未折叠蛋白反应调节分泌和膜蛋白生物发生的多个方面以及内质网质量控制

本研究中使用的质粒

第15页(第61节，LEU2)由Randy Schekman博士（加利福尼亚大学伯克利分校）和pMR713提供(KAR2、LEU2)由Mark Rose博士（新泽西州普林斯顿大学普林斯顿分校）提供。

遗传筛查

屏幕的报告菌株是通过首次杂交JC147和EY0060构建的。对衍生的二倍体进行孢子化、四分体解剖，并对以下基因型的单倍体进行筛选：材料 一,ire1:：TRP1,ade2,ade3（ade3）,UPRE-LacZ:：HIS3分离出一株这样的菌株，并用pDN336转化以产生DNY421。

对于诱变，50 A₆₀₀DNY421细胞的OD单位在无菌水中清洗一次，然后再悬浮在25 ml 0.9%KCl中。在不断搅拌的情况下，从安装在15厘米上方的光源向细胞提供四个30秒的短波紫外线脉冲。每次脉冲后，取下一小份，连续稀释一部分，并铺在YPD板上，以确定杀灭率。将每等分样品的剩余部分造粒，再悬浮在10 ml YPD培养基中，并在滚筒上恢复18小时。到目前为止，所有程序都在暗室中进行，并在30°C下孵育。接受120秒紫外线剂量的细胞杀灭率为62%，并用于筛选。突变细胞散布在缺乏额外腺嘌呤的YPD板上。通过重新分析单个菌落，挑选并重新筛选非扇形菌落（具体数字见结果）。将分离物回交到DNY420和通过恢复其各自杂合子二倍体的群体扇区表型确定的隐性突变体。进行四分体切割以确定突变体的等位基因复杂性。只有那些表现出2:2分离模式，表明存在单一突变基因的人被继续研究。在进一步分析之前，所有菌株至少回交两次。

进行互补试验以确定最初20个组中代表的基因数量。互补菌株被评分为产生菌落扇形二倍体的菌株。然而，在所有可能的杂交完成之前，许多菌株组合产生了非分割二倍体，表明未完成，因此表明同一基因的不同等位基因。对二倍体进行四分体分析后，确定在大多数情况下，突变等位基因是不连锁的。连锁标准是突变体与野生型孢子的4:0分离。对所有可能的杂交进行四分体分析，以分配连锁群。

PER基因的克隆与鉴定

采用了两种通用的克隆方法每（ER中的蛋白质加工）基因。第一个利用了可反选标记，URA3公司，包含在pDN336中(Boeke等人，1984年). 自从每突变体依赖于爱尔兰共和国1pDN336缺失的细胞无法在含有5-氟代甲酸（5-FOA）的培养基上生长。突变等位基因的互补缓解了对爱尔兰共和国1从而可以从基因组文库中选择互补质粒。这个性能5和性能8基因是用第一种方法克隆的。

利用基于多拷贝YEp13载体的酵母基因组文库转化突变细胞(Lagosky等人，1987年). 转化后，将细胞在SC-Leu培养基中生长过夜，使接受互补质粒的转化体失去pDN336。随后将转化物电镀，并在30°C下在含有5-FOA（1 mg/ml）的SC-Leu培养基上培养。通过锆珠破坏和使用Wizard Miniprep试剂盒（Promega）纯化，从5-FOA抗性分离物中回收质粒。转化为细菌DH5α细胞后进行质粒扩增。通常将回收的质粒重新转化为相应的突变菌株，以评估扇形表型的互补性。尽管这种方法在性能5和性能8，对于尝试的其他菌株来说，它的成功率较低。携带截短质粒导致假阳性的高发生率爱尔兰共和国1库中包含的为过程添加了一个额外的层，这非常耗时。

第二种方法使用低拷贝基因组文库（用于克隆性能2,性能4,性能13、和性能16). 基于YCp50的图书馆(Rose等人，1987年)，要求将报告器pDN336替换为pDN388以兼容。将文库转化的突变菌株以低密度（400 cfu/板）扩散到SC-Ura/腺嘌呤发光板（6μg/ml）上，以形成菌落颜色表型。通常，筛选10000到25000个转化子以恢复分段。报告者的阳性被治愈，补充质粒被恢复如上所述。将回收的质粒转化回相应的突变菌株，以确认互补性。

