体内命运分析揭示了Sox2系统⁺成人海马中的神经干细胞

Sox2-GFP细胞代表成人海马中未分化的细胞群

确定GFP的细胞类型⁺我们首先用放射状胶质细胞和/或神经干细胞的特异标记物进行免疫组织化学（IHC）。Sox2系统-GFP细胞与包括NESTIN在内的放射状胶质细胞标记物共定位(福田等人，2003年;Kronenberg等人，2003年;Mignone等人，2004年)、GFAP(Seri等人，2004年)和BLBP(Anthony等人，2004年)尤其是在放射状过程中(图1D、1E和1F). 非放射病患者NESTIN和GFAP的检测Sox2系统-然而，由于体细胞缺乏信号，GFP细胞是不可行的。全部Sox2系统-SGZ中的GFP细胞被MUSASHI-1联合标记，MUSASHI-1在出生后的NSC中表达(坂原和冈野，1997年) (图1G).

带BrdU的IHC(图1H,图2S)和Ki67(图1I)显示了一小部分Sox2系统-GFP细胞在成人SGZ中增殖（5.2±2.67%Sox2系统-GFP细胞Ki67阳性，平均值±s.e.m，n=5），这些细胞占Ki67总数的23%⁺细胞。值得注意的是，只有非径向的，而不是径向的，Sox2系统-GFP细胞与细胞增殖标记物联合标记。因此，在我们的分析中，只有非径向Sox2系统-GFP细胞有规律地增殖。

使用DOUBLECORTIN（DCX）、TuJ1和NEUN检查Sox2系统-GFP细胞分别代表神经元前体、未成熟和成熟神经元。大多数Sox2系统-GFP细胞没有与这些标记物共同定位，表明GFP⁺SGZ中的细胞并不代表完全分化的神经元(图1J、1K和1L). 一些GFP⁺细胞与DCX共定位（数据未显示），但这种共定位总是与GFP和DCX较弱的表达相一致。这一发现可能反映了Sox2系统⁺细胞至未成熟DCX⁺神经元。星形胶质细胞标志物S-100β在Sox2系统-SGZ中的GFP细胞(图1M). 然而，在极少数情况下，Sox2系统-S-100β阳性的GFP细胞位于颗粒层或肝门的较深处(图1M，箭头）。使用抗NG2和GST-π的抗血清检查是否Sox2系统-GFP细胞代表少突胶质细胞。然而，Sox2系统-GFP细胞没有与这些标记物共同定位(图1N). 这些数据共同表明Sox2系统-SGZ中的GFP细胞代表具有增殖能力但未分化的细胞。

Sox2系统-GFP细胞具有自我更新、多潜能NSC特性在体外

检查海马是否Sox2系统-GFP细胞可能是在体外从转基因小鼠中制备神经干细胞、海马细胞，并在FGF2和EGF存在下培养(图2A). 最初分离海马细胞时，只有6%（6.1±2.6%，n=4）的活细胞是GFP⁺细胞。然而，在培养的4周内，Sox2系统-GFP细胞扩增，约占活细胞总数的70%(图2A). 在独立实验中，GFP⁺用FACS直接从海马区分离细胞，进行批量培养或克隆培养。在这两种情况下，GFP⁺细胞增殖时没有失去GFP表达（100%，第10、25和35代，每代3个）在体外扩大Sox2系统-GFP细胞至少可以传代30次，保持其产生神经谱系的能力（见下文）。

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图2

Sox2系统-GFP细胞是在体外国家安全委员会

的增殖能力Sox2系统-用流式细胞仪分析GFP细胞。Sox2系统-GFP细胞仅占海马体细胞总数的6%，存活并扩张，形成大多数集落在体外（A） 。西方分析显示了时间进程中分化的进展（B）。神经元（TuJ1）和胶质标记物（GFAP）的表达与SOX2的下调有关。免疫细胞化学显示在体外培养的Sox2系统-GFP细胞到神经谱系（C）。注意，与初级神经元的共培养范式用于分化Sox2系统-GFP细胞到少突胶质细胞（RIP⁺单元格）。（B）中的图例；0，接种细胞后一天，但仍在含有EGF的FGF2生长培养基中培养；用含Forskolin的分化培养基替代生长培养基后1-7、1-7天。比例尺：50μm。

