B类地下室膜是细胞外基质的一个子集，因其独特的组成和与选定细胞表面的密切联系而独特。层粘连蛋白和IV型胶原聚合物被认为是基底膜的关键结构元素，通常伴随着凝集素/巢蛋白、珍珠糖和其他糖蛋白(65). 层粘连蛋白是一类多功能大分子，被认为对这些特殊基质的发展和稳定性至关重要。所有层粘连蛋白都是由单个α、β和γ亚基组成的异源三聚体。层粘连蛋白通过在蛋白质的COOH末端半部分形成长螺旋相互作用而组装成三聚体，被指定为长臂，而NH2-终端地区保持独立，构成三个短武器。目前在体内至少11种不同的异源三聚体组合中发现了5条层粘连蛋白α链、3条β链和3条γ链(37). 根据组织或器官的不同，在胚胎发生的关键阶段以及成熟组织（如肌肉和皮肤）的正常功能似乎需要不同的层粘连蛋白亚基(36,46,50).
越来越清楚的是，不同的层粘连蛋白具有重叠和独特的功能。为了理解如此多层粘连蛋白需求的机制，重要的是确定这些不同的层粘连素如何局部改变基底膜的功能并对邻近细胞层产生影响。例如，研究表明，不同层粘连蛋白亚型形成聚合物的能力不同。层粘连蛋白亚型1-4能够通过三个NH之间的相互作用形成三维聚合物2-末端短臂，而层粘连蛋白5-7，具有一个或多个截短短臂，则不是(7,48). 一种独立的层粘连蛋白聚合物与IV型胶原网络结合，为邻近细胞提供结构和支持(7,64). 此外，层粘连蛋白通过多种细胞表面受体相互作用为这些细胞提供信号和线索，影响细胞生存、增殖和迁移等过程。然而，层粘连蛋白的结构作用（即其结构状态）与其许多细胞相互作用功能之间的关系和可能的相互作用尚未探索。
体外层粘连蛋白聚合是一个可逆过程，其中三个短臂相互作用形成基本聚合物键(7). 这种成核/传播组装过程发生在溶液中，其临界浓度为70–140 nm(66). 尽管层粘连蛋白和胶原都在溶液中形成聚合物，但层粘连蛋白聚合物是通过较弱的相互作用产生的，形成更具可塑性的聚合物，更适合组织重塑和机械化学信号等动态过程。在溶液中使用层粘连蛋白的研究有助于阐明层粘连蛋白聚合的结构域要求和动力学，但不能单独描述这一过程是如何在活体中发生的。例如，有人观察到，基底膜并不是在细胞之间的任何空白空间中形成的，而是与特定细胞类型或甚至细胞类型的特定区域（例如上皮细胞的基底外侧表面）紧密相连。事实上，基膜成分可能由一种细胞类型合成，但最终会在另一种更远端细胞类型的基膜中合成(26). 早期的一项研究发现，当层粘连到合成磷脂膜上时，层粘连蛋白在远低于溶液临界浓度的浓度下聚合(32). 这些结果暗示了一种机制，即层粘连蛋白与受体的相互作用会产生非常高的层粘连蛋白质局部表面浓度，从而使其高于其在质膜表面的临界浓度。支持受体相互作用在基底膜组装中的作用，一些细胞表面受体突变的小鼠被发现有各种基底膜缺陷(17,19,29,47,58). 尽管这些基底膜缺陷没有在层粘连蛋白聚合物形成水平上表现出来，而且这些受体（α3和β1整合素亚基和dystroglycan）都没有特异性结合层粘连蛋白质，但这些研究强烈表明，细胞可能利用受体促进和靶向层粘连素聚合。
最近，人们关注层粘连蛋白的作用及其在骨骼肌中的相互作用。许多严重的先天性肌营养不良症是由LAMA2基因突变引起的，以肌肉和神经系统的基底膜缺陷为特征(46). 在肌肉肌膜基底膜中，层粘连蛋白被认为是细胞外基质和肌营养不良糖蛋白-糖蛋白复合物之间的连接物。事实上，肌营养不良聚糖-糖蛋白复合物几乎任何成分的突变都可能导致某种形式的肌营养不良，从Duchenne（肌营养不良蛋白）到肢体束带型肌营养不良（肌多糖；参考文献14）。层粘连蛋白在骨骼肌中的另一个结合伴侣是α7β1整合素，尤其是在肌腱连接处。α7整合素亚基的突变也可引起骨骼肌病变，尽管这些症状似乎不太严重，被归类为肌病，而非营养不良(28,35). 有趣的是，一些LAMA2突变导致部分功能性层粘连蛋白分子的表达，维持其基底膜定位(1,42,49,55,59). 其中一种突变发生在第y天2J型小鼠，发现这些小鼠表达的层粘连蛋白-2在聚合能力方面存在缺陷，即使其仍局限于基底膜（Colognato，H.和P.D.Yurcenco，手稿正在编写中）。
虽然这些疾病已经确立了基底膜的重要作用，但层粘连蛋白需求背后的潜在机制仍不清楚。如果是第y天2J型在小鼠中，层粘连蛋白通过受体相互作用与细胞相连，通过与凝集素/巢蛋白的相互作用与基底膜相连。因此，层粘连蛋白似乎不仅需要为邻近组织提供锚定，还需要以某种方式改变这些组织，我们应该考虑到聚合可能在这一过程中发挥作用。为了解决这些问题，重要的是要了解层粘连蛋白的多种多样功能如何协同促进基质组装并向相邻细胞提供机械和化学信号。一个新兴的范例是，架构本身通过诸如矩阵刚性、细胞受体的空间排列以及矩阵和受体之间施加的张力等机制向细胞传递信息(8,18,20,33,51). 层粘连蛋白分子的结构特性和多重功能使其非常适合通过这些机制调节细胞相互作用。
