人类细胞周期蛋白a的后期促进复合物/环体依赖性蛋白水解从有丝分裂开始，不受纺锤组装检查点的影响

质粒

通过PCR从pKS-myc-Cyclin A（英国剑桥大学J.Pines赠送的礼物）中扩增细胞周期蛋白A，以去除9E10表位并引入独特的NH₂-和COOH终端限制站点。分别从质粒1213和1213dm（以色列耶路撒冷希伯莱大学M.Brandeis的礼物）中扩增出小鼠细胞周期蛋白B1及其D-box突变体，并从HeLa细胞cDNA中扩增出人类Mad2。将所有cDNA片段亚克隆到哺乳动物表达载体pEFT7MCS中(Pepperkok等人，1999年). 点突变是通过寡核苷酸引导的噬菌体R408单链DNA的第二链合成或基于标准PCR的方案产生的(Ausubel等人，1999年)并通过限制性消化或测序进行验证。全日空航空公司₂-或COOH末端缺失由PCR产生。细胞周期蛋白A-GFP融合是通过将GFP或氰荧光蛋白（CFP）（由加利福尼亚大学圣地亚哥分校La Jolla分校R.Tsien提供）编码cDNA片段亚克隆到细胞周期蛋白A的COOH末端而构建的(Pepperkok等人，1999年). GFP从甲醇固定细胞中泄漏出来，因此我们生成GFPNeo作为转染标记物。利用含有重叠序列的引物，分别从质粒pEFTT7-GFP和pCDNA3.1（Invitrogen）中扩增GFP和新霉素磷酸转移酶，构建GFPNeo，并将其亚克隆到pEFT7MCS中。我们构建了双顺反子表达载体pTSIGN，其中GFPNeo从pEFT7MCS中的脑心肌炎病毒（EMCV）内部核糖体进入位点（IRES）表达。Mad2 cDNA在EMCV-IRES上游克隆，并在EF1α启动子的控制下表达。DnBub1是通过放大NH生成的₂-来自小鼠Bub1编码区的末端334残基（由英国曼彻斯特生物科学学院S.Taylor提供）并将其亚克隆到pEFT7MCS中。通过亚克隆tet-KRAB编码序列，构建了四环素可抑制转录阻遏物tet-KRAM的表达载体(Deuschle等人，1995年)到表达载体pEFblas中（加利福尼亚州拉霍亚市索尔克研究所G.Wahl赠送的礼物）。hsMad1的表达载体是T.Jeang（马里兰州贝塞斯达国家过敏和传染病研究所）捐赠的(Jin等人，1998年).

抗体

针对牛细胞周期蛋白a片段制备多克隆抗体（JG39）和单克隆抗体（E23）。对于间接免疫荧光，JG39以1:100的稀释度使用。使用10μg/ml的抗环素B1抗体（V152）进行免疫染色，5μg/ml进行免疫印迹。E23以2μg/ml的浓度用于免疫印迹。抗Cdc27和抗Cdc20抗体已被描述(Kramer等人，1998年;Gieffers等人，1999年)并以1mg/ml的浓度用于微量注射实验。

微注射和时间扫描显微术

HeLa和HTB^过氧化氢细胞生长在玻璃底的3厘米培养皿中（MaTek Corp.），并使用安装在蔡司Axiovert 35显微镜上的半自动Eppendorf微量注射系统进行微量注射。对于显微注射实验，蛋白质在无菌过滤的PBS中稀释至1 mg/ml，质粒DNA在无菌过滤水中稀释至25–100 ng/ml。荧光右旋糖酐(M（M） _第页>以0.5 mg/ml的最终浓度使用2 MD）（Sigma-Aldrich）。所有样品在4°C、14000 rpm下离心20分钟，然后将2μl装入P-97微量移液器（Sutter Instrument Co.）拉动的硼硅酸盐毛细管中。为了进行活细胞观察，细胞在无酚红培养基中培养，并放置在小型工作室制作的微型培养室中，该培养室安装在蔡司Axiover 135TV或尼康倒置显微镜的台上。将显微镜加热至37°C并配备CO₂供应。相位和荧光遮板由Lambda 10-2（Sutter Instrument Co.）或Ludl过滤轮控制。蔡司显微镜的底部端口装有MicroMax 1300（Roper Scientific），而尼康显微镜的侧面端口装有Orca I（哈马松）相机。冷却后的CCD相机由IPLab Spectrum P（Scanalytics）、Openlab（Improvision）或AQM2000（Dynamic Imaging）软件包驱动。对于双色GFP成像，我们使用了商用滤波器组XF135（Omega Optical，Inc.）。为了尽量减少光对细胞的损伤，在光路中放置了中性密度滤光片。时间序列是通过每隔5-6分钟拍摄一次图像生成的，然后将这些图像转换为8位图像，组合成QuickTime™电影，并使用NIH Image 1.62进行量化。