对所有克隆进行DNA序列分析，以确定插入物的身份（宾夕法尼亚州立大学大学公园核酸设施）。利用引物N168（5′-CGCTACTTGGAGCCACTAGAC-3′）和N169（5’-ATCGGTGATGGCGATAT-3′）获得了载体/插入连接的序列。连接序列提交给酵母菌属基因组数据库(http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces网站/)获得完整的插入序列和开放读帧的恒等式。插入序列用于使用标准重组DNA方法进行缺失映射，以确定特定的互补基因。将来自高拷贝文库（YEp13）的基因亚克隆插入到质心质粒中以评估互补性。

细胞标记和免疫沉淀

通常为3 A₆₀₀对数期细胞的OD单位被制成颗粒，并重新悬浮在0.9 ml缺乏蛋氨酸和半胱氨酸的SC培养基中。在适当温度下培养30分钟后[³⁵S] 将Met/Cys（Pro-mix；Amersham Pharmacia Biotech）添加到细胞中5或10分钟。在适当的情况下，通过添加冷蛋氨酸/半胱氨酸至最终浓度2 mM开始追逐。通过添加10%的三氯乙酸终止细胞标记/追逐。通过添加0.4 ml 0.5 mm的锆珠使细胞均匀化，然后在微型搅拌器细胞破碎器（Biospec产品）中搅拌。将匀浆转移至新鲜试管中，并与随后的10%TCA珠洗混合。离心后，将TCA沉淀颗粒重新悬浮在120μl IPS II（100 mM Tris碱，3%SDS，1 mM PMSF）中，并加热至100°C 5分钟。将不溶性碎片制成丸，并将40μl洗涤剂裂解液添加到560μl IPS II（1%Triton X-100，50 mM Tris，pH 7.5，1 mM PMSF，1μl酵母蛋白酶抑制剂鸡尾酒；Sigma-Aldrich）和适当的抗血清中。在4°C下孵育2小时后，将样品在16000下离心10分钟克将上清液转移到含有蛋白质a–Sepharose珠的新鲜试管中。将试管旋转30分钟，用IPS I（0.2%SDS，1%Triton X-100，50mM Tris，pH 7.5）洗涤三到五次，用PBS洗涤一次。用凝胶样品缓冲液洗脱免疫沉淀的蛋白质，通过凝胶电泳分离，并通过放射自显影法观察。

在测定蛋白质稳定性的脉冲相分析中，免疫沉淀通过使用LS5801闪烁计数器（Beckman Coulter）测量TCA可沉淀计数并调整裂解液的等计数进行标准化。

PER基因的功能

在满足生理关系的标准后，我们接下来评估了每突变体。为此，我们首先监测了膜蛋白Gas1p的加工和运输(Nuoffer等人，1991年). 由于Gas1p在其生物生成过程中经历了多种翻译后修饰，因此任何阶段的缺陷都可以通过凝胶流动性的变化来检测。Gas1p最初在胞浆中合成为60-kD前体，在蛋白质易位突变体中可检测到(Ng等人，1996年). 进入内质网后，通过N-和O-连接的糖基化以及添加糖基磷脂酰肌醇（GPI）膜锚将其表观分子量改变为110 kD，对其进行修饰(Nuoffer等人，1991年). 内质网中发生Gas1p折叠，需要形成分子内二硫键(Frand and Kaiser 1998年). 只有正确折叠后，Gas1p才能继续使用高尔基体（t_1/2<10分钟），其中碳水化合物修饰进一步将其凝胶流动性更改为125 kD(Nuoffer等人，1991年). 因此，可以通过监测Gas1p处理来检测各种ER功能中的缺陷。