在本研究中，我们使用肌肉细胞培养系统评估了层粘连蛋白作为单体或聚合物配体对表面受体和皮层细胞骨架成分的影响(60). 我们提供的证据表明，层粘连蛋白聚合通过特定的受体相互作用优先发生在细胞表面，为基底膜的组装提供了靶向机制。此外，我们还表明，在受体占据之上和之外，层粘连蛋白聚合需要诱导层粘连蛋白质、其受体和细胞骨架成分的重组。这种聚合物介导的重排可能代表了基底膜组装或重塑时使用的一般机制。事实上，这种结构的特定破坏可能是许多先天性肌营养不良症的分子基础。
材料和方法
细胞培养
DME中保存有C2C12成肌细胞（美国型培养物收集）(Gibco实验室)37°C培养箱中含有10%FBS和5%CO2将亚流入的成肌细胞胰蛋白酶化，转移到35×10mm组织培养皿中，汇合后切换到融合培养基（DME，5%马血清）。融合后3-5天对肌管进行分析。细胞松弛素D(西格玛化学公司。)在0.4μM和染料木素下使用(Calbiochem-Novabiochem公司。)在25μM下使用；在添加配体前2h，将这两种抑制剂添加到培养物中。
免疫细胞化学
将融合的肌管与层粘连蛋白或其他悬浮在含有0.5%BSA的DME中的蛋白质在37°C下孵育。用含有1 mM CaCl的PBS洗涤四次，去除未附着的蛋白质2细胞在室温下用3%多聚甲醛固定10分钟，当使用针对细胞内表位的抗体时，用含有0.5%Triton X-100的PBS在0°C下渗透。细胞在含有0.5%牛血清白蛋白和5%正常山羊血清的PBS中被封闭30分钟，并在室温下与稀释在洗涤缓冲液（PBS、0.5%牛血清和0.5%正常山羊血清）中的一级抗体孵育1小时。在多次清洗后，细胞在室温下与FITC或罗丹明结合的二级抗体孵育1小时。清洗细胞，盖上1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(西格玛化学公司。)，并使用奥林巴斯IX-70倒置荧光显微镜和冷却CCD相机(普林斯顿仪器Micromax）。
抗体
如前所述，产生了针对小鼠层粘连蛋白-1、人层粘连蛋白质-2、层粘连蛋白酶-1片段E4、E8和E3以及重组层粘连素α2-G结构域的兔多克隆抗体(13). 亲和纯化和广泛交叉吸收后，发现抗-E4、抗-E8、抗E3和抗-α2（G）对层粘连蛋白的这些区域具有高度特异性。抗α7整合素亚单位的CY8小鼠单克隆IgG腹水由Randy Kramer博士（加州大学旧金山分校）提供，并稀释1:500用于阻断实验和间接免疫荧光。IIH6小鼠单克隆IgM是由Hiroki Yamada博士和Kevin Campbell博士（爱荷华州爱荷华市爱荷华大学霍华德·休斯医学研究所）提供的，用于对抗兔抗肌营养不良聚糖，并以1:2稀释的杂交瘤培养基使用。以下抗体是从商业上获得的。以1:25的比例使用针对β-dystroglycan COOH末端区域的小鼠单克隆抗体（Novocastra Laboratories）。以10–20μg/ml的剂量使用针对β1整合素亚单位的地鼠单克隆IgM进行阻断实验，以5μg/ml剂量使用间接免疫荧光(法尔敏根). 以1:50的稀释度使用抗肌营养不良蛋白中央结构域的小鼠单克隆IgM（Upstate Biotechnology）。以1:800的稀释度使用对肉质α-肌动蛋白特异的小鼠单克隆IgG(西格玛化学公司。). 以1:400稀释度使用人纤维连接蛋白特异性兔多克隆IgG(西格玛化学公司。). 以1:100的稀释度使用针对vinculin的小鼠单克隆IgG(西格玛化学公司。). 在推荐的稀释液（Jackson Immunochemicals和西格玛化学公司。).
蛋白质类
小鼠层粘连蛋白-1从链丝蛋白EHS肿瘤中提取并纯化(63). 如前所述，从人类胎盘制备层粘连蛋白-2和-4（均含有α2链亚单位）(7)，使用之前开发的程序的修改(4). 用弹性蛋白酶或组织蛋白酶G消化层粘连蛋白-1后，制备层粘连蛋白质的特定片段(63). 弹性蛋白酶片段包括：E1′，所有三个NH的部分复合物2-末端短臂与巢蛋白片段相关；E4，β链短臂结构域V和VI；E8，远端长臂线圈区和近端G区（G重复1-3）；和E3，远端G结构域（G重复4和5）。组织蛋白酶G片段C8-9与弹性蛋白酶片段E8相似，但更大，包括大多数卷曲线圈。如前所述，生成并纯化重组层粘连蛋白α链蛋白α1（VI-IVb）、α2（VI-IV b）和α2（G）(12,13,45). 人纤连蛋白购自西格玛化学公司。
蛋白质分析
100 mM丝氨酸蛋白酶抑制剂第页-氨乙基苯磺酰氟（AEBSF，1HCl）与层粘连蛋白在冰上孵育过夜，并用于灭活层粘连蛋白质的自组装（见图。). 透析AEBSF处理的层粘连蛋白以去除游离AEBSF，并通过两轮聚合条件（37℃，3 h）去除任何潜在活性层粘连蛋白质。[14C] AEBSF（美国放射性标记化学品公司）的比活性为55 mCi/mmol。对于结合研究[14C] AEBSF与层粘连蛋白一起在冰上孵育过夜，然后进行透析以去除未结合的物质。层粘连蛋白被弹性蛋白酶消化(伯林格·曼海姆)在25°C下使用1:100的酶/底物比24小时。绑定[14C] 在通过SDS-PAGE分离的片段上使用PhosphoImaging（Bio-Rad GS-250；Bio-Rad Laboratories）测定AEBSF。如前所述，进行了评估层粘连蛋白聚合物形成和层粘连素细胞粘附的试验(7,12).