免疫荧光

在玻璃盖玻片上生长的细胞在PBS中洗涤，并在−20°C下用甲醇固定4分钟，或在室温下用3.7%多聚甲醛固定20分钟，并用0.1%Triton X-100透化2分钟。在室温下用一级抗体（在PBS/1%FCS/0.2%吐温20中稀释）孵育20分钟后，用PBS洗涤细胞两次，并用次级FITC-（Dako）、Alexa 488-（分子探针）、Cy3-（Sigma-Aldrich）或Alexa 546结合次级抗体培养细胞。对于直接免疫荧光，亲和纯化的抗细胞周期蛋白A多克隆兔血清JG39与Cy3（Amersham Pharmacia Biotech）偶联。为了进行DNA染色，用Hoechst 33342（Sigma-Aldrich）以1μg/ml的浓度孵育活细胞或固定细胞10分钟，然后在PBS中清洗。用Mowiol 4-88（Calbiochem）安装细胞，并在蔡司Axioskop显微镜上使用标准FITC、罗丹明和DAPI过滤器组进行分析。照片是使用Orca I相机（滨松）和Openlab图像软件（即兴）拍摄的。

代谢标记、免疫沉淀和免疫印迹

对数生长的HeLa细胞（10⁵/ml）在缺乏蛋氨酸和半胱氨酸的培养基中洗涤两次，并在该培养基中培养30分钟，补充10%的透析FCS。标记新合成的蛋白质，100μCi[³⁵S] 蛋氨酸和[³⁵S] 添加半胱氨酸（Promix；Amersham Pharmacia Biotech）4 h。用PBS洗涤细胞三次，然后在含有2 mM冷蛋氨酸和半胱氨酸的完整培养基中培养。为了进行免疫沉淀，将培养皿放在冰上，用冰镇PBS冲洗，然后将细胞刮入Eppendorf试管中，在1000℃下造粒克冷冻2分钟。提取物通过NP-40裂解制备，如下所述。预分离后，将2μl兔多克隆抗血清JG39添加到1 mg蛋白质中，在4°C下培养2 h，并在14000 rpm下离心，然后添加10μl Affi-Prep蛋白A珠（Bio-Rad Laboratories）。在4°C下孵育1 h后，将珠粒造粒并在裂解缓冲液中洗涤三次，转移到新试管中，并在含有500 mM NaCl的裂解缓冲液内洗涤。最后将颗粒重新悬浮在20μl SDS样品缓冲液中，并使用荧光成像仪（分子动力学）通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。

为了进行免疫印迹，在NP-40裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，250 mM NaCl，20 mM EGTA，50 mM NaF，100μM Na）中的冰上培养细胞颗粒30分钟_三沃₄和0.1%NP-40），并在10000转克持续10分钟。用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析可溶性提取物（10-20μg蛋白质），转移到硝化纤维素膜上，并用标准免疫印迹程序进行处理(Ausubel等人，1999年). ECL（Amersham Pharmacia Biotech）对这些条带进行了可视化。

