用于细胞内吞的树突状细胞受体，2005年12月，可通过主要组织相容性复合体II类-阳性溶酶体室循环和增强抗原提呈

克隆和转染

将编码DEC-205和MMR细胞内域的cDNA从细胞外表达域中分别克隆到TA载体（Invitrogen）中，并使用QuikChange进行寡核苷酸定向突变^®（Stratagene）进行了测试。STOP密码子和酪氨酸到丙氨酸的交换被引入DEC尾部的不同部分（参见图1A） ●●●●。所有突变均通过测序进行验证（洛克菲勒大学DNA技术中心）。使用标准方法，将突变的DEC尾部克隆到pApuro载体的BamH1-EcoR1位点（纽约州珠江市心血管分子生物学系Lederle实验室美国Cynamid公司Kurosaki博士的礼物），该位点位于人类FcγIII受体胞外结构域的序列编码后面(Kolanus等人，1993年). 通过测序验证插入正确后，将这些构建物转染到MHC II⁺（I-E^k个)成纤维细胞系DCEK。廉政公署。磷酸钙沉淀法测定Hi7（Stratagene）。随后，将细胞分裂成100 mm的培养皿，并以5μg/ml的最终浓度施用嘌呤霉素（Calbiochem）进行筛选。挑选2-3周后在筛选条件下生长的菌落并进行扩增。FACS定期监测CD16的表面表达^®，使用抗CD16抗体（克隆3G8）。

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图1

DCs中DEC-205和MMR的不同细胞内定位和功能。（A） 本地化。未成熟第6天骨髓DC（BmDC）(Inaba等人1992)将其接种在盖玻片上，固定，并用兔抗DEC-205和MMR（红色）以及晚期内体/溶酶体成分LAMP-1或MHC II（绿色）双重染色。包含红色和绿色标签的单个颗粒示例用箭头标记，并在合并图像中进一步以黄色显示同位化。（B） 抗DEC-205和MMR抗体的表面结合和呈现。第6天，将未成熟的骨髓来源DC与不同稀释液（如图所示）的抗DEC-205、抗MMR或免疫前兔血清在冰上孵育1小时。洗去未结合抗体。细胞与FITC-标记的抗-Ig孵育，以通过FACS评估表面结合抗体的数量^®（顶部），或与兔IgG启动的T细胞按分级剂量共培养，以测量兔抗体中肽的呈现情况（底部）。（C） 将DC与1:100稀释的抗DEC-205或抗MMR兔血清在冰上孵育1小时。洗去未结合抗体，并通过将DC与分别用抗DEC-202或抗-MMR抗血清引物的分级剂量T细胞共培养来检测兔抗体中的肽。

表面标记的流式细胞术分析

用胰蛋白酶（Boehringer）采集细胞，然后用冷PBS/7%正常山羊血清（vol/vol）培养，然后用以下杂交瘤上清液在冰上培养45分钟：抗-MHC II（14-4-4S；美国型培养物收集）、抗-ICAM-1（YN-1；美国型培养物收集）和抗-CD16（3G8）。用抗B7-1抗体（1G10；BD-PharMinen）检测B7的表达。在用冷PBS/1%FCS（vol/vol）洗涤后，添加FITC-标记的小鼠抗鼠Ig或山羊抗小鼠Ig（Jackson ImmunoResearch Laboratories）二次试剂，最终稀释度为1μg/ml，加入PBS/1%FCS（vol/vol）。在冰上放置45分钟后，清洗细胞并将其重新悬浮在含有1μM碘化丙啶（Sigma-Aldrich）的PBS中，以在使用FACScan™（Becton Dickinson）进行荧光分析期间将死细胞逐出。