使用AEBSF生成非聚合层粘连蛋白。（A） 的绑定[14C] AEBSF转层粘连蛋白水解片段。层粘连蛋白与[14C] 用弹性蛋白酶处理AEBSF以生成标准层粘连蛋白弹性蛋白酶片段（图。A、 层粘连蛋白片段图）。使用SDS-PAGE分离总层粘连蛋白消化物，并通过磷酸分析测定碳-14掺入量，此处显示的是相对于片段迁移位置。大多数[14C] AEBSF与E1′结合，这是一个片段，显示包含聚合所必需的位点。（B） 对AEBSF处理的层粘连蛋白（开环）和未处理的层黏连蛋白（闭环）在溶液中形成聚合物的能力进行评估。将层粘连蛋白在37°C下培养3 h，并通过离心分离聚合物部分（见材料和方法）。未处理的层粘连蛋白表现出浓度依赖性聚合，而AEBSF处理的层黏连蛋白仍保留在溶液中。（C） 比较AEBSF处理的层粘连蛋白（开环）和未处理的层粘蛋白（闭环）支持C2C12成肌细胞粘附的能力。经处理和未经处理的层粘连蛋白都支持粘附，并且对底物浓度的依赖性相似。此外，用与融合肌管结合的AEBSF处理层粘连蛋白片段（E3、E8、C8和9）（未显示）。
结果
层粘连蛋白与肌管表面结合形成网络
为了了解层粘连蛋白如何与肌肉细胞相互作用，我们评估了C2C12细胞（小鼠肌源性细胞系）上的层粘连素(60). 当缺乏有丝分裂原时，这些细胞融合并形成长的多核肌管，在培养中自发跳动（图。f、 相位显微照片）。幸运的是，这些细胞似乎只产生低水平的内源性层粘连蛋白，所以添加层粘连素很容易监测。我们用层粘连蛋白-1（α1β1γ1）孵育融合肌管，发现层粘连素与背侧肌管表面结合（图。). 最初（15分钟），层粘连蛋白结合是弥散的（图。（a和a′），但随后（1 h）表面出现聚集成网状图案（图。、b和b′）。4小时后，细胞表面的层粘连蛋白组织主要以重复的多边形网络出现，尺寸通常在1到3μm之间（更多细节见c′中的放大倍数）。此外，这些长时间的培养揭示了从层粘连蛋白网络的广泛覆盖到层粘连蛋白质的更多焦点区域的转变（d显示4小时时的另一个肌管）。这种转变伴随着层粘连蛋白紧密网络的出现，其周围是层粘连素很少或没有的区域。这些区域保持着在更广泛的层粘连蛋白网络中看到的重复的亚结构，但整个结构有点密集。用新鲜层粘连蛋白不断补充培养基并没有改变这种从普遍存在到更集中层粘连蛋白质覆盖的进展，这表明层粘连素受体的可及性、组成或激活状态发生了变化。此外，在层粘连蛋白存在下孵育长达24小时的肌管保持健康，并维持局部层粘连蛋白质网络。
层粘连蛋白与肌管表面结合并形成网络。使用针对特定层粘连素亚基的多克隆抗体以及罗丹明结合的二级抗体，可以观察到层粘连到C2C12肌管表面。在与1μg/ml层粘连蛋白-1孵育15分钟后，在背部肌管表面上可以看到层粘连素呈弥散点状分布（a和a′）。在1小时内，层粘连蛋白以更聚集的网状结构（b和b′）组织。用10μg/ml层粘连蛋白-1（c，c′，和d）孵育4小时的肌管表面显示出层粘连蛋白质的广泛重复多边形网络（该网络的更高放大视图见c′，箭头表示多边形单元）。在4小时时，许多肌管也包含层粘连蛋白清除的区域，表面网络出现在更紧密的簇中（d）。与BSA孵育的对照肌管显示很少层粘连蛋白染色（e）。纤维结合蛋白（10μg/ml，持续4小时）主要在含有成肌细胞的区域形成纤维结构，而不是肌管（f，相显微照片，f′，抗纤维结合蛋白）。棒材，5μm。
层粘连蛋白利用其COOH末端长臂与肌管表面结合
首先，我们试图确定大的多亚单位层粘连蛋白分子的哪些区域直接与肌管细胞表面相互作用（图。). 对一组层粘连蛋白蛋白水解片段和重组层粘连蛋白质结构域进行评估，以确定哪些结构域直接与肌管细胞表面受体结合。在这里，我们考虑了含有α1-和α2-链的层粘连蛋白的结合特性，如复合模型所示（图。A） ●●●●。该模型描述了层粘连蛋白片段的边界以及一些已知的与受体和细胞外基质分子相互作用的位点。
层粘连蛋白使用其COOH末端长臂结合到肌管表面。（A） 层粘连蛋白水解片段和重组蛋白的结构/功能图，显示为层粘连蛋白质-1（α1β1γ1）和层粘连蛋白酶-2（α2β1γl）共同特征的复合物。蛋白质水解片段包括：E1′、E4、E8和E3。重组蛋白包括：α1（VI-IVb）、α2（VI-IV b）和α2（G）。受体结合位点为：α1β1、α2β1、γ7β1整合素和α-dystroglycan（αDG）。细胞外基质分子的结合位点：层粘连蛋白聚合物形成区（α-、β-和γ-短臂的结构域V和VI）、凝集素/鸟嘌呤（En/Nd）和精氨酸。使用的突变包括：营养不良α2链中缺失的57个氨基酸区第y天2J型鼠标（Δ第y天2J型). （B） 层粘连蛋白COOH末端长臂蛋白与肌管表面的直接结合。层粘蛋白-1和层粘蛋白-2结合肌管，1小时后形成网状结构（插图）。NH重组层粘连蛋白α亚基蛋白2-末端短臂区（α1-和α2[VI-IVb]′）没有检测到结合。COOH末端蛋白，包括蛋白水解片段E8和E3，以及重组α2-G结构域蛋白显示出广泛附着在肌管表面，但仍呈弥漫性点状分布。插图以两倍的放大率显示区域。