破坏和泛素化分析

通过在核糖核酸酶处理的兔网织红细胞裂解物和青蛙卵提取物的50:50（vol/vol）混合物中翻译1μg体外T7 RNA聚合酶转录和capped mRNA，制备体外降解试验的底物(Murray 1991年)含5μCi[³⁵S] 蛋氨酸和[³⁵S] 半胱氨酸（Promix；Amersham Pharmacia Biotech）在23°C下保温90分钟。对于降解分析，将1μl底物添加到14μl鸡蛋提取物中，通过添加0.4 mM CaCl激活₂，并在23°C下培养。将1-μl小份样品稀释在20μl SDS样品缓冲液中，并通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。

使用Promega TnT试剂盒和[³⁵S] Promix（前缀）。从杆状病毒感染的昆虫细胞中纯化重组人Cdh1或Cdc20，并添加到从间期纯化的APC/C免疫中爪蟾鸡蛋提取物。泛素化反应如所述进行Kramer等人，2000年.

细胞周期蛋白A-GFP的破坏开始于前中期，并在中期完成

为了实时跟踪细胞周期蛋白A的破坏动力学，在其COOH末端用GFP标记细胞周期蛋白A，并将表达质粒注射到G2同步化HeLa细胞中（见材料和方法）。图2表明细胞周期蛋白A-GFP集中在细胞核中（并在体外与Cdk2形成活性蛋白激酶[数据未显示]），因此其行为可能与野生型细胞周期蛋白A类似。注射细胞在微量注射表达质粒后约2小时开始积聚核荧光，并与相邻未注射细胞在同一时间进入有丝分裂。核膜破裂（NEBD）后，细胞周期蛋白A-GFP的荧光信号在整个细胞内开始均匀下降。细胞周期蛋白A-GFP信号在中期细胞中显著减少(图2A、 顶部）。

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图2

细胞周期蛋白-GFP在活细胞中的降解。（A） 将细胞周期蛋白A-GFP（顶部）和细胞周期蛋白B2-YFP（底部）的表达载体注入G2期HeLa细胞，然后进行延时视频显微镜观察。该图显示了细胞周期蛋白A-GFP、细胞周期蛋白B2-YFP和GFPNeo表达细胞从前期到胞质分裂的量化数据。（B） 细胞周期蛋白的双色GFP标记。细胞周期蛋白A-CFP与细胞周期蛋白B1-YFP共表达，并通过序列图像采集进行分析。（C） 细胞周期蛋白A（红色）和细胞周期蛋白B1（绿色）破坏。将细胞周期蛋白A-CFP和细胞周期蛋白B1-YFP注入G2期HeLa细胞，并用延时荧光显微镜进行分析。图像被伪彩色并合并。图中显示了其中一个细胞进行有丝分裂的时间进程和量化数据（箭头）。棒材，20μm。

为了进行比较，使用小鼠细胞周期蛋白B2-YFP进行了类似的研究。细胞周期蛋白B2-YFP位于间期细胞的细胞质中，在NEBD前约10分钟易位到细胞核。细胞周期蛋白B2-YFP在定位于有丝分裂纺锤体的前中期持续轻微升高，直到中期保持稳定，后期迅速下降(图2A、 底部）。

细胞周期蛋白A-GFP的表达常常延迟后期的开始（我们在下面回到这一点；参见图9)在中所示的单元格中图2A、 发生时间比表达细胞周期蛋白B2-YFP的细胞晚≥20分钟。因此，只有在有丝分裂持续时间没有明显改变的细胞之间，才可能比较细胞周期蛋白A和B的降解率。图2A比较了从NEBD到胞质分裂有丝分裂长度相似的两个不同细胞中GFP标记的细胞周期蛋白A和B的丢失动力学（图中显示了四分之一量化细胞的荧光值）。细胞周期蛋白A的破坏先于细胞周期蛋白B的破坏30–40分钟。为了能够在同一细胞中进行同步测量，将细胞周期蛋白A与CFP融合，将小鼠细胞周期蛋白B1与YFP融合，并将质粒注入G2同步化HeLa细胞（见材料和方法）。图2B表明CFP和YFP信号分离良好，并且图2C表明，细胞周期蛋白A在NEBD后不久开始降解，在细胞周期蛋白B1开始不稳定的中期达到低水平。中的图形图2C显示了三分之一量化细胞的YFP和CFP水平，并表明细胞周期蛋白A的降解先于细胞周期蛋白B1的降解约30分钟。这些观察结果与den Elzen和Pines在本期（2001）中的观察结果一致。