The multipotency ofSox2系统-GFP细胞分化为神经谱系后进行检测。在生长条件下，几乎所有Sox2系统-GFP细胞表达NSC标记物、NESTIN和SOX2(图2C)，而未检测到分化的神经细胞特异性标记物(图2C，数据未显示）。在forskolin的见证下，Sox2系统-GFP细胞分化为TuJ1、MAP2阳性神经元(图2C数据未显示）和DCX，并进入GFAP阳性的星形胶质细胞(图2C). 少突胶质细胞分化是通过共培养Sox2系统-P0（出生后第0天）大鼠海马神经元的GFP细胞(Song等人，2002年).Sox2系统-用携带CMV-βgal报告子的慢病毒标记GFP细胞，以将其与原代培养物区分开来。事实上，一些βgal⁺分化为RIP的细胞⁺少突胶质细胞(图2C)，证明了这一点Sox2系统-GFP细胞有可能产生所有三种主要神经谱系。

分化的时间进程Sox2系统-Western blot检测GFP细胞。与免疫染色结果一致，GFAP和TUJ1在未分化细胞中不表达Sox2系统-GFP细胞(图2B). 分化后，立即诱导GFAP表达，然后诱导TuJ1表达(图2B). 有趣的是，SOX2的下调与TuJ1诱导一致，但与GFAP的初始表达无关(Bani-Yaghoub等人，2006年) (图2B).

Sox2系统⁺细胞可以产生神经元、星形胶质细胞和Sox2系统⁺SGZ中的单元格

追寻…的命运Sox2系统⁺细胞体内,Sox2系统-将Cre/GFP慢病毒注射到ROSA26-loxP-Stop-loxP-GFP报告小鼠的齿状回(图3A) (Tashiro等人，2006年). 慢病毒载体的设计和病毒特异性的确认的详细信息在补充结果（图3S）。BrdU范式还用于1）仅跟踪靶向细胞的子细胞Sox2系统⁺细胞和2）排除追踪非靶向、非分裂神经元的命运(补充结果，图3S).

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图3

Sox2系统⁺细胞增殖产生分化的神经谱系和未分化的细胞

命运映射如（A）所示。慢病毒Sox2系统-将GFP/CRE注射到ROSA26-loxP-Stop-loxP-GFP报告小鼠的齿状回。转导CRE重组酶删除“STOP”密码子以激活GFP报告基因表达（绿色）Sox2系统⁺细胞。基因组水平的重组允许追踪目标细胞及其后代。病毒注射后10或28天，给予BrdU（红色）标记来自靶细胞的新生细胞（A）。注射BrdU一个月后，用细胞型特异性标记物检测子代的命运。Sox2系统⁺细胞发生细胞增殖，并产生对NEUROD（B）或DCX（C）以及PROX1阳性的神经元前体⁺颗粒神经元（D）。GFAP公司⁺（E） 或S-100β⁺（F） 胶质细胞也由Sox2系统⁺细胞。Sox2系统⁺细胞也有可能产生SOX2（G）或BLBP（H）阳性的未分化细胞。缩写：s，亚颗粒带；g、 颗粒层；m、 分子层。比例尺：10μm。

子细胞的命运Sox2系统⁺用细胞型特异性标记物检测细胞。三重IHC明确表明Sox2系统⁺细胞（GFP⁺记者）激增⁺)随后产生神经元（DCX、NEUROD或PROX1）。我们观察到的神经元命运包括神经元前体阳性(图3B)或DCX(图3C)PROX1阳性颗粒神经元(图3D)、CALBINDIN或NEUN（未显示数据）。大多数Sox2系统⁺细胞在出生后一个月内产生颗粒神经元(表1). 此外，一些靶向的子细胞Sox2系统⁺分化为GFAP的细胞⁺(图3E)或S-100β⁺(图3F)频率较低的星形胶质细胞(表1). 分化潜能Sox2系统⁺我们观察到的细胞到神经元（≈89%）和星形胶质细胞（≈7%）与BrdU或逆转录病毒介导的海马分裂细胞的命运图结果相当(Steiner等人，2004年;van Praag等人，2002年).