我们发现层粘连蛋白由远端COOH末端结构域组成，而不是NH端结构域2-使用间接免疫荧光法在细胞表面检测到末端结构域（图。B） ●●●●。NH2-先前已经使用PC12、HT1080和原代大鼠Schwann细胞证明α1和α2层粘连蛋白亚基（α1[VI-IVb]和α2[VI-IVb]）的末端短臂区域具有活性的α1β1和α2-β1整合素结合位点(12). 相反，我们没有检测到C2C12肌管与α1和α2层粘连蛋白短臂之间有任何显著的结合水平，这表明融合的肌肉细胞并不直接与这些NH相互作用2-终端域。此外，我们没有检测到短臂蛋白水解片段E1′和E4的结合（数据未显示）。蛋白水解片段E8和E3，来自小鼠层粘连蛋白-1的COOH末端长臂(34)与细胞表面结合，呈弥散分布，呈点状染色。由整个α2亚基G结构域组成的重组层粘连蛋白(45)也与表面结合，染色模式与E3和E8相似。片段E8已被证明介导层粘连蛋白与α7β1整合素的结合(57)而片段E3已被证明介导与α-肌营养不良聚糖的结合(22). 虽然这两个片段都结合在细胞表面，但都没有形成完整的层粘连蛋白-1或层粘连蛋白质-2的大聚集体和网络。这种差异的一种解释可能是整合素和肌营养不良多糖结合需要同时发生，作为协同受体刺激表面聚集。为了测试这种可能性，我们用E3和E8的混合物培养细胞。然而，染色模式仍然与单个片段的染色模式相似（未显示），这表明两种受体类型的占用不足以产生较大的表面聚集。
接下来，我们测试了表面结合蛋白或抗体阻断或改变肌管表面完整层粘连蛋白组织模式的能力（图。). 首先，用COOH末端长臂片段E3或E8，或E3和E8的组合，或成熟肌纤维层粘连蛋白的两个主要受体、整合素和肌营养不良聚糖的阻断抗体将细胞培养1小时。用这些试剂处理后，添加完整的层粘连蛋白1小时。用NH特异性抗体探测细胞2-层粘连蛋白的末端区域，因此仅检测与表面结合的完整层粘连蛋白质（即，不是片段E3或E8）。令人惊讶的是，针对β1整合素亚基或α7整合素子基（未显示）的功能阻断抗体对层粘连蛋白与肌管表面结合和聚集的能力几乎没有影响。这些相同的抗体完全阻止片段E8和C8-9（大于E8，片段C8-9还包含agrin结合位点）与肌管表面的结合，证明这些抗体阻止α7β1整合素结合相互作用（未显示）。相反，用干扰层粘连蛋白-肌营养不良多糖相互作用的抗体（mAb IIH6）治疗对层粘连蛋白质表面聚集和网络形成有明显影响。此外，含有肌营养不良多糖结合位点的片段E3显著降低了层粘连蛋白在肌管表面的结合和聚集。片段E3的阻断作用始终大于解冻多糖。一种解释可能是E3片段包含额外的、不太突出的受体结合位点。这种单克隆IgM产生的部分或微弱阻断作用也可能是造成这种差异的原因。然而，与E8介导的相互作用相比，E3介导的交互作用在直接结合和随后的聚集中起着更显著的作用。最后，结合片段E3和片段E8的孵育现在完全阻断层粘连蛋白与肌管表面的结合。在较长的层粘连蛋白孵育过程中，单一或多种试剂的抑制程度持续存在：用层粘连素处理4小时后，E3显著阻止层粘连蛋白质网络和簇形成，E8几乎没有阻止层粘着蛋白网络和簇的形成，二者的结合完全阻止层粘连素网络和簇生成（未显示）。
阻断受体相互作用破坏层粘连蛋白表面网络。层粘连蛋白COOH末端蛋白和/或受体阻断抗体用于竞争层粘连素结合位点。将肌管与以下蛋白质预孵育1 h：BSA（对照）、片段E3、片段E8、抗β1整合素阻断抗体、抗冻多糖（抗DG）或片段E3和E8的组合。使用NH特异性抗体观察培养后的层粘连蛋白（5μg/ml，持续1小时）2-层粘连蛋白β1亚单位的末端区域（抗E4，不识别COOH末端片段E3和E8）。单独使用片段E3的阻断导致层粘连蛋白结合和细胞表面网络形成的大幅减少，而使用E8或整合素阻断抗体阻断长臂整合素结合位点的效果最小。用抗α-肌营养不良聚糖的抗体处理破坏层粘连蛋白表面网络的程度低于用片段E3阻断。阻断E3和E8介导的细胞识别域完全抑制层粘连蛋白与表面的结合。棒材，10μm。
层粘连蛋白聚合是形成表面网络的必要条件
为了确定是否需要层粘连蛋白-层粘连素聚合物键来介导细胞表面层粘连蛋白质网络的形成，我们使用了几种方法来选择性地分析聚合物的形成。用AEBSF处理层粘连蛋白可生成非聚合层粘连蛋白质，AEBSF是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，我们偶然发现它能与层粘连蛋白酶共价结合（图。). 通过培养层粘连蛋白和[14C] AEBSF，然后是用于生成层粘连蛋白片段的标准弹性蛋白酶蛋白水解条件(34). 图。A显示了与各种层粘连蛋白弹性蛋白酶蛋白水解片段结合的同位素的相对量。我们发现几乎所有的标签都与E1′相关，E1′是一个主要由α-和γ-NH组成的片段2-层粘连蛋白聚合物形成所必需的末端短臂和包含位点(48,63). 相反，COOH末端长臂碎片E3和E8几乎没有结合[14C] AEBSF公司。