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图9

后期发作的时间。后期开始需要细胞周期蛋白A降解。将细胞周期蛋白A、AΔ47-83、A-F304S或A-MLAIL的表达质粒与TRITC标记的右旋糖酐一起注入H2B-GFP表达细胞，并通过延时视频显微镜进行监测。水平线表示单个细胞从中期前到后期开始有丝分裂所花费的时间。每行代表单个细胞：<，后期开始；0，后期逮捕；//<，延迟≤90分钟直到后期发作；//，延迟≤200分钟或记录时间结束。填充的方块表示细胞死亡。

周期蛋白A的破坏取决于APC/C，但对主轴组件检查点不敏感

为了测试APC/C是否是细胞周期蛋白A降解所必需的，我们向G2同步化HeLa细胞注射亲和纯化的抗Cdc27抗体，这些抗体在中期抑制了高比例的细胞周期蛋白(图3A） ●●●●。在注射了抗Cdc27抗体的68个细胞中，有55个细胞在有丝分裂中停滞。注射后14小时分析时，没有一个对照IgG注射细胞出现停滞。为了确定抗Cdc27抗体对细胞周期素水平的影响，用甲醇固定细胞，并对细胞周期蛋白A和B1进行染色。细胞周期蛋白A在大多数细胞（88个注射和滞留细胞中有69个）中呈高水平存在，表明它是APC/C的靶点(图3B） ●●●●。接下来，将抗人Cdc20或Cdh1的抗体注射到同步化HeLa细胞的细胞核中，14小时后对细胞进行周期蛋白A和B1染色。注射抗Cdc20抗体也会导致细胞在中期积聚，但其效率低于抗Cdc27抗体，这可能表明这种阻滞是暂时的。然而，细胞周期蛋白A（27个注射细胞中的19个）和B1（16个注射细胞里的16个）都很容易检测到(图3C） 在抗Cdc20中期阻滞细胞中。抗Cdh1抗血清对有丝分裂或细胞周期蛋白降解无明显影响（数据未显示）。当细胞周期蛋白A-GFP表达质粒（25纳克/μl）与抗Cdc27或抗Cdc20抗血清共注射时，GFP信号在中期停滞细胞中保持高水平（数据未显示）。

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图3

细胞周期蛋白A是APC/C底物。（A和B）HeLa细胞注射抗Cdc27抗体，并在14小时后用Hoechst 33342染色。B组显示细胞周期蛋白A、B1和Hoechst 33342染色。注射的细胞（箭头）被高水平的细胞周期蛋白A阻滞在中期。（C）用FITC-标记的右旋糖酐注射抗Cdc20抗体。14小时后对细胞进行细胞周期蛋白A分析。星号表示未注射的中期细胞缺乏细胞周期蛋白a。箭头表示注射了少量抗体且含有少量细胞周期蛋白a的细胞；完整的箭头表示高水平cyclin A（D）泛素化检测的细胞被阻滞。³⁵将S标记的细胞周期蛋白A添加到包含由Cdc20或Cdh1激活的免疫纯化APC/C的泛素化反应中，如图所示。在指定时间通过SDS-PAGE和放射自显影术分析样品。棒材，20μm。

这些结果表明，细胞周期蛋白A是人类细胞中Cdc20-相关APC/C的靶点。为了更直接地测试APC/C是否能够识别细胞周期蛋白A作为底物，我们建立了细胞周期蛋白A的体外泛素化反应，其中免疫纯化的APC/C被激活非洲爪蟾将鸡蛋提取物添加到放射性标记的细胞周期蛋白A中（参见材料和方法）。添加重组Cdc20或Cdh1可促进细胞周期蛋白A快速高效转化为高分子量泛素结合物(图3D） ，证实细胞周期蛋白A是Cdc20激活的APC/C的靶点。

