体功能受损的可能性。INCENP和极光B RNAi后有丝分裂纺锤体的详细行为需要进一步分析。

姐妹动粒分裂和后期染色体稳定性可能需要正常的INCENP和/或极光B功能

INCENP或极光B RNAi后的后期/末期细胞表现出三种极不寻常的染色体表型。首先，它们通常有一对或多对姐妹动粒位于中央纺锤体或中体两侧。其次，纺锤极或纺锤极附近的CENP-A/Cid染色病灶通常成对出现，这表明姐妹动粒保持成对，尽管经历了后期A样的向极运动。第三，分离的大量染色质通常由大量滞后的染色质连接。我们称之为染色质，而不是染色体，因为材料是无定形的，很少或没有观察到浓缩有丝分裂染色体形态的证据。

如果着丝粒在后期开始时未能分离，前两种表型可以解释。在这种情况下，生物定向染色体的着丝粒倾向于聚集在纺锤形赤道附近，靠近中体，并被纺锤力拉断。单向动粒会成对地移动到一个或另一个纺锤极。如果这种情况发生在已达到中期的细胞中，那么大部分动粒将成对地留在纺锤体中区。然而，如上所述，INCENP和/或极光B功能的废除阻止了细胞达到中期，因此有望导致观察到的表型，大多数着丝粒位于两极，只有少数位于中区。如果INCENP和/或极光B参与着丝粒内聚蛋白复合体的调控，则可能会出现姐妹动粒分离缺陷；目前正在进行实验，以确定内聚素组分是否是极光B的底物。

大量滞后染色质的存在是INCENP和/或极光B功能丧失后后期/末期的高度特征。这种滞后的染色质与由于拓扑异构酶II功能丧失而导致姐妹染色单体分离的大量问题不同。中的topo II功能丧失S公司.蓬贝导致后期细胞中有一小部分染色质，包括两极的着丝粒和纺锤体中部缠结的染色质(Funabiki等人，1993年). 在脊椎动物中，药物抑制topo II功能会导致类似的表型(Gorbsky 1994年). 相反，INCENP或极光B的RNAi似乎并没有阻止染色质的大部分向纺锤极移动。然而，这种物质后面拖着一层去凝聚的染色质涂片，在极端情况下，它似乎在分裂细胞中形成一个连续体。

这种滞后的染色质可能是由于姐妹染色单体分离困难引起的，但我们认为它更可能代表了染色体在后期运动的物理压力下不能作为整体单元运动。如果在前中期细胞中观察到的矮胖染色体缺乏一个有组织的基础结构，那么当着丝粒开始向两极移动时，臂的染色质可能会简单地散开，留下一片无定形染色质。这与极光B的干扰作用在果蝇属细胞干扰凝集素亚基的结合贫瘠的有丝分裂染色体(Giet和Glover 2001). 的确，贫瘠的在合胞体有丝分裂期间，突变体表现出显著的染色质桥(Bhat等人，1996年)然而，在影响凝集素亚基SMC4的突变体中没有发现如此显著的缺陷果蝇属(Steffensen等人，2001年). INCENP/aurora B对除凝集素亚基外的其他染色体成分的作用可能导致后期染色体完整性的丧失。

我们感谢P.Vagnarelli在出版前传达她的成果；W.Whitfield检测细胞周期蛋白A和B抗体；S.Henikoff检测抗Cid抗体；P.Fisher检测抗层粘连抗体；以及M.Heck、A.Merdes、C.Morrison、H.Ohkura、K.Sawin和S.Vass的科学讨论和手稿批评。

R.R.Adams是医学研究委员会的博士后研究员。H.Maiato得到了Gulbenian de Doutoramento em Biologia e Medicina项目和葡萄牙政府的学生奖学金支持。W.C.恩肖实验室的工作得到了威康信托基金会的支持，W.C.恩肖是该基金会的首席研究员。