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细胞生物学杂志。1999年5月3日；145(3): 481–490.
数字对象标识：10.1083/jcb.1453.481
PMCID公司：项目经理2185077
PMID：10225950

蛋白酶体机械与中心体的动态关联

W.克里斯蒂安·威格利,* 罗莎琳德·法本米,* 李敏古,‡ 克里斯托弗·马里诺,§ Shmuel Muallem先生,* 乔治·德马蒂诺,*和菲利普·托马斯*
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

摘要

虽然已知的由蛋白质折叠不当引起的疾病数量仍在增加，但错误折叠多肽的识别和最终处置机制仍不清楚。例如，如何以及在何处识别和处理此类基底尚不清楚。我们在这里报告了一种特殊的亚细胞结构的鉴定，在基本条件下，20S蛋白酶体、PA700和PA28（分别为700-kD和180-kD蛋白酶体激活物复合物）、泛素、Hsp70和Hsp90（分别为70-kD热休克蛋白）集中在HEK 293和HeLa细胞中。该结构为核周结构，被内质网包围，毗邻高尔基体，与γ微管蛋白共定位，γ微管是一种已建立的中心体标记物。含有纯化中心体的密度梯度组分富含蛋白酶体成分和细胞应激伴侣。中心体相关结构因蛋白酶体活性的抑制和错误折叠蛋白的水平而增大。例如，CFTR的折叠突变体在蛋白酶体活性受到抑制时从中心体产生大的内含物。在错误折叠蛋白水平较高的情况下，结构不仅扩大，而且广泛吸收泛素、Hsp70、PA700、PA28和20S蛋白酶体的细胞溶质池。因此，中心体可以起到支架的作用，它集中并招募系统，这些系统充当折叠、聚集和退化之间平衡的检查器和调制器。

关键词：蛋白酶体、蛋白质错误折叠、内含物、CFTR、中心体

M（M）任何病理学是由于突变蛋白不能正确折叠而引起的(托马斯等人，1995年). 因此，了解错误折叠的蛋白质被细胞识别、加工并最终降解的机制非常重要。26S蛋白酶体催化受损或错误折叠蛋白质的细胞内降解，短寿命调节蛋白（如参与细胞周期控制和信号传递的蛋白）的快速降解，以及生成抗原肽以提交给MHC-I(Coux等人，1996年). 蛋白酶体降解大多数底物需要泛素的共价结合，泛素是由三种酶的顺序作用催化的事件(Ciechanover，1994年;Hochstrasser，1996年). 泛素化机制进行性作用，产生多泛素链，作为26S蛋白酶体降解修饰蛋白的信号。

26S蛋白酶体由两个主要亚复合物组成。20S蛋白酶体是一个700-kD的圆筒，构成蛋白酶的催化核心(Coux等人，1996年;Baumeister等人，1998年). 结构(Lowe等人，1995年;Groll等人，1997年)和生化证据(温泽尔和鲍迈斯特，1995年)表明催化位点位于气缸的空腔内。通过圆柱体末端的狭窄开口可以进入这些位点，这些开口可能被调节蛋白控制。这种拓扑结构将底物限制为短肽和完全展开的蛋白质。

26S蛋白酶体的调节复合物是一种20亚单位、700-kD的激活剂，称为PA7001或19S盖(Coux等人，1996年)与20S蛋白酶体的任一端（或两端）结合形成26S复合体(Yoshimura等人，1993年;Coux等人，1996年;Adams等人，1997年). 这种结合可能通过打开中央空腔的通路来激活蛋白酶体功能，从而增加底物对催化位点的通路。PA700具有多种ATP酶活性(Coux等人，1996年)结合并裂解多泛素(Lam等人，1997年)，可能通过展开和/或将其底物转移到中央空腔来增强蛋白质的降解(Ma等人，1994年;Adams等人，1997年).