APC/C的活性由纺锤体组装检查点控制，微管毒素对有丝分裂纺锤体的破坏导致APC/C泛素化securin和细胞周期蛋白B的能力的Mad2依赖性失活。图4A表明，暴露于诺克唑或紫杉醇的细胞中，细胞周期蛋白B1水平保持不变，但细胞周期蛋白A水平下降。紫杉醇或诺克唑处理的细胞中cyclin A的低水平是由于蛋白水解降解，因为添加蛋白酶体抑制剂MG132导致细胞周期蛋白A在滞留细胞中积聚（27个细胞中有25个呈阳性，而添加MG132之前34个细胞中只有2个呈阳性）(图4一个底部；数据未显示）。即使当cyclin A-GFP从强异源启动子过度表达时，它也不会在诺克唑阻滞的细胞中积累，而cyclin B1-YFP会积累（数据未显示）。

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图4

细胞周期蛋白A在诺克唑和紫杉醇处理的细胞中不稳定。（A） HeLa细胞暴露于抑制剂。用诺卡唑（Noc）处理G2期HeLa细胞14小时或紫杉醇处理4小时，直到细胞在有丝分裂中积累。将MG132（100μM）添加到紫杉醇处理的细胞中，并再培养2 h，然后对细胞进行DNA和细胞周期蛋白B1以及转染Mad1和2的A（B）HeLa细胞的染色。将人Mad1表达载体和表达Mad2和GFPNeo的双顺反子表达载体（pTSIGN-Mad2）注入G2-HeLa细胞，14小时后对其进行DNA或细胞周期蛋白a染色。中期抑制的GFP阳性细胞用箭头表示。棒材，20μm。

接下来，我们询问纺锤体组装检查点效应蛋白的过度表达是否会稳定细胞周期蛋白A，这些蛋白被认为通过抑制Cdc20-APC/C发挥作用。hsMad1和hsMad2的表达质粒在G2期微注射到同步化HeLa细胞中，并通过延时视频显微镜进行拍摄。观察到中期阻滞≥6小时，但此后细胞容易死亡。在所有被阻滞的细胞中都检测到细胞周期蛋白B1（数据未显示），而在21个阻滞细胞中只有3个细胞检测到显著水平的细胞周期蛋白A，并且大多数中期阻滞细胞的水平很低(图4B） ●●●●。这表明，Mad1和Mad2过度表达引起的有丝分裂阻滞或微管毒素激活纺锤体组装检查点抑制了细胞周期蛋白B1的降解，但不会延迟细胞周期蛋白A的蛋白水解。

细胞周期蛋白B1相对于细胞周期蛋白A降解的延迟取决于有丝分裂检查点

在动物细胞中，纺锤组件检查点在前中期被激活(Chen等人，1996)在所有染色体在有丝分裂纺锤体上建立双极取向之前保持活性(Rieder等人，1994年,Rieder等人，1997年). 观察到细胞周期蛋白A在前中期不稳定，并且是APC/C的靶点，这表明APC/C在前中期是活跃的。为了测试纺锤体组装检查点是否负责延迟细胞周期蛋白B1降解，我们表达了小鼠检查点激酶Bub1和细胞周期蛋白B1-YFP的显性阴性版本。图5结果表明，dnBub1导致细胞周期蛋白B1-YFP早熟消失，该蛋白在NEBD后不久即被降解。因此，细胞周期蛋白B1降解与细胞周期蛋白A降解的差异似乎取决于纺锤体组装检查点，该检查点选择性地延迟细胞周期蛋白B的降解，并可能延迟securin的降解，直到染色体在有丝分裂纺锤体上正确排列。

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图5

显性负Bub1加速细胞周期蛋白B1-YFP的降解。NH的表达质粒₂-将小鼠Bub1和cyclin B1-YFP的末端结构域共注入G2期HeLa细胞并进行有丝分裂。（A） 细胞有丝分裂的一系列图像。（B） 有丝分裂期间B1-YFP信号的定量，四分之一的细胞受到监测。填充的方块表示对照细胞中的cyclin B1-YFP荧光；开口钻石表明存在dnBub1。棒材，20μm。