野生型（W303）和每突变细胞被代谢脉冲标记为[³⁵S] 氨基酸5分钟，并加入过量的未标记蛋氨酸和半胱氨酸30分钟，以充分加工Gas1p(图2A、 车道2–22）。如所示图2，在任何车道上均未观察到preGas1p，表明每突变体表现出严重的蛋白质移位缺陷。然而，大约一半的突变体在加工成成熟的125kD形式时有缺陷。这些结果表明ER蛋白加工功能存在缺陷，可能包括糖基化、折叠、GPI-锚添加或转运。

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图2

Gas1p和CPY的处理每突变体。对数生长的野生型和突变细胞被代谢标记为[³⁵S] 蛋氨酸/半胱氨酸在30°C下保持5分钟，然后追逐30分钟。使用单特异性多克隆抗血清从洗涤剂裂解物中免疫沉淀Gas1p和CPY。作为对照，这些蛋白也从野生型裂解物中进行免疫沉淀，脉冲标记，无需追踪，以指示ER形式（第1道）。蛋白质在10–15%聚丙烯酰胺梯度凝胶上分离，并通过荧光成像进行可视化。显示了preGas1p、ER Gas1p和高尔基体/质膜Gas1p（高尔基体/PM）的位置（A）。对于CPY，ER（P1）、高尔基体（P2）和成熟液泡形式（CPY）显示在左侧，液泡糖基化形式（-1、-2、-3、-4）显示在B的右侧。

为了进一步区分观察到的缺陷的分子性质，我们监测了另一种蛋白质，液泡蛋白酶CPY的加工(Simons等人，1995年). CPY的ER形式是核心糖基化形式（P1；图2B、 车道1）。CPY的P1形式被运输到高尔基体，在高尔基体中被外链糖基化修饰成P2形式。在运输到液泡后，ProCPY最终被蛋白质水解加工成成熟形式(图2B、 车道2）。经过糖基化的CPY仍然能够折叠并运输到高尔基体和液泡。在液泡中，它被加工成特征形式，命名为-1、-2、-3、-4(te Heesen等人，1992年). 因此，基于特定的凝胶迁移模式，可以很容易地区分N-连接糖基化缺陷突变体。

如所示图2B、 突变体根据3-1,每5-1,每6-1,每6-2,每12-1、和每14-1显示CPY糖基化，表明存在缺陷的N-连接糖基化。相应地，这些突变体合成了具有糖基化突变体预期迁移率改变的Gas1p形式(图2A） ●●●●。下糖基化形式的大小表明，大多数CPY在每个突变体中都被蛋白质水解加工成成熟形式，这表明这些突变体在从内质网到高尔基体的蛋白质运输方面通常没有缺陷。

PER5/RFT1基因是N-连接糖基化所需的新UPR靶点

我们选择分析每5-1因为它表现出最严重的糖基化缺陷。为此，我们通过脉冲相位分析分析了CPY，然后对野生型和每5-1细胞。如所示图3A、 脉冲迁移后，proCPY恢复为多个物种，在每5-1细胞与野生型细胞P1种的比较(图3A、 比较车道1和4）。糖链的去除表明，异质性完全是由于糖基化的差异造成的，因为脱糖基化形式结合在一起(图3A、 车道7–12）。这两个菌株处理成成熟形式的动力学相似，表明折叠和运输功能在每5-1细胞。Gas1p也获得了类似的结果(图3B） ，这表明该缺陷不是特定于基底。

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图3

A中，每5-1在N-连接的糖基化方面存在缺陷。野生型（W303a）和每5-1对细胞进行代谢脉冲标记5分钟，并追踪0、15和30分钟。从洗涤剂裂解物中免疫沉淀CPY，并在每个时间点分为两份。一份用内糖苷酶H处理，另一份用模拟处理。蛋白质在10%聚丙烯酰胺凝胶上分离，并通过荧光成像进行可视化。CPY的不同前体和成熟糖类的位置如所述图2Endo H脱糖基脯氨酸（dg-proCPY）和成熟型（dg-mCPY）显示在右侧。B、，每5-1是的等位基因射频T1.通配符类型，每5-1、和每5-1（pDN387）细胞脉冲标记5分钟，追踪0和30分钟射频T1基因。Gas1p的免疫沉淀物通过10–15%聚丙烯酰胺梯度凝胶溶解，并通过放射自显影术进行可视化。正常ER和成熟（高尔基体/PM）形态如图所示。