20S蛋白酶体的第二个调节器是PA28或11S，这是一种180-kD的异六聚环状复合物，以与PA700相似的方向与蛋白酶体结合(Dubiel等人，1992年;Ma等人，1993年;格雷等人，1994年). PA28的活性和功能不需要泛素化底物来增加体外短肽而非大蛋白的蛋白酶体加工。γ-干扰素刺激PA28的合成，暗示其在抗原产生和呈递中可能的功能重要性(Realini等人，1994年;Ahn等人，1995年;Dick等人，1996年). 新数据表明蛋白酶体可能与PA28和PA700同时存在于体外复合物中，尽管这种观察的生理相关性尚不清楚(Hendil等人，1998年).

蛋白酶体在降解不完全折叠或错误折叠蛋白质中的作用已经确立(科皮托，1997年). 例如，引起囊性纤维化（CF）的突变形式(Riordan等人，1989年)以及高达70%的野生型囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR）(沃德和科皮托，1994年;Jensen等人，1995年;Ward等人，1995年)已被证明以ATP依赖、泛素/蛋白酶体介导的方式降解(Jensen等人，1995年;Ward等人，1995年). CFTR是膜转运蛋白ATP-结合盒（ABC）表基因家族的成员(希金斯，1992年)，由五个域组成，包括两个核苷酸结合域（NBD1和NBD2）、两个跨膜域（TMD1和TMD2）和一个PKA敏感调节域（R）(Riordan等人，1989年).

值得注意的是，在迄今为止发现的800多个CF-causing CFTR突变中，有几个通过影响新生多肽折叠成功能性、稳定的天然状态的能力来启动CF病理学(Qu等人，1997年). 其中一种突变，苯丙氨酸508（ΔF508）的缺失是迄今为止最常见的，约占致病等位基因的70%(Tsui，1992年). 这种位于NBD1的突变导致一种折叠缺陷蛋白，该蛋白不完全糖基化，无法有效地运输至顶端膜(Cheng等人，1990年)被蛋白酶体降解(Jensen等人，1995年;Ward等人，1995年). 其他几种CF-causing折叠突变(Gregory等人，1991年;Sheppard等人，1996年)包括P205S，位于第三个跨膜螺旋中(Wigley等人，1998年)TMD1也会导致加工和成熟效率低下，降解加剧。

值得注意的是，当ΔF508和P205S折叠突变体呈现天然构象时，它们都具有功能，因此提高了通过纠正潜在折叠缺陷或绕过蛋白水解识别步骤来克服成熟缺陷的可能性，这可能具有治疗益处。不幸的是，抑制表达野生型或ΔF508 CFTR的HEK 293细胞中的蛋白酶体会导致多泛素化CFTR积累，包括不溶性或聚集性物种(Jensen等人，1995年;Ward等人，1995年).

热休克蛋白，如Hsp70和Hsp90，已被证明在防止蛋白质聚集和促进多种蛋白质的折叠或降解方面发挥作用。最近，某些蛋白质的泛素化被证明依赖于Hsp70，这意味着它可以靶向错误折叠或突变的蛋白质，以供蛋白酶体降解(Bercovich等人，1997年). 在这方面，Hsp70已被证明与未成熟、不完全折叠的CFTR短暂相互作用(Yang等人，1993年). 在综述这篇论文时，有报道表明Hsp90抑制剂格尔德霉素可以阻止未成熟CFTR与伴侣蛋白的结合，阻止其成熟，并通过蛋白酶体促进其降解(Loo等人，1998年).