人IgG的表面结合与内化

将人IgG（HuIgG；Jackson ImmunoResearch Laboratories）在PBS中稀释至1 mg/ml。在65°C下孵育30分钟，形成聚集物。此后，将等分试样储存在4°C下，直到使用，但不超过1周。在一些抗原呈递试验中，通过在室温下与山羊抗HuIgG抗体孵育4小时来聚集HuIgG。为了检测HuIgG的表面结合，收集细胞并用冷PBS/1%FCS（vol/vol）洗涤，然后用单体或聚集的HuIgG-（aggHuIgG=0.1-100μg/ml）在冰上培养45分钟。用冷PBS/1%FCS洗涤后，用FITC-标记的羊抗人IgG抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）在PBS/1%FCS（vol/vol）中以1μg/ml的最终浓度添加。在冰上放置45分钟后，清洗细胞，将其重新悬浮在PBS中，并在FACScan™上进行分析。为了测量内在化HuIgG，DCEK。廉政公署。将Hi7细胞接种到96个培养皿（20000个细胞/孔）中，培养过夜，然后转移到冰上，然后添加最终浓度为50μg/ml的HuIgG。45分钟后，用培养基清洗去除未结合的HuIg g，收获等分细胞并用4%多聚甲醛（PFA）固定。剩下的细胞在37°C的R7中进一步孵育，然后收集、固定细胞，并用上述FITC-标记的山羊抗人IgG抗体染色。为了检测内部化的HuIgG，在加入FITC-标记的山羊抗人抗体之前，用PBS/0.1%（体积/重量）皂苷（Sigma-Aldrich）培养10分钟，使细胞渗透。在时间进程实验中，通过将固定细胞（表面结合HuIgG）的平均荧光值减去固定细胞和渗透细胞（内部结合和表面结合HuIgG）记录的平均荧光来计算内部化HuIgG-的数量。

受体再循环

细胞在10μg/ml环己酰亚胺（CHX；Calbiochem）中培养2 h，足以阻断蛋白质生物合成，评估方法如下[³⁵S] 蛋氨酸标签（未显示）。然后，通过在37°C下将细胞在CXH和aggHuIgG（100μg/ml）存在下孵育10分钟，然后在冰上冷却细胞1小时，使表面CD16饱和。随后，在补充CXH的R7中培养细胞，在不同时间，通过培养循环CD16受体检测到¹²⁵冰上I-HuIgG浓度为10μg/ml。结合HuIgG通过γ计数（Wallac）测量。

L细胞和DC的共焦免疫荧光显微镜

将L细胞接种到LabTek组织培养室（Nunc）中并培养过夜。用温热的RPMI培养基清洗细胞两次，用4%多聚甲醛/PBS（wt/vol）在室温下固定20分钟，并在室温下用渗透缓冲液（含有10%正常山羊血清[GIBCO BRL]、0.05%皂苷[Sigma-Aldrich]、10 mM甘氨酸[Sigma Aldrich]]的RPMI）培养15分钟使其渗透。或者，如前所述，使用GM-CSF从骨髓前体培养DC(Inaba等人，1992年). 第6天，当培养物中含有大量未成熟DC聚集物和丰富的MHC II分室（MIIC）时(Pierre等人1997)，将细胞移出，并应用于阿尔西安蓝涂层的玻璃载玻片上，如上所述进行固定。在渗透缓冲液中进行两次洗涤后，在室温下用以下抗体培养细胞45分钟：抗MHC II（M5/114；美国型培养物收集）、抗溶酶体相关膜蛋白1（LAMP-1）（克隆ID-4B；耶鲁大学医学院Ira Mellman博士馈赠，康涅狄格州纽黑文）、，抗转铁蛋白受体（TfR）（C2F2；美国型培养物收集）、抗CD16（克隆3G8）和抗DEC-205的单克隆或多克隆抗体(Swiggard等人，1995年)和MMR（用克隆的MMR外部结构域免疫家兔制备）。在双标记实验中，使用了FITC-结合的MHC II和LAMP-1抗体（BD-PharMinen）。对于未结合抗体，我们用适当的FITC或德克萨斯红标记的二级试剂在渗透缓冲液中对细胞染色45分钟，这些试剂被小鼠或大鼠蛋白质吸收，并以1μg/ml的最终浓度使用。为了检测内吞HuIgG，将FITC-标记的山羊抗HuIgG抗体以1μg/ml的浓度涂抹在渗透缓冲液中。将载玻片安装在水溶液中（Polysciences），并通过共焦激光扫描显微镜（蔡司）进行检查。蔡司软件用于拍摄和覆盖图片。使用Photoshop制作合成图形^®（Adobe Systems）。