接下来我们研究了Sox2系统⁺细胞与未分化细胞的生成有关。事实上，约10%的后代来自靶向Sox2系统⁺维持SOX2表达的细胞(图3G)，2%的追踪细胞表达未分化细胞标记物BLBP(图3H). 这些数据共同表明Sox2系统⁺SGZ中的细胞不仅有可能产生神经元和星形胶质细胞，还可以作为新的未分化细胞的来源。

多能体识别Sox2系统⁺成人海马神经干细胞

虽然我们的命运图研究揭示了Sox2系统⁺细胞作为一个群体，尚不清楚Sox2系统⁺成年齿状回细胞保持多能性。因此，我们采用逆转录病毒介导的标记Sox2系统⁺细胞之间的血统关系Sox2系统⁺细胞和神经细胞类型来源Sox2系统⁺成年海马体中的细胞(Seri等人，2004年).

Sox2系统-产生Cre/GFP逆转录病毒以标记分裂Sox2系统⁺细胞排他性并克隆追踪其命运。首先，我们在Sox2系统⁺细胞通过带有GFP和SOX2抗体的双重IHC。大多数靶向细胞（GFP⁺)在将逆转录病毒注射到C57BL6小鼠齿状回7天后进行分析时，发现SOX2表达特异（92%±1.7，平均值±s.e.m，n=3）。其次，连续稀释Sox2系统-将Cre/GFP逆转录病毒注射到C57BL/6小鼠的齿状回中，以滴定产生少量簇的浓度。然后，我们推断出病毒浓度对应于每半球产生大约10个簇，以最小化来自不同子代的混合Sox2系统⁺细胞。

我们注射了0.5μlSox2系统-Cre/GFP逆转录病毒（约5×10⁶ROSA26R报告小鼠（R=GFP或β-GAL，n=54个半球）的齿状回和大脑在病毒注射后21天进行检测。为了确定集群中细胞类型的组成，使用细胞类型特异性抗体进行IHC。

这种方法在每个半球产生大约7个孤立的细胞簇，这些细胞簇可能来源于独立的Sox2系统⁺单元格(表2，6.7±1.5，平均值±标准偏差，n=54）。363个集群（GFP⁺或β-GAL⁺细胞），78%的簇是由神经元组成的单细胞克隆（NeuN⁺,图4A)，一种星形胶质细胞（GFAP⁺,图4B)或aSox2系统⁺细胞，其中10%是包含两个Sox2系统⁺电池（SOX2⁺,图4C)或2个神经元（NeuN⁺,图4D) (表2). 由于逆转录病毒只转导分裂细胞的两个子细胞中的一个，单细胞克隆是由Sox2系统⁺细胞向下游谱系转化。

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图4

血统追踪Sox2系统⁺单个单元格级别的单元格

Sox2系统-将GFP/Cre逆转录病毒注射到ROSA26R小鼠的齿状回以激活一个报告基因（β-gal或GFP报告基因），该基因用于追踪小鼠后代的命运Sox2系统⁺细胞。大多数克隆是单细胞簇，表明Sox2系统⁺细胞（GFP⁺或β-gal⁺细胞）变成神经元（a，NeuN⁺)，星形胶质细胞（B，GFAP⁺)或NSC。Sox2系统⁺细胞能够产生多个NSC（C，SOX2⁺，箭头和箭头）或神经元（D，NeuN⁺箭头和箭头）。还发现了含有异质细胞群的多细胞簇。显示了一个克隆Sox2系统⁺NSC可产生一个神经元（NeuN⁺，箭头）和一个星形胶质细胞（GFAP⁺，箭头）（E）。一些克隆包含Sox2系统⁺NSC（SOX2⁺，箭头）和神经元（NeuN⁺，箭头），它们在物理上相互关联（F）。Sox2系统⁺神经干细胞能够产生神经元（NeuN⁺，右箭头）和Sox2系统⁺NSC（SOX2⁺，左箭头），在径向过程（G）中具有GFAP表达式（两个箭头）。缩写：s，亚颗粒带；g、 颗粒层；m、 分子层。比例尺：10μm。