尽管AEBSF治疗消除了层粘连蛋白在溶液中形成聚合物的能力（图。B） 到目前为止，它与我们测试的细胞类型（HT1080、C2C12、1072Sk成纤维细胞和原代雪旺细胞）中的表面受体（包括α1β1、α2β1、γ3β1、β6β1和α7β1整合素）相互作用的能力保持不变。C2C12成肌细胞与未经处理和AEBSF处理的层粘连蛋白-1的粘附如图所示。C.此外，我们发现，在用AEBSF治疗后，肌营养不良聚糖结合片段E3保留了其与肌肉细胞表面相互作用的能力（未显示），并且在AEBSF处理后，层粘连蛋白对肌营养不良多糖的亲和力保持不变（Combs，A.和J.Ervasti，个人通信）。基本上，该试剂产生了一种非聚合但具有其他功能的层粘连蛋白分子，并允许我们直接测试层粘连蛋白质聚合物形成的作用，而不依赖于其细胞粘附功能。
我们发现非聚合AEBSF–层粘连蛋白无法在细胞表面形成聚集物和网络（图。，AEBSF-Lm）。在溶液中选择性破坏层粘连蛋白聚合物键的条件(48)也发现破坏层粘连蛋白细胞表面组织，但对表面受体的结合没有影响（图。). 具体而言，层粘连蛋白短臂蛋白水解片段E1′或E4的摩尔过量阻止了1小时后出现的层粘连蛋白质表面聚集物的形成。聚合抑制也阻止了长时间孵育后层粘连素网络和簇的形成。4小时后，聚合竞争性层粘连蛋白出现在广泛的网络和更紧密的簇中。然而，AEBSF处理的层粘连蛋白或被片段E1′阻断的层粘着蛋白并没有形成这些结构。
层粘连蛋白聚合物键是细胞表面形成网络所必需的。用阻止层粘连蛋白聚合但不阻止细胞粘附活性的试剂处理层粘连。将肌管与这些缺乏聚合物的层粘连蛋白以1μg/ml（顶部）的浓度培养1小时，或以10μg/ml的浓度培养4小时，然后评估层粘连蛋白质聚集体的存在。在存在短臂片段E1′和E4的情况下，层粘连蛋白在1小时内无法组织成网状簇（未经处理的层粘连素如左图所示）。同样，AEBSF处理的层粘连蛋白（图。)没有在细胞表面重组成聚集体。聚合体裂解试剂E1′和AEBSF也阻断了有序层粘连蛋白网络的形成（4小时）。棒材，5μm。
层粘连蛋白聚合是诱导受体和细胞骨架成分的皮层网络所必需的
评估有无层粘连蛋白时受体和皮质细胞骨架的组织。用多聚体竞争性层粘连蛋白处理肌管4小时，导致α7β1整合素、肌营养不良蛋白、肌营养障碍蛋白和皮质小血管蛋白的重排，而不是α-肌动蛋白（图。). 对层粘连蛋白处理的肌管进行双重标记，以显示层粘连素网络、肌膜蛋白（α7和β1整合素亚单位、肌营养不良蛋白、血管蛋白、肌营养障碍蛋白和α-肌动蛋白）及其重叠分布（图。，合并显示在左侧）。整合素（α7和β1亚基）、肌营养不良聚糖、长春新碱和肌营养不良蛋白形成了重复的多边形结构，其外观和位置与层粘连蛋白形成的结构相似。在层粘连蛋白网络下，两种受体类型也共同分布（图。、dystroglycan和整合素双重标记）。图的底部两行显示了用BSA和用非聚合层粘连蛋白孵育的肌管。在这些肌管中，β1整合素、dystroglycan、vinculin和dystrophin的组织结构差异很大，呈散在分布，并有小簇区域。因此，能够与受体结合但不能形成表面聚合物的层粘连蛋白不足以诱导受体和细胞骨架重排。
层粘连蛋白聚合诱导细胞表面受体和皮层细胞骨架成分的选择性重组。肌管与10μg/ml层粘连蛋白-1孵育4h，然后进行双重间接免疫荧光，以显示结合层粘连素和各种肌膜蛋白：Lm、层粘连蛋白质；α7、α7整合素亚基；β1、β1整合素亚单位；DG，dystroglycan；vinc、vinculin；DN，肌营养不良蛋白；α-作用，α-肌动蛋白。最左侧的成对集合的合并图像显示为黄色。用BSA或非聚合（AEBSF处理）层粘连蛋白处理的肌管中的肌膜蛋白显示在图像的底部两行。在存在可聚合的层粘连蛋白的情况下，受体和细胞骨架蛋白重组为类似的多边形模式，彼此并与层粘连蛋白质共定位。棒材，5μm；插图是放大倍数的两倍。
肌动蛋白重组和酪氨酸磷酸化是层粘连细胞表面网络形成的必要条件
层粘连蛋白聚合物的结构及其～35nm的支撑网络只能在电子显微镜水平上进行观察。当由聚合引发时，层粘连蛋白表面网络的有组织的半规则外观表明，这种结构的形成可能是一个活跃的过程，可能需要重塑皮层肌动蛋白网络，甚至是信号事件。我们通过比较在细胞松弛素存在或不存在的情况下培养的肌管上层粘连蛋白的组织来研究肌动蛋白的作用，细胞松弛素是一种阻止丝状肌动蛋白组装和分解的物质（图。). 与对照肌管相比，细胞松弛素处理的肌管即使在4小时后也没有表现出表面层粘连蛋白重排成复杂网络的显著现象。高倍放大检查（图。，插图）揭示了层粘连蛋白覆盖区域的精细亚结构，这与对照培养物中的较大、轮廓更清晰的多边形单位有很大不同。此外，层粘连蛋白从肌管表面大区域的清除受到抑制。