尽管有大量证据表明蛋白酶体机制参与了多种底物的降解，但尚不清楚蛋白酶体的功能是均匀分布在整个细胞中还是分离出来的。我们在此证明中心体是蛋白酶体机械、Hsp70和Hsp90集中在休眠HEK 293和HeLa细胞系中的独特位置。此外，中心体是一种以前认为主要在细胞分裂期间起作用的结构，它对蛋白酶体的抑制作出反应，并通过扩大和补充蛋白酶体成分和Hsp70的细胞池来增加错误折叠的蛋白质水平。

材料和方法

材料

含有可表达人类CFTR cDNA的质粒pCMVNot6.2和pCMVNot6.2-ΔF是Johanna Rommens博士（多伦多儿童病院）慷慨赠送的礼物。使用了两种抗人（COOH末端）CFTR抗体：小鼠单克隆抗体24-1健赞诊断与兔多克隆抗体R3194(Zeng等人，1997年). 小鼠单克隆抗鼠Grp78（BiP）来自StressGen Biotechnologies Corp。单克隆抗泛素和抗γ-微管蛋白抗体以及罗丹明结合的小麦胚芽凝集素购自西格玛化学公司。小鼠单克隆抗Hsp70和抗Hsp90抗体来自亲和力生物试剂，Inc.山羊多克隆抗醛缩酶来自国际生物设计公司。小鼠单克隆抗层粘连蛋白B1抗体来自Zymed Laboratories，Inc.公司。来自分泌杂交瘤细胞的培养基中含有的小鼠单克隆抗β-cop抗体是George Bloom博士（德克萨斯大学西南医学中心细胞生物学系）慷慨捐赠的。荧光素结合伴刀豆球蛋白A来自Molecular Probes，Inc.。荧光标记的二级抗体来自Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.。Lactacystin购自钙生物化学所有其他材料均为市面上可买到的最高质量材料。

抗血清的制备与表征

多克隆抗PA28(Ma等人，1993年)，抗-PA28-α(Song等人，1996年)，和抗20S蛋白酶体(Ma等人，1994年)如所述生成。在鸡体内制备了抗高纯度牛PA700的多克隆抗体。从免疫鸡的蛋黄中纯化鸡IgY。在粗细胞裂解物的Western blot分析中，抗体特异性识别PA700复合物的多个亚单位，包括p112、p97、p58、p56和p45，并可使用琼脂糖结合的抗IgY抗体从溶液中特异性免疫沉淀PA700。在兔子体内制备了针对HPLC纯化肽的多克隆抗体，该肽代表PA700亚单位人类p31（Nin1p）的16个COOH末端氨基酸(Kominami等人，1995年).

P205S突变体表达载体的制备

寡核苷酸定向突变(安德鲁斯和莱斯利，1998年)用于从亲本表达载体pCMVNot6.2生成突变CFTR。简言之，根据β-内酰胺酶中第二位点突变的掺入选择突变体，该突变改变了其底物特异性，导致转化细菌对头孢噻肟和头孢曲松以及氨苄西林产生耐药性。用于产生P205S的诱变引物序列为5′-CGTGTGATCTTTGCAAGTGGC-3′。通过DNA测序验证了突变的结合。使用Qiagen公司提供的试剂制备转染质量的质粒DNA。

细胞培养和转染

使用Fugene哺乳动物转染试剂将野生型和突变型CFTR cDNA转染到人类胚胎肾（HEK）293或HeLa细胞（美国型培养物收集）中(伯林格·曼海姆). 细胞系保存在补充10%FCS、50μg/ml链霉素和50单位/ml青霉素的DME中。

中心体的制备

用不连续梯度超速离心法从HEK 293和HeLa细胞中分离出中心体Moudjou和Bornens（1998）简而言之，用1μg/ml细胞松弛素D和0.2μM诺卡唑处理指数生长期的细胞1h。细胞通过胰蛋白酶化和离心收集，所得颗粒在TBS中洗涤，然后用0.1×TBS/8%蔗糖洗涤。将细胞重新悬浮在2 ml 0.1×TBS/8%蔗糖中，然后添加8 ml裂解缓冲液（1 mM Hepes，pH 7.2，0.5%NP-40，0.5 mM MgCl2、0.1%β-巯基乙醇、1μg/ml亮氨酸肽、1μg/ml胃蛋白酶抑制素、1μ/ml抑肽酶和1 mM PMSF）。轻轻摇晃悬浮液，并通过10毫升窄口血清学移液管五次，以溶解细胞。裂解液在2500转克持续10分钟，去除肿胀的细胞核、染色质聚集物和未溶解的细胞。通过尼龙膜过滤产生的上清液，然后添加Hepes缓冲液和DNase 1，最终浓度分别为10 mM和1μg/ml，并在冰上培养30分钟。用1 ml 60%蔗糖溶液（10 mM管道，pH 7.2，0.1%Triton X-100，0.1%β-巯基乙醇，含60%[wt/wt]蔗糖）轻轻地垫在混合物下面，并在10000℃下旋转克将中心体沉积在垫层上30分钟。去除上层8 ml上清液，将含有浓缩中心体的剩余上清液（包括缓冲液）轻轻旋涡并加载到不连续的蔗糖梯度上，蔗糖梯度由底部的70%、50%和40%溶液组成，并在120000转杯克在进一步分析之前，收集馏分并将其储存在-70°C下1 h。