描述性能5此外，我们通过互补克隆了该基因（参见材料和方法）。从转化的质粒中分离出互补质粒pDN386每5-1细胞和插入物的部分进一步亚克隆以鉴定互补基因。质粒pDN387，含有射频T1作为唯一的开放阅读框架每5-1因为它恢复了扇区表型和糖基化功能(图3B） ●●●●。射频T1是一个编码未知功能的预测多跨膜蛋白的关键基因(Koerte等人，1995年). 因此，我们的方法确定了PER5/RFT1作为N-连接糖基化所需的新基因。

上游序列检查每5个/RFT1揭示了潜在的UPRE，表明第5页受UPR监管(图4A） ●●●●。为了直接解决这种可能性，Northern分析使用了从对照细胞和经糖基化抑制剂衣霉素处理的细胞中提取的RNA来诱导UPR调节基因。如所示图4B、，PER5/RFT1被膜霉素处理的细胞（1-4道）中升高。定量分析显示诱导倍数为2.5倍。这与KAR2型，诱导8倍以上(图4B） ●●●●。转录调控PER5/RFT1，与KAR2型，取决于UPR，因为在Δ中未检测到诱导氯化氢单元格(图4B、 车道5和6）。

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图4

PER5/RFT1是一个UPR靶基因。A、 UPRE序列的对齐。实验确定的UPRE序列(Mori等人，1998年)显示为上游序列PER5/RFT1这符合箭头所示的回文主题。点表示图案中的其他重要位置。B、 使用从W303a、DNY421和Δ中提取的RNA进行Northern分析氯化氢细胞在有或无2.5μg/ml衣霉素的条件下在30°C下培养60分钟。PER5/RFT1,KAR2型、和行动1转录本被印在尼龙滤纸上，杂交到³²P标记探针，并通过放射自显影术进行可视化。通过荧光成像仪分析进行定量。

综上所述图2 图3 图4显示16个基因中至少有5个突变每基因破坏了蛋白质糖基化的重要功能，而迄今为止未知功能的基因就是通过这种方式被鉴定出来的。此外，这些结果强化了普遍定期审议的功能是调节蛋白质生物发生的各个方面的观点。

普遍定期审议在ERAD中的作用

许多每突变体在Gas1p或CPY成熟中没有缺陷，我们想知道与蛋白质成熟相关的ER功能的其他方面是否在一些每突变体。为了测试编码ERAD成分的基因是否在该筛选中被识别，我们构建了ERAD底物的重组形式CPY*(Finger等人，1993年)，通过添加HA表位标签进行修改以简化分析。新版本，命名为CPY*_哈作为一种合适的ERAD底物：在野生型细胞中迅速降解，在缺乏ERAD基因的菌株中稳定，CUE1号机组(图5;Biederer等人，1997年). 我们改造了每个每携带编码CPY基因的pDN436突变体*_哈使用脉冲相分析评估每个菌株中的底物稳定性。CPY营业额*_哈延迟了每7-1,每8-1,每9-1,每13-1、和每16-1(图5). 两个变种人，每9-1和每13-1，还显示了Gas1p处理中的缺陷，表明其缺陷具有多样性。因此，他们的ERAD表型可能是间接的。在所有其他方面每菌株，包括那些蛋白质加工能力严重受损的菌株，CPY的比率*_哈降解没有改变（数据未显示）。

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图5

的子集每突变体对ERAD有缺陷。全部20个每用pDN436（CPY）转化突变体*_哈)和脉冲相位分析，以测量ERAD基板CPY的降解*_哈.CPY的免疫沉淀物*_哈使用TCA可沉淀计数进行归一化。用PAGE分离蛋白质，然后放射自显影。通过磷光成像仪分析进行定量，并将其报告为每个自动放射自显影图右侧的剩余百分比。除了野生型（DNY563）和ERAD突变体（DNY572，提示1:：TRP1)控件，仅限每显示了具有显著ERAD缺陷的突变体。