我们还能够识别出一些包含混合细胞群的簇，这些混合细胞群有助于检测Sox2系统⁺单个单元格级别的单元格。15个集群具有Sox2系统⁺和一个NeuN⁺细胞紧密相连，表明Sox2系统⁺细胞能够产生一个神经干细胞和一个分化的神经元(图4F,图4S). 我们还发现了一个由一个NeuN组成的集群⁺和一个GFAP⁺（但SOX2^-)单元格，它支持Sox2系统⁺可产生神经元和星形胶质细胞的神经干细胞(图4E). 有趣的是，一个簇包含一个神经元（NeuN⁺)和aSox2系统⁺放射过程中也表达GFAP的细胞(图4G,图4S). 这些结果清楚地表明Sox2系统⁺细胞不仅有可能产生分化的神经谱系（多潜能），而且能够产生放射状和非放射状Sox2系统⁺单细胞水平的细胞（自我更新），提供了以下证据Sox2系统⁺细胞确实是SGZ中自我更新和多能干的NSC。

径向和非径向之间的谱系关系Sox2系统⁺国家安全委员会

GFP作为记者的使用不仅允许Sox2系统⁺同时也可以可视化标记细胞的形态，这是抗体染色所无法实现的。转基因小鼠的分析确定了两种形态不同的Sox2系统-SGZ中的GFP细胞群：放射状细胞和非放射状细胞。径向的Sox2系统-GFP细胞特别有趣，因为有一种假说认为，在发育过程中，放射状胶质细胞可能代表NSC(Anthony等人，2004年;Malatesta等人，2003年;Miyata等人，2001年;Noctor等人，2001年)以及成年人的大脑(福田等人，2003年;Kronenberg等人，2003年;Mignone等人，2004年;Seri等人，2001年). 在…之间Sox2系统-在SGZ中，15%的GFP表达细胞具有独特的放射状形态，并与放射状胶质细胞标记物（包括NESTIN、GFAP和BLBP）共定位。此外，如当前研究所示Sox2系统-GFP细胞通过响应与跑步相关的生理有丝分裂信号而具有增殖的潜力，这表明放射状和非放射状细胞Sox2系统⁺细胞可能代表SGZ中的NSC人群。

Seri系列等人。执行了的命运映射Gfap公司⁺并建议Gfap公司⁺放射状形态的细胞是“真正的”神经干细胞(Seri等人，2004年). 他们进一步提出，海马神经发生介导放射状神经干细胞向非放射状形态成神经细胞的线性过渡。然而，没有确凿的证据表明桡动脉的这种谱系转换Gfap公司⁺细胞向非放射细胞转化以及放射细胞的自我更新能力Gfap公司⁺细胞已经被报道。然而，在目前的研究中，我们发现非放射状Sox2系统⁺细胞是主要的增殖群体，无放射状Sox2系统⁺久坐小鼠体内的细胞正在分裂，这与放射状细胞的观察结果一致内斯汀⁺SGZ中细胞很少分裂(Kronenberg等人，2003年). 根据我们的研究结果，我们不能完全排除放射状细胞来源于非放射状细胞但频率较低的可能性。事实上，当我们追踪到分裂的血统时Sox2系统⁺神经干细胞，我们确定了一个包含分化神经元和Sox2系统⁺放射过程中GFAP阳性的细胞。这一观察提出了非放射状的可能性Sox2系统⁺细胞（因为逆转录病毒转导需要细胞增殖）可以产生放射状Sox2系统⁺细胞，导致我们的新假设：非放射状Sox2系统⁺细胞是多能和自我更新的神经干细胞，可以引起放射状Sox2系统⁺细胞和静态放射状细胞Sox2系统⁺细胞可能是一个很少分裂的细胞库。非径向之间的平衡Sox2系统和径向Sox2系统⁺/Gfap公司⁺特别是，细胞可能在提供只能产生非放射状细胞的保留的、未提交的细胞方面发挥重要作用Sox2系统细胞依次排列(图6A). 从放射细胞向非放射细胞转变的其他证据需要证实我们假设的后一部分。