转染DCEK中嵌合DEC-205/CD16受体的表达。廉政公署。Hi7细胞

内吞受体的靶向是由其细胞内结构域内的氨基酸序列决定的（综述见Bonifacino和Dell'Angelica 1999). 对三种同源凝集素（MMR、DEC-205和磷脂酶A2受体（PLA2R））的细胞溶质域（“尾部”）的重新检查表明，MMR和PLA2R的尾部彼此非常相似，但与DEC-2005不同（在图2A） ●●●●。所有三条尾巴都包含一个膜近端、推测的包被凹坑定位序列(图2A、 下划线）以便理解(Collawn等人，1990年)，但DEC-205的远端区域不同，包含三个酸性氨基酸序列(图2A、 EDE）。有趣的是，其他受体的酸性序列与细胞内分选有关(Matter等人，1993年;Voorhees等人，1995年;Wan等人，1998年;Piguet等人，1999年;Simmen等人，1999年).

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图2

胞质域用于研究内吞受体的靶向性。（A） 吸附性内吞作用的三种多连接素受体的细胞质域序列：DEC-205、PLA2R和MMR。下划线表示通过包被凹坑内吞的一致序列；黑体字表示一簇酸性残基（EDE），假定其引导DEC-205超越早期内体；灰色阴影显示尾巴中有类似的氨基酸。（B） 将突变引入DEC尾部（箭头），导致所示位置的截断（ST，短尾；IT，中间尾；LT，长尾），或氨基酸替换：交替尾（at）中的Y到A，AAA尾中的EDE到AAA。（C） 未转染DCEK中CD16和MHC II的表面表达。廉政公署。Hi7细胞（无）或转染CD16融合受体的细胞（WT、LT、IT、ST、AT、AAA和MMR）。用抗CD16（克隆3G8）、抗I-E染色^k个（克隆HB32），或同型对照抗I-A^k个（克隆10.216），其次是FITC山羊抗小鼠F（ab′）₂抗体。

确定细胞质尾部的哪些成分需要通过晚期内体或溶酶体进行有效靶向和呈现(图1)，我们构建了包含HuFcγIII受体或CD16的外部IgG结合域和不同DEC-205细胞溶质尾部的嵌合受体(图2B） ●●●●。除了野生型（WT）DEC-205尾之外，我们还截短了末端三个氨基酸（长尾，LT），残基19-31与推测的EDE远端靶向序列（中间尾，IT）以及残基6-31与包被坑序列（短尾，ST）。我们还制作了DEC-205尾部的突变体，将酪氨酸转化为包被凹坑序列中的丙氨酸（改变的尾部或AT），并在假定的远端靶向序列中将EDE转化为丙氨酸。我们使用野生型MMR尾部进行比较。

将CD16嵌合体转染到小鼠成纤维细胞样细胞系DCEK中。廉政公署。Hi7，表达MHC II以及T细胞共刺激分子B7-1（CD80）和ICAM-1（CD54）(Dubey等人，1995年). 获得了每个CD16嵌合受体的可比较的表面表达(图2C） 在稳定的转染剂中，不改变MHC II的表达(图2C） 或B7-1（未显示）。