接下来我们克隆了一些受影响的基因每显示ERAD缺陷的变种，从第8页和性能16其显示的缺陷程度与Δ相似线索1应变。质粒pDN426轴承索尼1，完全补充了每8-1突变体。此外，CPY*_哈稳定在Δ儿子1单元格（未显示数据），表明缺陷每8-1细胞反映功能丧失。Son1p最近被证明是一种调节蛋白酶体生物发生的转录因子(Mannhaupt等人，1999年)和Δ儿子1突变体在细胞溶质蛋白降解方面有缺陷(约翰逊等人，1995年). 因此，Son1p在ERAD中的角色相当合理。

我们克隆了性能16通过筛选重组质粒后的扇区表型恢复URA3公司-标记为的记者LEU2级（pDN388）和库的转换。质粒插入物的亚克隆恢复了每16-1已识别的单元格UBC7公司，这足以补充每16-1突变。UBC7公司编码一种泛素结合酶，该酶以前被证明参与ERAD(Biederer等人，1996年;Hiller等人，1996年).

该筛选中ERAD突变体的分离表明UPR和ERAD之间存在紧密的生理联系。我们通过监测CPY的命运进一步探讨了这一概念*_哈在缺乏UPR的菌株中。如所示图6A、 CPY公司*_哈稳定在Δ红外线1单元格(图6A、 而野生型对照细胞迅速降解底物。令人惊讶的是，我们还观察到Δ中出现了更快的迁移带爱尔兰1用野生型细胞进行的对照实验中未检测到的细胞(图6A、 标记为preproCPY*_哈). 其在脉冲期间的流动性和出现时间表明，该带代表细胞质、非转移的前CPY*_哈为了确认这一身份，我们表达了CPY*_哈在里面第62-101节细胞中CPY的易位受到严重损害，从而积累胞浆前体蛋白。中的数据图6B显示预处理CPY波段合并（比较通道2和3）。

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图6

UPR是ER蛋白高效易位和ERAD.A、野生型和ire1:：TRP1电池（标记为Δ爱尔兰1)表达CPY*_哈脉冲标记10分钟[³⁵S] 蛋氨酸/半胱氨酸，追逐0、30、60和90分钟CPY*_哈用抗HA单克隆抗体进行免疫沉淀，并用SDS-PAGE进行分析。蛋白质通过直接放射自显影进行可视化，并使用磷光成像仪对凝胶进行定量。B、 野生型，第62-101节和Δ爱尔兰1表达CPY的细胞*_哈脉冲标记10分钟和CPY*_哈免疫沉淀并在10%聚丙烯酰胺凝胶上分离（1、2和3道）。车道4和5，从车道1和3使用的裂解液中免疫沉淀Gas1p。C、 野生型，第62-101节和Δ爱尔兰1表达CPY的细胞_哈脉冲标记10分钟，免疫沉淀内源性CPY。预备CPY的位置_哈显示了ER P1和高尔基体P2形式。

这些结果提出了一个问题，即易位受损是由错误折叠的蛋白质合成引起的，还是由CPY异位表达导致的蛋白质通过内质网易位的流量增加引起的*_哈为了区分这些可能性，我们构建了野生型和Δ爱尔兰1表达表位标记的野生型CPY（CPY_哈)使用与CPY相同的向量*_哈.CPY的表达_哈导致Δ中没有易位缺陷爱尔兰1单元格(图6C） 表明该缺陷是由ERAD通路底物错误折叠蛋白的表达引起的。

单位Δ爱尔兰1表达CPY的细胞*_哈，我们还观察到内源性蛋白Gas1p的易位缺陷(图6B、 通道4和5），这表明错误折叠的蛋白质会导致这些细胞中普遍的移位缺陷。相比之下，Δ爱尔兰1单个单元格或Δ爱尔兰1表达CPY的细胞_哈Gas1p ER进口无缺陷（数据未显示）。由于进入内质网和从内质网输出的蛋白质被认为共享同一易位孔，因此这两个过程可能直接竞争由UPR调节的一些限制性成分。