慢病毒载体生产和立体定向注射

调控慢病毒载体表达GFP/CRE融合蛋白Sox2系统启动子产生。3.1 kb的Sox2系统克隆由近端启动子（2.7kb）和远端神经增强子（0.4kb）组成的启动子，表达GFP报告子和CRE重组酶融合蛋白。该增强子含有足够的顺式元素，能够重述内源性Sox2系统在中枢神经系统中的表达(Ferri等人，2004年;Zappone等人，2000年). 关于慢病毒主干和病毒产生的详细信息已在前面描述过(Consiglio等人，2004年). 向ROSA26报告小鼠（ROSA26R，R=β-gal或GFP，Jackson实验室）的齿状回注射1μl复制不全慢病毒（p24值为60-100 ng），以切除“停止信号”，随后激活β-半乳糖苷酶（β-gal）或GFP报告基因表达。立体定位坐标以毫米为单位列出，距离角点：AP=-2，ML=+1.5，DV=-2。病毒注射后10或28天，小鼠每天接受BrdU注射（100 mg/kg体重），持续7天，以标记分裂群体。的命运Sox2系统⁺在最后一次注射BrdU后4周，通过使用细胞类型特异性标记物进行IHC检查在此期间发生增殖的细胞。

逆转录病毒载体的产生和谱系追踪

用于慢病毒介导的命运定位的相同Sox2-GFP/CRE构建被克隆到Moloney白血病病毒主干的SmeI和PmeI位点。先前详细描述了逆转录病毒主干和病毒生产过程(Zhao等人，2006年). 向C57BL/6或ROSA26报告小鼠（ROSA26R，R=β-gal或GFP，Jackson实验室）注射0.5 ul逆转录病毒，以分别测定病毒滴度或在齿状回进行谱系追踪。为了进行谱系追踪，27只年龄在6周到3个月之间的ROSA26R小鼠在两侧大脑半球接受了逆转录病毒，并在注射后21天对其齿状回进行了分析。注入坐标和特定的IHC方法如上所述。识别来源于Sox2系统⁺NSC以一级抗体（与二级抗体结合的荧光团）的形式列出。为了分析ROSA26 GFP报告小鼠，使用了鸡αGFP（FITC）、山羊αSOX2（Cy5）、兔αS-100β（AMCA）和小鼠αNEUN（Cy3）。为了对ROSA26β-gal报告小鼠进行分析，使用了山羊α-β-gal（FITC）、兔αSOX2（Cy5）、豚鼠αGFAP（AMCA）和小鼠αNEUN（Cy3）。所有图像均由共焦显微镜拍摄，使用窄带滤波器检测特定信号。

运行实验和量化

七只转基因小鼠分别被关在笼子里，自愿使用轮子。作为对照，7只野生型同窝仔被安置在没有转轮的相同笼子里。所有小鼠在跑步期间每天接受一次100 mg/kg BrdU，并在最后一次注射BrdU后24小时处死。大脑切片的制备如上所述。计数GFP阳性细胞，每12个^第个覆盖齿状回整个头-尾轴的切片用GFP抗体染色。对齿状回两侧进行盲法计数。齿状回的面积通过体视学（Microbright Field，Inc.）测量，体积通过厚度相乘计算。为了计数DCX-、Ki67-和其他双阳性细胞，以440μm的间隔进行4次切片（每12次^第个从每只动物中选择含有背海马的切片，并用各自的抗体进行染色。染色后，用共焦显微镜扫描整个齿状回，并收集z系列图像。使用变形金刚（分子器件）计算单染或双染细胞的数量。使用Statview（SAS）进行统计分析（非配对t检验，双尾，p<0.05）。所有图形均在Prism（GraphPad）中绘制。

我们感谢盖奇实验室成员的批判性阅读和讨论，感谢玛丽·林恩·盖奇的编辑支持。一只老鼠Sox2系统发起人是Angie Rizzino博士（内布拉斯加州大学医学中心，奥马哈，东北部）慷慨赠送的礼物。我们感谢Okano Hideyuki博士（日本庆应义塾大学）和Nathaniel Heintz博士（纽约洛克菲勒大学）分别提供MUSASHI-1和BLBP抗体。H.S.是ASPET-Merck奖学金的获得者。A.C.是Telethon博士后奖学金的获得者。这项工作得到了Pritzker神经发生联盟、了望基金、国防高级研究计划署（DARPA）、美国国立卫生研究院（NS-050217和NS-0502842）和美国国家老龄研究所（AG-020938）（F.H.G）的支持。