CD16嵌合受体对HuIgG的结合、摄取和再循环

为了测试嵌合受体的功能，我们首先测量了HuIgG的结合，如WT-DEC:CD16所示(图3A） ●●●●。转染者均结合配体。10μg/ml时出现饱和，而未转染DCEK。廉政公署。Hi7细胞系(图3A、 无）未绑定HuIgG。如功能性FcγRIII所预期的那样，结合需要人IgG热聚集(Unkeless等人，1981年). 在PAGE上，加热到65°C并持续30分钟后，HuIgG的聚集量（分子量>200000 D）小于10%(图3B） 因此，表达的嵌合受体在<1μg/ml aggHuIgG时发生饱和结合。当测定结合配体对pH的敏感性时，aggHuIgG开始在pH 5下洗脱，只有40%残留在pH 4下(图3C） ●●●●。

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图3

通过CD16 DEC-205嵌合受体结合配体、摄取和再循环。（A） aggHuIgG与转染细胞的结合。将转染WT-DEC/CD16的细胞（WT）和未转染的细胞（None）用分级剂量的aggHuIgG在冰上培养1h。洗涤后，用FITC山羊抗HuIgG F（ab′）检测表面结合IgG₂和FACS^®用3G8和FITC山羊抗小鼠F（ab′）对细胞进行表面CD16染色₂与WT细胞和所有其他转染剂结合（参见图1)类似。（B） 为了检测加热HuIgG制剂中的微量aggHuIgG-，在还原条件下用SDS-PAGE分析样品。（C） 在酸性pH下将HuIgG洗脱到CD16。在不同pH下将aggHuIgG洗脱到CD16，预测在弱酸性区室中配体的释放。（D） aggHuIgG的内吞作用。将未转染细胞（无）和具有不同DEC:CD16嵌合受体（WT、ST）的转染体与aggHuIgG（10μg/ml）在冰上培养1h。将等分试样固定并立即进行表面结合HuIgG染色（粗体线），或在37°C下孵育4小时（细线），然后固定并用FITC-标记的抗HuIgG染色（第一列，仅固定）。在用FITC-标记的抗HuIgG（第二列）染色之前，细胞也被渗透，以显示内吞的HuIgG。（E） 吸纳HuIgG。细胞系在冰上与aggHuIgG孵育，转移到37°C不同时间，并用FITC-标记的抗HuIgG-F（ab′）染色₂没有或有预先渗透。平均荧光由FACS测定^®分析，内化IgG的量绘制为总表面结合IgG百分比。（F） CD16嵌合受体的再循环。用CHX处理细胞2小时，然后用100μg/ml aggHuIgG孵育，并转移到冰上，以饱和所有CD16嵌合受体的结合（参见图2A） ●●●●。清洗后，将细胞在37°C下在CHX的持续存在下培养不同时间，并通过结合¹²⁵I-HuIgG。回收受体的数量绘制为表面结合量的百分比¹²⁵用未经处理的细胞获得I-HuIgG。

为了监测内吞作用，将aggHuIgG与每个转染剂结合在冰上，并将等分样品转移到37°C下2小时^®用于跟踪单细胞水平的摄取。FITC抗HuIgG与固定细胞的结合检测到残余表面HuIgG-，与固定渗透细胞、检测到的表面和细胞内HuIgG。对于WT-DEC:CD16表达细胞，在37°C下追逐2小时后，表面不再检测到HuIgG(图3D） ，但在渗透性细胞中获得了强染色，表明DEC尾部介导了与异源受体结合的配体的摄取。

表达LT-、IT-和AT-DEC:CD16嵌合体的细胞也获得了类似的结果，即结合HuIgG的内吞作用（未显示）。相比之下，转染短六氨基酸尾（ST-DEC:CD16）的细胞缺乏假定的包被小窝定位序列，表面IgG没有明显损失(图3D） ，表明氨基酸残基6-31的缺失阻止了DEC:CD16嵌合受体的内吞作用。在更详细的时间进程研究中(图3E） ，我们包括表达AAA-DEC:CD16和MMR:CD16的细胞。同样，ST-DEC:CD16嵌合体没有内化，而一半的表面Ig在15分钟内通过其他CD16嵌体进入细胞。AT-DEC:CD16嵌合体在包被小窝定位部位含有酪氨酸残基突变，尽管其内吞速度稍慢，但能够内吞(图3E） ●●●●。因此，所有嵌合CD16受体都与aggHuIgG结合，除ST-DEC:CD16外，其他所有受体都介导配体的快速吸附。