细胞周期蛋白A的D盒

为了了解APC/C是如何区分细胞周期蛋白A和B的，我们分析了细胞周期蛋白A的D盒。与B型细胞周期蛋白一样，细胞周期蛋白甲在其NH中也有一个序列₂由于蛤细胞周期蛋白a或爪蟾细胞周期蛋白A1强烈稳定蛋白质(Luca等人，1991年;Lorca等人，1992年;Stewart等人，1994年). 我们使用爪蟾鸡蛋提取物用于分析人类细胞周期蛋白A2的D盒。由于细胞抑制因子（CSF）的活性，这些提取物在中期被阻止，并且可以通过添加CaCl释放到后期₂（请参见Murray 1991年). 令人惊讶的是，尽管添加了氯化钙，但人类细胞周期蛋白A在大多数鸡蛋提取物中都不稳定₂加速其蛋白质分解(图6B） ●●●●。这表明，抑制细胞生长因子的提取物类似于诺卡唑抑制的细胞，因为APC/C活性的水平足以降解细胞周期蛋白a，尽管细胞周期蛋白B是稳定的。传统D-盒基序（Adb3，R47A/L50A/N57A）中的点突变，甚至是残基45-58的缺失，这些残基构成了整个规范D-盒(图6B） ，未能稳定鸡蛋提取物中的人类细胞周期蛋白A2。删除NH₂-末端60个残基不能稳定人细胞周期蛋白A，但前80个残基的缺失提供了稳定的蛋白质（数据未显示）。相反，小鼠细胞周期蛋白B1（RTALG到GTAVG，标记为B1dm）的D盒中出现双点突变图6)在相同条件下完全稳定(图6B） ●●●●。

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图6

Cyclin A2有一个新颖的D-box。（A） 细胞周期蛋白A缺失突变体。本研究分析了细胞周期蛋白A和突变体的示意图。（B） 销毁分析。将体外翻译和标记的细胞周期蛋白添加到青蛙卵提取物中，并在存在或不存在0.4 mM CaCl的情况下在23°C下培养₂通过SDS-PAGE和放射自显影对样品进行分析。（C） 泛素化分析。体外Cdc20-依赖泛素化。通过SDS干凝胶的荧光照相术对细胞周期蛋白A的高分子量形式进行量化。（D） D-box对齐。NH校准₂-围绕D盒的A型细胞周期蛋白的末端区域，其保守残基（R47、L50和N57）用填充圆圈标记。文中提到的删除突变体已指明。

删除残基47–83或45–72稳定的人类细胞周期蛋白A(图6B） 而Δ60-80仍不稳定（数据未显示）。因此，蛋白质水解所需的细胞周期蛋白A顺式元件从典型的D盒开始，并包含在残基60和72之间的额外基序。正如我们之前发现的爪蟾细胞周期蛋白A1，人细胞周期蛋白A2在体外的降解需要与Cdk结合，因为在结合Cdk伴侣方面有缺陷的突变体，例如，细胞周期蛋白盒突变体（R211L）或小COOH末端缺失（ΔC28），在青蛙提取物试验中是稳定的（数据未显示）。

当在添加底物前30分钟将亲和纯化的抗Cdc20抗体添加到提取物中时，细胞周期蛋白A和B1的降解被延迟，但没有被消除，这表明两者都依赖于Cdc20相关的APC/C(图6B） ●●●●。我们还在体外泛素化试验中测试了细胞周期蛋白A突变体（参见图3D） ●●●●。图6C显示野生型细胞周期蛋白A、突变体Δ45-58和NH₂-5分钟后，末端缺失突变体ANΔ60有效（>50%）转化为高分子量泛素化形式。相比之下，在青蛙后期提取物中稳定的R211L（MLAIL）和AΔ47-83缺失突变体泛素化程度很低。