SDS-PAGE和蛋白质印迹

将密度梯度组分稀释到1 ml 10 mM管道中，pH值7.2，并在4°C下用微型离心机以14000 rpm的速度沉淀中心体15分钟。将中心体微丸重新悬浮在含有5%β-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液中，并在10%SDS-PAGE凝胶上电泳。在Towbin转移缓冲液（25 mM Tris、192 mM甘氨酸和20%甲醇，pH 8.3）存在下，将蛋白质转移到硝化纤维素膜上。在含有10%脱脂奶粉的TBS-T（Tris-buffered saltime/0.1%吐温-20）中封闭膜1小时，然后在含有所需浓度的初级抗体的新鲜封闭缓冲液中培养。膜在TBS-T中清洗数次，然后用适当的辣根过氧化物酶结合二级抗体孵育。免疫反应蛋白用增强化学发光法显示。

20S蛋白酶体的抑制

内源性蛋白酶体池的蛋白水解活性通过添加强效真菌产物lactacystin而受到抑制。在转染后48–72小时，以10μM的浓度将抑制剂添加到293细胞中。将细胞处理2至12小时，然后立即用PBS冲洗几次，然后进行免疫细胞化学固定。

免疫细胞化学

用于CFTR的免疫荧光亚细胞定位(Lee等人，1997年)用PBS冲洗附在玻璃盖玻片上的瞬时转染细胞三次，然后用1ml冰镇甲醇在-20°C下固定并渗透10min。去除甲醇后，用PBS再次冲洗细胞三次，并在补充有50 mM甘氨酸的1 ml PBS中培养10分钟（此操作和所有后续操作均在室温下进行）。然后移除该缓冲液，并在加湿室中用0.1 ml封闭培养基（补充有5%山羊血清、1%牛血清白蛋白和0.1%明胶的PBS）封闭非特异性部位1小时。封闭后，将培养基替换为0.1 ml封闭培养基，封闭培养基中含有各自一级抗体的1/100稀释液1 h。然后用封闭培养基将细胞清洗三次，并用含有适当荧光标记二级抗体的1:100稀释液的封闭培养基孵育1 h。对于双标记实验，使用针对第二个感兴趣蛋白质的抗体重复这些初级和次级培养。对于涉及荧光标记的小麦胚芽凝集素或伴刀豆球蛋白A的凝集素亲和染色，在初始固定和渗透之前，分别以1/250稀释度和1μg/ml在PBS中添加这些试剂30分钟。使用Bio-Rad MRC 1024共聚焦显微镜获得荧光图像。表达CFTR的细胞的表达水平被分为两类，即需要1150或更高增益才能显现的细胞（低表达者）和需要950或更低增益设置的细胞（高表达者）。在每种情况下，虹膜保持恒定在3.5。CMV驱动的CFTR表达水平可分为低或高。在高表达水平下，一些细胞形成CFTR包涵体，而不经乳胱蛋白酶处理。这在折叠突变体和野生型CFTR中观察到。这可能是由于细胞折叠机械过载，并可能部分解释了培养细胞中野生型CFTR过度表达的成熟效率低（～30%）的原因(沃德和科皮托，1994年). 因此，我们将研究局限于表达低水平CFTR的细胞。