为了检查DEC:CD16嵌合受体的循环，我们使用10μg/ml的CHX阻断蛋白质合成2小时。然后添加饱和剂量的aggHuIgG，将细胞放在冰上，清洗，并将L细胞转移到37°C。该过程足以使所有CD16嵌合受体饱和（数据未显示）。此后，在随后的时间点，我们添加了¹²⁵I标记的aggHuIgG检测功能性CD16受体的再现。完整的细胞溶质尾（WT，MMR）在内化后1小时内回收，但截短的中间DEC尾（IT）和AAA-DEC:CD16嵌合体回收速度较慢(图3F） ●●●●。1小时的循环时间可能低估了通过DEC-205尾部的循环速度，因为L细胞中液泡系统的pH值可能不够低，无法快速洗脱所有结合的HuIgG配体。正如预期的那样，ST尾部没有再循环，即再生功能性CD16，因为没有发生内吞作用。为了排除从内吞池中补充受体，而不是再循环，我们在37°C下暴露于aggHuIgG的细胞中重复了实验，以占据细胞内储存。再次，新的HuIgG结合受体发生了再循环（数据未显示）。我们得出的结论是，DEC-205和MMR尾部都能够介导配体摄取、释放和再循环到细胞表面，并且这些活动可以由我们制备的所有突变细胞溶质尾部执行，除了缺少包被小孔定位和摄取序列的短尾。

CD16嵌合受体靶向的细胞内隔室

在研究的这一阶段，DEC-205和MMR尾部似乎相似。在检测CD16嵌合受体和HuIgG配体的细胞内靶向性以及HuIgG-激发T细胞的抗原呈递试验中，DEC-205尾部的独特特征变得明显。首先，我们进行共聚焦免疫荧光显微镜检查，以同时鉴定MHC II和LAMP-1或早期内体标记物TfR。在所有转染体中（此处显示的WT），MHC II主要与LAMP-1共定位，LAMP-1是核周区晚期内体/溶酶体的标记(图4，顶部），而不是外围的TfR(图4，底部）。

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图4

MHC II的存在⁺CD16转染体中的溶酶体隔室（WT-DEC:CD16在此显示）。稳定转染DCEK。廉政公署。将组织培养箱载玻片上的Hi7细胞固定并双重标记MHC II和溶酶体（LAMP-1）蛋白（顶部）或TfR（底部）。通过FITC和德克萨斯州红色标记的二级抗体观察一级抗体。通过共聚焦激光扫描显微镜，MHC II在所有细胞中与LAMP-1共定位（黄色），但不与TfR共定位。

在IgG配体缺失或存在的情况下，WT-DEC:CD16嵌合受体有效地定位于晚期内体/溶酶体隔室，如与LAMP-1和MHC II在核周区共定位所示（左柱图5A和图B）。相反，MMR:CD16没有与LAMP-1共定位，主要在外周细胞质中发现(图5A） ●●●●。靶向晚期内体的受体由DEC-205细胞质尾部远端发现的序列介导，因为DEC-IT:CD16嵌合体在DEC-202细胞质末端缺乏18-31氨基酸，无法在MHC II中积累⁺溶酶体和发现于细胞质的小泡中(图5A和图B). ST-DEC:CD16嵌合体未能完全介导内吞作用，并沿细胞膜分布(图5A） ●●●●。