抑制肌动蛋白重组或酪氨酸磷酸化可防止层粘连蛋白表面网络的形成。肌管预先孵育有细胞松弛素（一种干扰肌动蛋白丝组装和分解的试剂）或染料木素（一个阻止酪氨酸磷酸化的试剂）。用5μg/ml层粘连蛋白孵育处理过和未处理过的肌管，并在4小时后评估层粘连素表面网络的存在。细胞分裂素和染料木素均能阻止特征层粘连蛋白质表面网络的形成，并破坏层粘连质的重组和清除。棒材，5μm；插图是放大倍数的两倍。
接下来，我们评估了是否需要依赖能量的信号级联来促进细胞表面层粘连蛋白网络的形成。我们发现，金雀异黄素是蛋白质酪氨酸激酶的一般抑制剂，对层粘连蛋白形成表面网络的能力有很大影响（图。). 在染料木黄酮处理的肌管上，层粘连蛋白覆盖似乎无处不在，而且没有太多复杂性，类似于细胞松弛素处理的细胞。相反，其他几种信号分子抑制剂对层粘连蛋白网络的形成几乎没有影响（未显示）。它们是沃特曼（一种不可逆的磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂）和ML-7盐酸盐（一种肌球蛋白轻链激酶的选择性抑制剂，常用于干扰肌动蛋白-肌球蛋白的收缩性）。观察到的肌动蛋白重塑需要表明Rho家族小GTPase的作用(27). 为了解决这种可能性，我们使用了C3转移酶，一种Rho的选择性抑制剂，但这种治疗被发现严重破坏了肌管的粘附和结构。因此，它不能用于评估Rho介导的信号在层粘连蛋白表面网络形成中的作用。
层粘连蛋白用dy表示2J型/第y天2J型老鼠在形成表面网络方面有缺陷
小鼠纯合子迪2J型发现LAMA2等位基因在5′编码区发生点突变，导致异常剪接事件(55,59). 这种基因缺陷导致严重的进行性肌营养不良，被认为类似于许多由LAMA2突变引起的人类先天性肌营养障碍。由于拼接不规则，第y天2J型/第y天2J型小鼠表达了一个突变的层粘连蛋白α2链，在结构域VI中缺少57个氨基酸，NH最多2-末端短臂结构域（参见层粘连蛋白图，图。A） ●●●●。尽管如此，这种异常的层粘连蛋白亚基与β和γ链形成异源三聚体，分泌并定位于肌膜基底膜。
随后，研究人员发现，来自骨骼肌的含有α2-链的层粘连蛋白（层粘连素-2和-4的组合）第y天2J型/第y天2J型小鼠在溶液中形成聚合物的能力存在缺陷（Colognato，H.和P.D.Yurcenco，手稿编制中）。这种聚合缺陷很可能是这些小鼠出现营养不良的原因，因为层粘连蛋白α2结构域VI中的受体识别位点似乎不用于成熟骨骼肌。在体内，这种突变层粘连蛋白似乎仅通过与IV型胶原网络的连接而被固定在基底膜内，因为我们发现用胶原酶消化肌肉组织可以释放第y天2J型-层粘连蛋白溶解。通常，肌肉层粘连蛋白需要用EDTA进行额外处理，以破坏钙依赖的层粘连蛋白质聚合物。
除了深入了解LAMA2肌肉营养不良的机制外，dy2J型-层粘连蛋白为研究一种天然存在的聚合物缺陷层粘连蛋白提供了机会
我们纯化了从野生型和第y天2J型/第y天2J型并评估了这些层粘连蛋白附着到肌肉细胞受体并组织成表面网络的能力（图。A） ●●●●。用野生型小鼠α2-层粘连蛋白孵育4小时的肌管显示层粘连素表面网络广泛形成。高倍镜下的插图（3倍）清楚地显示了层粘连蛋白-1的特征性层粘连网络结构。平均而言，与层粘连蛋白-1相比，重复多边形单元的间距通常更紧凑，但两者的单元大小范围相似。相反，第y天2J型–α2-胺蛋白与肌管表面结合，但没有形成这些有组织的结构，仍呈弥散分布的点状。这种模式与非聚合层粘连蛋白-1类似（图。).
聚合物缺陷层粘连蛋白第y天2J型/第y天2J型小鼠不会形成表面网络，也不会诱导肌膜重组。（A） 顶部框架显示+/+和+/+骨骼肌层粘连蛋白的SDS-PAGE第y天2J型/第y天2J型老鼠。在还原条件下用SDS-PAGE分离小鼠骨骼肌中提取的蛋白质，并用考马斯蓝进行可视化。箭头表示第y天2J型层粘连蛋白α2亚单位，大约比天然α2小25 kD。底部框架：第y天2J型–α2-层粘连蛋白与肌管表面结合，但不能形成网络。在孵育4小时的肌管上，野生型小鼠的α2-层粘连蛋白形成网络（+/+），而迪2日–α2-层粘连蛋白呈点状弥散分布(第y天2J型/第y天2J型). 棒材，5μm；插图，放大三倍。（B）第y天2J型–α2-层粘连蛋白不会诱导肌膜蛋白重组为皮质网络。将来自野生型（wt-lm2）或迪2J型/第y天2J型老鼠(dy2j型-lm2）并协同染色以显示层粘连蛋白α2亚基和b1整合素亚基（β1）、肌营养不良聚糖（DG）或小病毒蛋白（vin）。α2-层粘连蛋白诱导整合素、dystroglycan和vinculin的重组，而第y天2J型–α2-层粘连蛋白没有。棒材，10μm。
聚合物缺陷dy2J型–α2-层粘连蛋白未能诱导受体和皮层细胞骨架蛋白的重组
用野生型或第y天2J型–α2-层粘连蛋白，并通过间接免疫荧光显示。双重染色显示了层粘连蛋白和以下肌膜蛋白的位置和关系：β1整合素亚基、肌营养不良聚糖和小病毒蛋白（图。B） ●●●●。在野生型α2-层粘连蛋白存在的情况下，可以观察到相应的整合素、肌营养不良聚糖和管状蛋白网络的诱导，但第y天2J型–α2-层粘连蛋白未能诱导这种重组。与非聚合层粘连蛋白-1存在时一样，层粘连素受体仍呈弥散分布、点状分布，维库林也是如此。此外，在与聚合层粘连蛋白-1或-2孵育的肌管中，皮层区域的小病毒染色强度似乎更大，这表明小病毒正在被招募到皮层并重组。