图6D显示了来自多种物种的A型细胞周期蛋白的排列，并揭示了人类细胞周期蛋白A中的扩展D盒基序在人类、牛、小鼠和仓鼠的体细胞A型细胞因子中是保守的，但在爪蟾细胞周期蛋白A2或鸡细胞周期蛋白A(图6D） 。在所有胚胎或A1型细胞周期蛋白中也不存在，这表明细胞周期蛋白A1和A2的降解可能受到不同的调节。

使用GFP融合蛋白在活细胞中检查这些突变体的稳定性。细胞周期蛋白A的突变体只缺少经典的D盒（AΔ45-58–GFP），就像野生型细胞周期蛋白A-GFP一样，在有丝分裂过程中迅速降解，并且在诺可唑阻滞的细胞中没有积累（数据未显示），这表明经典D盒的缺失不能在体内稳定细胞周期蛋白A.相反，细胞周期蛋白AΔ47-83–GFP在有丝分裂中是稳定的（见下文），并在诺可唑阻滞的细胞中积累（数据未显示）。

细胞周期蛋白A降解与主轴组件检查点无关

即使从强异源启动子中表达细胞周期蛋白A，也无法在诺可唑阻滞的细胞中检测到。因此，当主轴组件检查点被强烈激活时，细胞周期蛋白A会退化。即使Mad2的过度表达抑制了中后期转换并稳定了细胞周期蛋白B1，也不能阻止细胞周期蛋白A的蛋白水解。相反，抑制有丝分裂检查点的显性阴性Bub1促进了细胞周期蛋白B1-YFP的降解，从而显示出类似于正常条件下细胞周期蛋白A的消失动力学（尽管由于技术困难，我们尚未检查表达dnBub1的细胞中细胞周期素A蛋白水解的动力学）。我们怀疑，即使在这些条件下，细胞周期蛋白A仍会比细胞周期蛋白B更早消失爪蟾有丝分裂检查点不起作用的卵提取物(Minshul等人，1990年,Minshull等人，1994年). 我们从这些实验中得出结论，APC/C在细胞进入有丝分裂时被激活，有丝分裂检查点选择性地延迟细胞周期蛋白B1的降解（也就是安全蛋白的降解），直到所有染色体在形成良好的有丝分裂纺锤体上正确排列。

目前，解释细胞周期蛋白A和其他APC/C底物的蛋白水解差异的最简单方法是，细胞周期蛋白A只是APC/C的更好底物，而不是securin和细胞周期蛋白B，因此，即使在纺锤组装检查点控制APC/C活性的情况下，细胞周期素A也可能发生蛋白水解。我们认为，高效传递到蛋白酶体需要一条长的多泛素链，而长链是由APC/C的长停留时间造成的。因此，解离常数较低的底物优先降解，甚至在APC/C的活性因检查点的操作而降低的条件下也可能降解。这一观点与野生型而非NH过度表达所产生的中期长延迟相一致₂-末端截短的细胞周期蛋白A。显然，securin和细胞周期蛋白B无法与细胞周期蛋白A/C竞争APC/C。验证这个假设需要进一步的工作，但它与D盒中的差异是一致的。更大的D盒可能会产生更多的接触，对功能性细胞周期蛋白A–Cdk复合物作为底物的额外需求表明，APC/C和细胞周期蛋白A之间存在额外的接触，这将促进更紧密的结合和更长的停留时间，从而允许更高程度地添加泛素部分。

我们感谢M.Brandeis、C.Norbury、J.Pines、S.Taylor、G.Wahl和T.Jeang的质粒和T.Lorca的抗-爪蟾Cdc20抗体。R.Pepperkok、D.Zicha、C.Gray和D.Aubyn为活细胞成像提供了极好的支持，Hunt实验室的成员对论文进行了出色的讨论和帮助。我们感谢乔纳森·派恩斯（Jonathan Pines）和尼科尔·登·埃尔岑（Nicole den Elzen）在整个工作过程中保持联系。

这项工作得到了奥地利科学促进基金向S.Geley提供的Erwin Schrödinger奖学金、研究人员培训和流动基金向T.Hunt提供的FMRX-CT98-0179、Boehringer Ingelheim以及奥地利工业研究促进基金和奥地利科学促进基金向J.-M.Peters提供的赠款的支持。