亚细胞形态计量学

由于核周结构形状的周期性不规则，通过免疫染色HEK 293细胞的共焦成像描述其表观直径的形态计量分析仅限于含有对称中心体的细胞。使用制造商提供的软件进行直径测量。每个实验中随机选择三个区域（×400），测量每个区域中所有细胞的直径。对于椭圆形结构，使用直径的几何平均值。报告的数据为平均值±SEM。

可溶性和不溶性细胞组分的分析

2.5 × 105每3厘米培养皿中的HeLa细胞要么进行模拟转染，要么转染P205S突变CFTR表达质粒。转染后48 h，用10μM乳酸菌素处理其中一个细胞12 h。用PBS洗涤细胞，通过胰蛋白酶化收集细胞，并在4°C的微型离心机中造粒。用PBS将每个颗粒洗涤两次，并将其重新悬浮在100μl PBS中，补充完整蛋白酶抑制剂混合物(伯林格·曼海姆). 通过27 gaug的针头进行10–20次传代裂解后，在14000下旋转裂解产物克在4°C下保持1小时。收集上清液，在补充的PBS中清洗颗粒，然后在14000离心克抽吸洗涤液后，将颗粒重新悬浮在100μl补充PBS中30分钟。颗粒和上清液均在-70°C下保存，直至分析。用SDS PAGE通过4–20%凝胶分析等体积的每个颗粒和上清液，然后用Western免疫印迹法对比上述所示抗体。

结果

蛋白酶体机械在中心体的集中

关于蛋白酶体介导的错误折叠的完整膜蛋白降解的一个中心问题是，蛋白水解在细胞中的何处发生。为了解决这个问题，我们使用免疫细胞化学来描述蛋白酶体途径的几个关键成分的亚细胞分布，包括：20S蛋白酶体、PA700和PA28激活物复合物、泛素和Hsp70。

在HEK 293细胞中，针对这些蛋白酶体成分的抗体识别出多个不同的亚细胞池。20S蛋白酶体（图。​（图1，1PA700复合体（图。​（图1，1和泛素（图。​（图11G） 在核池和细胞质池中都可以清楚地识别。相反，PA28相关免疫荧光主要在细胞核中被识别（图。​（图1，1Hsp70主要存在于胞浆中的网状结构中（图。​（图11H） ●●●●。除了这些一般分布外，用这些特异性抗体进行染色还发现存在一个独特的核周位点，所有研究成分都集中在该位点上（图。​（图1，1，A–H）。该结构被内质网管腔伴侣蛋白BiP所包围，但不与之共定位（图。​（图11F） ，靠近高尔基体，如凝集素WGA染色所示（图。​（图1，1、D和E）。在HeLa、COS和CHO细胞中也观察到这些相同的亚细胞分布，表明观察结果的普遍性（数据未显示）。

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中心体蛋白酶体成分的定位。用（A和D）20S蛋白酶体和γ-微管蛋白（A）抗体或荧光标记的WGA（D）抗体对HEK 293细胞进行免疫染色。（B和E）PA700和γ-微管蛋白（B）或荧光标记的WGA（E）。（C和F）PA28和γ-微管蛋白（C）或BiP（F）。（G） 泛素（Ub）和γ-微管蛋白，以及（H）Hsp70和荧光标记的WGA。按照材料和方法所述获得共焦图像。用（I）多克隆鸡抗PA700抗体或（J）多克隆鸡抗PA700，在室温下对纯化牛PA700进行预吸收，对HEK 293细胞进行抗血清染色，以研究抗血清的特异性。在同一天以相同的放大倍数、虹膜设置和增益获得共焦荧光图像。注：为了清楚显示每个面板，蛋白酶体机械、Hsp70和Ub的免疫荧光始终显示为绿色，而γ-微管蛋白、WGA和BiP的反染色始终显示为红色。面板A–H中的箭头表示核周蛋白酶体富集的中心体的位置。比例尺以微米为单位表示尺寸。