讨论
细胞外基质分子层粘连蛋白先前被描述为具有两个主要的，虽然独立的功能：(1)细胞表面受体的配体，介导神经突起生长和防止凋亡等过程，以及(2)一种形成聚合物的结构分子，是基底膜结构所必需的，为相邻细胞提供机械支撑。在这项研究中，我们提出了证据，证明这两种类型的功能实际上是整合的，协同作用以重组细胞表面和相邻的皮层细胞骨架（图。). 这种层粘连蛋白诱导的过程似乎代表了复杂细胞信号传递的一种特殊机制。对于这些细胞，这种机制似乎是层粘连蛋白特异性的，不是通过添加纤维连接蛋白、IV型胶原，甚至是通过添加二价抗体来人工聚集非聚合层粘连素（未显示）。我们已经证明，层粘连蛋白附着在细胞表面，同时与肌营养不良聚糖、整合素α7β1和层粘连长臂的其他受体结合。因此，受体增强的层粘连蛋白的浓度选择性地增加，现在超过层粘连蛋白质自组装的临界浓度，并优先在细胞表面驱动聚合（受体促进的自组装）。此外，通过协同的聚合物和受体相互作用，层粘连蛋白在细胞表面组织成复杂的多边形阵列。这似乎是一个活跃的过程，需要肌动蛋白丝和酪氨酸激酶信号的重塑。层粘连蛋白聚合诱导层粘连素受体的重组，包括整合素和肌营养不良蛋白，以及皮层细胞骨架的元素、管状蛋白和肌营养障碍蛋白。此外，我们发现一种突变的层粘连蛋白导致肌肉营养不良和髓鞘异常第y天2J型/迪2J型小鼠在形成表面网络和诱导肌膜结构发生这些特定变化的能力方面存在缺陷。
肌膜质膜上受体促进层粘连蛋白聚合的模型。层粘连蛋白的受体促进自组装是通过层粘连蛋白质-层粘连聚合物协同作用和层粘连素-受体相互作用实现的。在肌肉肌膜上，三个NH2-层粘连蛋白的末端短臂介导聚合物相互作用，而层粘连素的COOH末端长臂介导受体结合。基底膜组装过程反过来调节组织信号，重新排列皮层细胞结构，将基质、受体和细胞骨架元件组装成多边形网络。我们发现，这种有组织网络的形成是一个主动驱动的合作过程，需要层粘连蛋白受体促进的自组装、肌动蛋白重组和酪氨酸磷酸化。
肌肉肉瘤层粘连蛋白：受体连接不足以诱导
在过去几年中，LAMA2基因的许多突变被确定为先天性肌营养不良的病因（CMD，参考文献53）。此外，这类新出现的疾病的特征是伴有外周和中枢神经系统异常，这表明除了骨骼肌组织外还需要这种层粘连蛋白。虽然这些层粘连蛋白突变的分离为理解这些先天性疾病过程提供了一个重大突破，但对其分子机制的深入了解仍然很难。许多已鉴定的突变导致层粘连蛋白α2蛋白完全缺失，但可能伴随着不同程度的额外层粘连链上调，如α4和α5，其重叠功能的程度尚不清楚(43). 突变导致表达蛋白具有特定功能缺失，这是一个较小的群体，可能导致对特定层粘连蛋白功能的贡献进行更选择性的分析。由于层粘连蛋白亚型具有许多重叠的功能，结构/功能相关性可能允许识别层粘连候选蛋白，这些候选蛋白可以上调或表达以纠正α2缺乏型CMD，类似于对营养不良蛋白阴性的营养不良的抢救中密度纤维板使用肌营养不良蛋白同源物utrophin的小鼠(44,56).
营养不良第y天2J型小鼠的层粘连蛋白α2转录本异常剪接，这是剪接供体位点的点突变所致(55,59). 由此产生的α2蛋白被表达，并入层粘连蛋白异源三聚体，并定位于肌膜基底膜。域VI中的α2链短臂缺陷类似于几个人类CMD，它们在NH中表达部分功能性α2蛋白缺陷2-终端短臂(1,11,42). 在这项研究中，我们发现融合的肌肉细胞通过COOH末端长臂中的受体结合位点与层粘连蛋白结合，距离聚合物形成缺陷的短臂区域约110 nm（Colognato，H.和P.D.Yurcenco，手稿编写中）。这种层粘连蛋白通过与细胞表面受体的相互作用和与IV型胶原网络的连接而保留在基底膜内，后者由戊聚糖/nidogen介导。在这种情况下，层粘连蛋白聚合的主要作用似乎不太可能仅仅是将层粘连蛋白对接到基底膜中并提供机械系链。因此，我们试图了解层粘连蛋白聚合如何以促进肌肉功能和最终生存的方式改变肌肉肌膜。我们在这里报道的新型层粘连蛋白功能似乎是一个可能的候选：在层粘连素聚合反应中，诱导基质、受体和皮层细胞骨架成分的组织发生剧烈变化。这种诱导可能是层粘连蛋白聚合维持适当细胞结构和功能的关键要求。
配体结构在受体占用之上和之外的作用
一些生长因子介导的信号通路不仅依赖于受体的配体占用，还依赖于这些受体的二聚体化(三,9,62). 在一个相关的概念中，由纤维连接蛋白原纤维介导的受体聚集被认为是向这些位点募集大量细胞骨架成分和信号分子(38,61). 对于这一过程，已有研究表明，单独的配体占用（由RGD肽提供）仅激活由纤维纤维连接蛋白网络介导的一小部分反应。类似或相关机制可能在层粘连蛋白信号传递中发挥作用，尽管层粘连素在分布、受体伙伴、，超分子组装方式。例如，纤维连接蛋白形成纤维状而非网状聚合物，在缺乏受体相互作用的情况下，其组装过程不会发生。这种差异对我们的研究很有帮助，因为我们能够独立于受体占据来评估层粘连蛋白的聚合过程，并评估层粘连蛋白诱导的变化在多大程度上是聚合物诱导的。