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图5

CD16嵌合受体在DCEK中的典型分布。廉政公署。无配体（此处显示）或存在配体的Hi7细胞，10μg/ml aggHuIgG。（A） CD16和LAMP-1双重标记。固定组织培养箱载玻片上的细胞，并对其进行CD16（绿色，FITC-标记的抗鼠免疫球蛋白）和LAMP-1（红色，德克萨斯州红色标记的抗大鼠免疫球抗原）染色。箭头表示WT转染细胞中离散囊泡的结肠化，所有转染剂均显示为黄色（底行）。（B） CD16和MHC II双重标记。将生长在组织腔载玻片上的细胞固定，并用特定于物种的二次试剂染色CD16（红色）或MHC II（绿色）。用共焦激光扫描显微镜分析载玻片。WT转染细胞中单个囊泡的共定位示例用箭头表示，并以黄色显示（底行）。

为了遵循结合配体的靶向性，我们将L细胞与aggHuIgG在冰上孵育30分钟，然后在37°C下进行30分钟追逐。在冰上培养后，在所有转染体上均发现表面结合HuIgG(图6A、 顶部），确认FACS^®数据(图3A） ●●●●。37℃孵育后，HuIgG主要存在于WT-DEC:CD16转染体的溶酶体中，与LAMP-1在核周区共定位(图6A、 左下角）。相反，HuIgG被IT-DEC:CD16或MMR:CD16转染细胞内吞，与早期内体中的TfR共定位（数据未显示），表明与这些受体结合的配体未能有效到达溶酶体(图6). HuIgG与ST-DEC结合：CD16嵌合体在30分钟追逐期内保持表面结合。从这些结果中，我们得出结论，DEC-205细胞质结构域以CD16嵌合体及其MHC II配体为靶点⁺灯1⁺液泡，而MMR的细胞质域主要靶向早期内体。靶向晚期内体的序列位于DEC-205尾部的位置18和31之间。MMR:CD16和AAA-DEC:CD16与WT-DEC:CD16的不同靶向路线应反映在这些受体再循环的不同时间过程中，但事实上，未被占用的受体以类似的速度重新出现。然而，由于早期内体的pH值可能不够低，无法快速洗脱所有结合的HuIgG配体，因此通过早期内体腔室的再循环速度可能被低估。

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图6

CD16转染体内吞HuIgG的细胞内定位。（A） 内吞HuIgG和LAMP-1的双重标记。在组织腔载玻片上生长的细胞与10μg/ml HuIgG在冰上孵育1小时。洗去未结合的HuIgG，立即固定细胞或在37°C的培养基中进一步培养30分钟。用FITC标记的抗HuIgG（绿色）和抗LAMP-1抗体（红色；得克萨斯州红色标记的二级抗体）对细胞进行双重染色。

嵌合CD16受体内化配体对CD4的表达⁺T细胞

为了确定是否处理并呈现了与CD16嵌合受体结合的抗原，我们用aggHuIgG对转染细胞进行了6小时的脉冲处理，并分析了其是否呈现给激发的T淋巴细胞。表达WT-DEC:CD16的细胞诱导了强烈的T细胞增殖，饱和浓度为1μg/ml的aggHuIgG(图7A） ●●●●。由抗HuIgG和可溶性HuIgG形成的免疫复合物也能有效地呈现，而非聚集HuIgG-不与CD16受体结合(图3A） 高剂量（100μg/ml；图7B和图C).

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图7

DEC-CD16转染细胞的抗原呈递。（A） aggHuIgG的呈现。转染和未转染（无）DCEK。廉政公署。将Hi7细胞系与aggHuIgG孵育6小时，清洗后用于将抗原呈现给250000个纯化的HuIgG-小鼠淋巴结T细胞。72小时时，用[^三H] 胸腺嘧啶核苷12h，并测定其结合放射性。（B） HuIgG免疫复合物的呈现。与A组一样，转染和未转染（无）DCEK。廉政公署。用可溶性或抗体聚集的HuIgG培养Hi7细胞系。然后进行抗原呈递分析。