利用双标记免疫荧光对这种核周结构的进一步研究表明，20S蛋白酶体、PA700、PA28、泛素和Hsp70与γ-微管蛋白（一种已建立的中心体标记物）精确共定位(Mitchison和Kirschner，1984年;奥克利和奥克利，1989年). 大多数γ-微管蛋白染色仅限于中心体，尽管也观察到与该蛋白的可溶性部分相对应的微弱弥散细胞溶质染色。这些数据表明，中心体是蛋白酶体机制和某些细胞应激伴侣在基础条件下共定位和集中的独特场所，这表明中心体具有新的功能。

这些蛋白酶体抗体对免疫细胞化学的特异性得到了一些对照实验的支持。首先，使用间接免疫荧光和共焦显微镜，用非免疫和免疫前兔血清或仅二级抗体染色，几乎没有检测到信号（数据未显示）。第二，预先吸收纯化抗原的鸡抗PA700抗血清完全消除免疫细胞化学荧光（图。​（图1，1、I和J）。同样，兔抗PA28抗体的类似预吸收和Western blot分析证明了该抗血清的特异性。第三，用抗p31（一种针对PA700单亚单位的兔多克隆抗体）染色，得到的染色模式与用鸡抗PA700复合抗体生成的染色模式没有区别。同样，用PA28α亚基肽的多克隆抗血清进行染色(Song等人，1996年)与整个抗PA28抗体获得的结果相同（数据未显示）。

为了证实我们的免疫细胞化学观察，通过蔗糖梯度超速离心从诺可唑/细胞松弛素D处理的HEK 293和HeLa细胞中纯化中心体，并进行Western blotting（图。​（图2）。2). 对最终纯化步骤的分析显示，第3至6组分中的γ-微管蛋白免疫反应峰值对应于50%至60%的蔗糖密度。与免疫细胞化学数据一致，在含有γ-微管蛋白的组分中观察到20S蛋白酶体、p31（PA700）、PA28和Hsp70，表明它们在缺乏完整细胞骨架的情况下与中心体发生了共纯化。此外，Hsp90还与γ-微管蛋白共纯化。有趣的是，在较轻的梯度组分中也观察到Hsp70、Hsp90和较小程度的PA28，其中检测到微弱的γ-微管蛋白免疫反应。这一观察结果可以用中心体的异质群体或伴侣和PA28相对于20S和PA700的中心体亲和力较低的结合来解释。蔗糖组分缺乏其他亚细胞标记，包括BiP（ER）、醛缩酶（胞浆）、Lamin B1（细胞核）和β-cop（高尔基体），确定中心体制剂的纯度。

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蛋白酶组分和热休克蛋白与γ-微管蛋白在蔗糖梯度上共沉淀。中心体由7×10制成7从不连续蔗糖梯度中收集293个细胞和组分，详见材料和方法。等量的单个组分进行Western blot分析。馏分1-10是自下而上收集的梯度馏分，即70-30%的蔗糖。W表示10μg全细胞裂解物作为每个印迹的对照。BiP、醛缩酶、层粘连蛋白B1β-cop分别是内质网腔、胞浆、细胞核和高尔基体的标记物，仅在全细胞裂解液中检测到，而在中心体部分中未检测到，从而确定了中心体预处理的纯度。每个蛋白质的大小以kD表示。