定量分析中的数据图6A在Δ中显示了ER蛋白降解的延迟爱尔兰1细胞。在野生型细胞中，47、13和3%的CPY*_哈分别在追逐30、60和90分钟后保持。相比之下，Δ爱尔兰1细胞，占CPY的46、37和22%*_哈保持在相应的时间点。这种延迟可能是由两种可能是相加的影响造成的：一种是进口到ER的损害，另一种是从ER再出口到降解的延迟。尽管这两个过程对总延迟的相对贡献尚待确定，但如果进口阻塞得到缓解，ERAD功能仍将中断（见下文）。

总之，数据表明，在应激期间，由于进出口底物竞争限制性核心易位机制，UPR在平衡蛋白质进出内质网的运输方面发挥了作用。CPY的积累*_哈将诱导UPR增加易位机制，以清除错误折叠的蛋白质的内质网，同时保持蛋白质进入内质网。为了支持这一假设，编码易位机制中对输入和输出都起作用的成分的基因是UPR的靶点(Travers等人，2000年). 此外，CPY*和CPY*_哈每种表达都会导致UPR诱导，尽管根据UPRE拉茨记者(Knop等人，1996年; Spear，E.D.和D.T.W.Ng，未发表的结果）。

为了验证这一假设，我们通过增加正常UPR激活期间的表达来评估两个特定UPR靶基因的贡献。为此，我们分别测试了含有编码Kar2p或Sec61p的重复基因的菌株。选择这些基因是因为它们在ER蛋白导入和ERAD中的双重作用(Pilon等人，1997年;Plemper等人，1997年;Zhou和Schekman 1999). 此外，这两个基因在激活UPR的条件下都是可诱导的(Travers等人，2000年). 如所示图7A、 增加Kar2p或Sec61p的基因剂量足以缓解前CPY的易位缺陷*_哈和preGas1p（Δ）爱尔兰1细胞。Δ爱尔兰1Kar2p表达增加的细胞也减轻了CPY的延迟*_哈退化，退化(图7B和图C). 相反，Δ爱尔兰1包含附加副本的单元格第61节CPY降级时仍有缺陷*_哈。的附加副本第61节自身对ERAD没有抑制作用，因为在相同条件下，如果稍微加速ERAD功能，野生型细胞显示正常（Spear，E.D.和D.T.W.Ng，未发表的结果）。这些结果表明，当细胞受到CPY攻击时，Kar2p对易位和ERAD都具有限制性*_哈而Sec61p仅限制易位，而不限制ERAD。此外，增加Kar2p或Sec61p的表达可以补偿Δ中的易位缺陷爱尔兰1细胞。综上所述，这些数据表明UPR在调节内质网膜的进出口功能方面发挥着重要作用。

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图7

特异性UPR靶基因剂量的增加减轻了UPR缺陷细胞的易位和ERAD缺陷。A、 野生型和Δ爱尔兰1表达CPY的细胞*_哈脉冲标记为[³⁵S] 甲硫氨酸/半胱氨酸，然后进行CPY的免疫沉淀*_哈（顶部）和Gas1p（底部）。单倍体菌株DNY563（野生型）、ESY157（Δ红外线1)，ESY158（ESY157，带有KAR2型着丝粒质粒pMR713；标记Δ爱尔兰1，2个KAR2型)，和ESY159（ESY157以及额外副本第61节着丝粒质粒pCS15；标记Δ爱尔兰1，2个第61节)进行了分析。显示了腔型和非移位型（pre）。B、 DNY563（野生型），ESY158（Δ爱尔兰1，2个KAR2型)和ESY159（Δ爱尔兰1，2个第61节)细胞被脉冲标记[³⁵S] 蛋氨酸/半胱氨酸维持10分钟，然后按指定时间进行冷追逐，CPY*_哈从洗涤剂裂解物中免疫沉淀，并通过SDS-PAGE分离。C、 免疫沉淀CPY的定量*_哈通过磷成像仪分析显示在B中。