当研究突变的细胞溶质尾部时，LT-DEC:CD16嵌合体在低抗原浓度下诱导T细胞增殖方面与WT-DEC:CD16嵌合体没有区别。AT-DEC:CD16嵌合体（酪氨酸15被丙氨酸取代）仅显示轻微的反应减弱。相反，IT-DEC:CD16介导内吞和再循环(图3E和图F)但未能针对MHC II⁺灯1⁺隔间(图5)，抗原提呈效率低下。表达MMR:CD16嵌合体的细胞与表达IT-DEC:CD16的细胞相似，因为它们只能在高浓度HuIgG（10–100μg/ml；图7). ST-DEC:CD16（缺乏DEC-205细胞质域中最远端的25个氨基酸）在未转染DCEK获得的背景值以上未刺激T细胞增殖。廉政公署。Hi7细胞。这些数据表明，有效呈现抗原所需的序列与内吞和再循环所需的不同。IT-DEC:CD16和MMR:CD16嵌合体介导内吞和再循环，但在DEC-205细胞质结构域中发现的氨基酸18和28之间的额外信息需要用于靶向抗原处理区。

DEC-205胞质结构域的两个功能区

DEC-205尾部的膜近端区域包含FSSVRY序列，类似于许多其他受体中描述的包衣小窝定位序列(Goldstein等人，1979年). 这样的序列在LDLR的摄取中起作用(Chen等人，1990年;Matter等人，1993年)，变压器(Collawn等人，1990年)和MMR(Ezekowitz等人，1990年). DEC-205尾部长度为31个残基。删除残基19-31不会减少内吞作用，但进一步删除残基7-19，包括包被凹坑序列消融摄取。与其他受体功能降低相比，酪氨酸残基突变为丙氨酸并没有消除功能(Chen等人，1990年;Amigorena等人，1992年b;杰克曼等人，1998年)但与野生型DEC-205尾巴相比，其摄取率较低。DEC-205的包被小孔序列不是完全依赖于这个酪氨酸，或者另一个序列绕过了它的需要，例如，下一步将讨论远端尾部的三个酸性残基(Voorhees等人，1995年;Simmen等人，1999年).

DEC-205细胞溶质尾部更有趣的区域是远端区域。残基28-31似乎是多余的，但残基18-27对多种功能至关重要。在缺乏这种“远端靶向序列”的情况下，DEC-205尾部没有靶向晚期内体和溶酶体的受体或配体(图5)并且没有介导有效的抗原提呈(图7). 然而，摄取不需要远端靶向序列(图3E） 和膜回收(图3F） ●●●●。

DEC-205尾部末端的一簇酸性氨基酸（EDE）被证明对其独特的细胞内运动至关重要(图5和图7). 酸性簇还介导甘露糖-6-磷酸受体和呋喃的反高尔基网络检索，呋喃与细胞溶质分选分子PACS-1相互作用(Voorhees等人，1995年;Wan等人，1998年;Simmen等人，1999年). HIV-1 nef蛋白中只有两个酸性氨基酸通过β-COP向溶酶体靶向和降解内吞CD4分子发出信号(Piguet等人，1999年). 在细胞转染过程中，酸性残基将LDLR靶向基底外侧部位(Matter等人，1992年). LDLR相关蛋白也包含一簇酸性氨基酸。该受体介导鞘脂、α2-巨球蛋白和补体成分C3在溶酶体中的摄取和降解(Hiesberger等人，1998年;Meilinger等人，1999年)，但酸性氨基酸参与溶酶体靶向作用的研究尚未见报道。本文中的实验比较了DEC-205和MMR，因为它们的外部多连接结构域和它们在抗原提呈中的拟议功能相似。未来的工作将比较DEC-205的胞质结构域与LDLR家族，以及在非抗原呈递细胞（如上皮细胞）中的功能。

我们感谢在编写手稿期间为我们提供宝贵建议的许多同事。

这些实验得到了德国Forschungsgemeinschaft向K.Mahnke（MA 1924/1-1）提供的奖学金、青少年糖尿病基金会和国家卫生研究院向R.M.Steinman（AI13013和AI39672）提供的资助、人类科学前沿计划向M.Nussenzweig提供的资助以及S。Lee（国立卫生研究院医学科学家培训项目资助GM07739）。