中心体对蛋白酶体抑制反应的扩增

乳糜蛋白酶体抑制剂lactacystin对细胞的治疗(Fenteany等人，1995年)导致中心体的大小显著增加。用乳酸菌素处理和未处理的细胞的代表性图像进行PA28和凝集素Con A染色（图。​（图3，三、A和B）。20S蛋白酶体、Ub、PA700、Hsp70和γ-微管蛋白染色的细胞也获得了类似的结果。这些结果通过中心体直径的形态计量分析进行量化（通过γ-微管蛋白或核周蛋白酶体成分的荧光染色鉴定）。对经乳胱氨酸处理和未经处理的HEK 293细胞的比较显示，在蛋白酶体抑制的作用下，平均直径增加了两倍（图。​（图3三C） ●●●●。这些数据表明中心体是一种动态结构，能够在蛋白酶体受到抑制时进行扩张。这种膨胀可能是由于错误折叠蛋白质的积累，否则会被集中在中心体的蛋白酶体降解。为了进一步验证这一假设，我们在HEK 293细胞中表达了野生型CFTR和两种已知错误折叠的变体，即ΔF508和P205S，并检查了它们对中心体和蛋白酶体机械的影响。

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中心体因蛋白酶体抑制而膨胀。用PA28抗体（绿色）和荧光标记的Con A（红色）对（A和B）HEK 293细胞进行染色。如材料和方法中所述，用10μM乳胱氨酸处理B细胞。每个面板中的箭头表示代表性中心体的位置。比例尺单位为μm。（C） 形态计量学测量量化并比较经乳糜蛋白酶处理的（+）细胞和对照细胞（−）的表观中心体直径，用抗血清对所示蛋白质染色，表示为9–16次测定的平均±SEM。

突变蛋白表达反应的扩展

与以前的报告一致(Cheng等人，1990年)CFTR在瞬时转染的HEK 293细胞中的免疫定位清楚地将野生型CFTR亚细胞定位与折叠突变体的亚细胞定位区分开来。针对转染细胞质膜上CFTR识别的野生型CFTR的COOH末端的抗血清（图。​（图44A） 在成熟的早期阶段，与ER受体伴侣BiP共定位（图。​（图44B） ●●●●。内质网是初生多面体膜蛋白的初始膜移位和整合位点。与之形成鲜明对比的是，ΔF508和P205S突变型CFTR主要在转染细胞的ER中检测到，如CFTR染色的ER模式所示（图。​（图4，4和BiP染色的完全共定位（图。​（图4，4、D和F）。

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CFTR的免疫荧光细胞内定位。表达所示CFTR构建体的瞬时转染HEK 293细胞用兔多克隆抗CFTR染色，然后用罗丹明标记的山羊抗兔IgG染色，用小鼠单克隆抗BiP染色，然后用荧光素标记的驴抗小鼠IgG染色。A和B、C和D以及E和F是来自相同字段的对。比例尺以微米为单位表示尺寸。

表达低水平野生型CFTR的细胞不会显著干扰PA28的分布或中心体的大小，尽管在高表达细胞中，一部分CFTR在该结构内共定位，如图所示。​图55A.研究的其他蛋白酶体成分也获得了类似的结果（数据未显示）。与此形成鲜明对比的是，P205S的表达（图。​（图55B） 或ΔF508（未显示数据）以类似于仅用乳胱氨酸处理细胞时观察到的方式扩张中心体（图。​（图3）。三). 这一观察进一步支持了错误折叠的蛋白质在中心体部位的积累，即使蛋白酶体具有功能。

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中心体因错误折叠的蛋白质而膨胀。表达野生型或突变型P205S CFTR（如图所示）的瞬时转染HEK 293细胞用CFTR抗体（红色）和PA28（A）或20S蛋白酶体（B）抗体（均为绿色）染色。箭头表示中心体在表达CFTR的细胞中的位置。箭头表示来自相同区域的非表达细胞中的中心体，以进行相对比较。比例尺单位为μm。

蛋白酶体成分向中心体相关包涵体的招募

在过度表达突变型CFTR（P205S）的细胞中，我们观察到错误折叠CFTR的大的核周聚集物的形成，如与γ-微管蛋白共定位所示，这些聚集物似乎来自中心体（图。​（图6）。6). 表达ΔF508的细胞观察到相同的结果（数据未显示）。此外，20S蛋白酶体的细胞溶质池显著而全面的补充（图。​（图77A） 观察到CFTR聚集形成部位有PA700（B）、泛素（D）和Hsp70（E）。这种募集与细胞溶质池的耗竭同时发生，这意味着这是来源。PA28也被募集到内含物中，以响应错误折叠的CFTR的建立（图。​（图77C） ●●●●。图中显示了乳胱氨酸处理细胞中形成的CFTR聚集体的形态分析。​图77F.图中数据的组合。​图3三E描述了相对于未经处理的细胞，仅因蛋白酶体抑制而引起的中心体扩张，以供比较。乳胱氨酸处理细胞中形成的聚集体的直径扩大到其明显来源的中心体大小的四到六倍。