蛋白质糖基化的调控

隔离每5-1突变体导致发现了一个与蛋白质糖基化有关的新基因。我们发现了性能5受普遍定期审议上调。每5个/RFT1最初是从需要过表达人类p53才能生存的酵母突变中克隆的(Koerte等人，1995年); 由于没有与哺乳动物p53相当的酵母，这种表型的原因和PER5/RFT1一直模糊不清。我们的研究表明PER5/RFT1是糖蛋白高效N-连接糖基化所必需的。PER5/RFT1编码一种多跨膜蛋白，与糖基化机制的任何其他已知成分没有显著序列相似性。我们的结果表明PER5/RFT1在多利考酚键碳水化合物前体的生物合成或蛋白质结合步骤中的功能。初步实验表明每5-1细胞显示生物合成中间体（Dol-PP-GlcNAc）的积累₂-男人₅)成熟型（Dol-PP-GlcNAc）急剧减少₂-男人₉-Glc公司_三; J.Helenius、D.T.W.Ng、P.Walter和M.Aebi，未发表的结果）。这些结果表明，有趣的可能性是PER5/RFT1可能编码转位Dol-PP-GlcNAc的长远期翻转酶₂-男人₅中间产物（在膜的细胞溶质表面合成）到腔表面以进行进一步处理(Burda和Aebi 1999). 与此观点一致的是，那些附着在蛋白质上的碳水化合物每5-1细胞已完全成熟。解决这一概念的进一步实验正在进行中。

基因组表达数据表明，糖基化生物合成机制的其他成分受UPR调节(Travers等人，2000年). 糖基化组分的调节有助于巩固我们对UPR的广泛看法，因为它表明了该途径在根据需要调节细胞内质网生物合成能力中的作用。同样，我们将每GPI锚定缺陷突变体和许多GPI生物合成基因是UPR靶点(Travers等人，2000年).

ER质量控制的UPR规定

ERAD基因的鉴定表明ERAD与UPR之间存在紧密的生理联系。我们使用CPY为这种联系提供了直接证据*_哈，其在UPR缺陷细胞中稳定。与以往研究一致(Kawahara等人1997;Zhou和Schekman 1999)，我们表明各种ERAD缺陷突变体构成性地诱导UPR。如平行研究所示，大多数已知的ERAD基因都被UPR激活(Travers等人，2000年). 此外，在本研究中，我们发现UPR诱导提高了ERAD效率。因此，普遍定期审议和消除种族歧视是密切协调和相互依存的。

识别索尼1(性能8)作为ERAD所需的一种基因，它给我们的基因筛查结果带来了意想不到的变化。索尼1（也称为RPN4号机组)最近被证明是一种转录激活物，结合一种共识启动子元件，称为PACE(Mannhaupt等人，1999年). PACE基序存在于许多基因中，但它是编码26S蛋白酶体亚单位的基因家族中的一个常见元素。在儿子1空突变体，泛素结合后的一个步骤损害了一些细胞溶质蛋白的降解(约翰逊等人，1995年). 这些数据表明索尼1调节蛋白酶体生物发生的各个方面，这反过来又是ERAD所必需的。然而令人惊讶的是，两者都不是索尼1nor蛋白酶体亚基基因受UPR调节(Travers等人，2000年). 相反，经衣霉素或DTT治疗后，UPR缺陷细胞中的蛋白酶体亚单位基因协调上调(Travers等人，2000年). 这些结果表明，除UPR外，还存在一种不依赖于UPR的ER→细胞核信号转导途径，Son1p可能在其中发挥重要作用。有趣的是，UPR靶基因PDI1型和PER5/RFT1包含一致的PACE促进者元素(Mannhaupt等人，1999年)因此，除Hac1p外，还可能由Son1p监管。

我们感谢克里斯·帕蒂尔（Chris Patil）和杰夫·布罗德斯基（Jeff Brodsky）对手稿的讨论和评论。我们感谢里德·吉尔摩（Reid Gilmore）、埃琳·奥谢（Erin O'Shea）、马克·罗斯（Mark Rose）、霍华德·里兹曼（Howard Riezman）和兰迪·斯科曼（Randy Schekman）提供的抗体、菌株和质粒。

这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）对P.Walter和D.T.W.Ng.P.Walter的资助。Walter是霍华德·休斯医学研究所（Howard Hughes Medical Institute）的研究员。