传统上，基底膜被认为是邻近细胞的支持性基质，可以使细胞粘附或迁移。这里的数据表明，层粘连蛋白在基底膜中的超分子结构具有更动态的指导作用。近年来，有证据表明，蜂窝结构具有传输信息的能力。这一范式的前沿是张力整体概念，这是一种机械传递模型，其中细胞通过基质受体-细胞骨架核连续体对物理环境中的机械应力和变化作出反应(30). 为了支持这一模型，基质分子的空间排列被证明可以介导诸如增殖、凋亡和细胞骨架结构的排列等过程(6,31,33,40). 在这项研究中，我们发现层粘连蛋白结构的改变能够指导肌肉细胞，导致受体和细胞骨架结构的改变。有趣的是，初步数据表明，层粘连蛋白聚合可以激活酪氨酸磷酸化，其激活程度高于非聚合层粘连蛋白质（Hanus，C.和P.D.Yurcenco，未发表的观察结果）。
某些层粘连蛋白结构域被掩盖或蛋白水解改变的研究也支持层粘连蛋白质结构能够影响细胞反应的观点(5,25). 在这些研究中，修饰的层粘连蛋白结构域与与相关细胞受体相互作用的区域完全不同。在Giannelli及其同事进行的一项研究中，发现γ2亚基短臂中的蛋白水解裂解转化了由层粘连蛋白-5的G结构域介导的细胞相互作用，将静态粘附活性转化为癌细胞所使用的侵袭性迁移活性。这种功能转换的机制尚不清楚，但通过这些配体的结构安排传递的信息可能会起到很好的作用。
层粘连蛋白聚合与层粘连素-受体相互作用的协同性
层粘连蛋白-受体相互作用与基底膜形成之间的关系近年来得到了研究。β1整合素亚基和肌营养不良聚糖的靶向基因破坏对胚胎发育都是致命的，表明在胚胎基底膜的正确组装和随后的功能中需要受体(19,52,58). 此外，α3、α6和β4整合素亚基的突变会导致皮肤表皮基底膜的缺陷，常常导致大疱性表皮松解症(17,24,41). 将β1缺失的胚胎干细胞注射到正常小鼠体内形成的畸胎瘤形成了异常的基底膜，这些基底膜似乎发育并脱落了相邻的细胞，通常呈多层异常增厚(2,47). 糖酵解不全的胚胎在植入后死亡，原因是未能发育出功能性的胚胎外Reichert膜，使母体血液进入卵黄囊腔。对这一特殊基底膜的检查显示，只有偶尔出现的层粘连蛋白和IV型胶原染色的斑片状区域，而不是正常观察到的连续染色。此外，最近的研究表明，在培养基中生长形成类胚体的dystroglycan−/−胚胎干细胞也存在基膜组装缺陷(29).
如何去除dystroglycan或其他层粘连蛋白受体导致如此严重的基底膜缺陷？其他分子键，如层粘连蛋白-整合素或层粘连素-成核细胞-胶原蛋白IV，可能足以将层粘连蛋白质保留在肌营养不良蛋白缺乏细胞的基底膜内。这表明层粘连蛋白-肌营养不良多糖的相互作用除了提供简单的机械连接外，还可能对细胞起诱导作用。dystroglycan结合片段E3不仅能显著破坏层粘连蛋白表面结合，而且能显著破坏其表面组装，这与该假设一致。与整合素相比，抑制dystroglycan相互作用位点的巨大作用可能是由于表面层粘连蛋白积累的大幅减少，或与整合蛋白相比，dystrogrycan通过脂质双层的流动性更大，但也可能表明层粘连素-dystrogylcan相互作用的诱导作用。
层粘连蛋白与肌营养不良聚糖的关系也在神经肌肉连接形成的背景下进行了研究。已经发现，AChR受体聚集在一定程度上是由神经农业蛋白介导的，其机制依赖于酪氨酸激酶受体MuSK(15,21). 具有层粘连蛋白G结构域样重复的Agrin已被证明与层粘连蛋白和肌营养不良聚糖结合(16,23). 有人认为，层粘连蛋白和dystroglycan可能各自作为神经肌肉终板处agrin的贮存库，可能有助于agrin诱导AChR聚集的能力。此外，最近的研究表明，MuSK诱导的依赖性AChR集聚活性是通过添加外源层粘连素激活的(54). 事实上，层粘连蛋白-肌营养不良多糖的相互作用是层粘连素诱导的AChR聚集发生的必要条件(39). 然而，科恩及其同事的一项早期研究发现，通过将层粘连蛋白添加到爪蟾肌肉培养中，小的肌营养不良蛋白簇被转化为更大更集中的簇，但这些层粘连蛋白诱导的簇并没有伴随AChR的积累(10). 使用C2C12肌肉培养系统，我们确实观察到添加层粘连蛋白后AChR簇增加，但只有一部分簇与层粘连蛋白质共定位（未显示显微照片）。很有意思的是，层粘连蛋白聚合诱导的受体和细胞骨架重排是否在AChR聚集的MuSK依赖性途径的信号传递中发挥作用。
总之，我们提出证据表明层粘连蛋白聚合诱导由基质、受体和细胞骨架元件组成的皮层细胞结构。这个过程需要层粘连蛋白结构形成和受体连接功能之间的独特协同作用，由远端NH介导2-末端表位和COOH-末端表位。此外，我们证明负责CMD和神经系统缺陷的突变层粘连蛋白在形成表面网络并随后诱导受体-细胞骨架重排的能力方面存在缺陷。层粘连蛋白诱导的这种组织信号传导引入了一种新的机制，通过这种机制，基底膜的超分子构型指示相邻的细胞和组织。