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错误折叠蛋白的细胞内内含物来自中心体。表达中等水平CFTR-ΔF508的细胞用10μM乳酸菌素处理12 h，并用（A和C）兔多克隆抗CFTR染色，然后用荧光素标记的山羊抗兔IgG和（B和D）小鼠单克隆抗γ-微管蛋白染色，最后用罗丹明标记的驴抗鼠IgG染色。A和B、C和D是来自相同字段的对。箭头表示γ-微管蛋白-可见的中心体集中在突变CFTR聚集形成的位点。比例尺以微米为单位表示尺寸。

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蛋白酶体机械用于CFTR聚集体。按照材料和方法中的描述，用10μM的乳酸菌素处理瞬时转染了所示CFTR表达结构的HEK 293细胞。然后用（A）小鼠单克隆抗CFTR（红色）、兔多克隆抗20S蛋白酶体（绿色）、（B）兔多克隆抗体CFTR、鸡多克隆抗体PA700（绿色，和兔多克隆抗泛素（绿色），或（E）兔多克隆抗体CFTR（红色）和小鼠单克隆抗Hsp70（绿色）。每个面板中的箭头表示，由于中心体相关内含物的募集，细胞溶质中的可检测蛋白酶体成分被清除。中心体和CFTR聚集体相对膨胀的形态计量学分析见面板（F）。通过至少八次测量，确定了单独使用乳酸菌素和野生型低表达乳酸菌素ΔF508和P205S CFTR抑制蛋白酶体引起的膨胀。虚线表示未经处理的中心体的相对大小。误差为±SD。比例尺以微米为单位表示尺寸。

接下来，为了进一步研究观察到的蛋白酶体机制和热休克蛋白70的重新分布，以响应乳酸胱氨酸诱导错误折叠的CFTR细胞内内含物的形成，我们将细胞裂解物分离为可溶性和不溶性细胞组分。在模拟转染细胞中，主要在可溶性部分观察到γ-微管蛋白（图。​（图8）。8). 然而，在表达P205S突变型CFTR并用乳酸菌素处理的细胞中，观察到γ-微管蛋白分布在可溶性和不溶性组分之间。PA28、PA700和Hsp70以与γ-微管蛋白平行的方式重新分布（图。​（图8）。8). 经乳酸菌素处理的模拟转染细胞和未经处理的突变转染细胞观察到中等程度的再分配（数据未显示）。

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中心体、Hsp70和蛋白酶体在包裹体形成中的核心分布。2.5 × 105如材料和方法所述，将表达P205S突变CFTR并用10μM乳酸菌素处理12 h的HeLa细胞和未处理的模拟转染对照细胞裂解并分离成上清液（S）和颗粒（P）组分。通过SDS-PAGE分离组分，并通过Western blotting对每个指示抗体进行分析。

讨论

本文报道的工作描述了免疫细胞化学（图。​（图1）1)和生物化学（图。​（图2）2)中心体作为一个独特的亚细胞位置的鉴定，在基础条件下，蛋白酶体蛋白水解途径的成分和某些相关的热休克伴侣浓缩在中心体中。在正常生长条件下，在HEK 293、HeLa、COS和CHO细胞中观察到这种定位。此外，蛋白酶体与中心体的结合并不需要完整的F-actin或微管网络，正如诺可唑/细胞松弛素D处理细胞中纯化的中心体部分所示（图。​（图2），2)这表明它们在这个位置的定位不仅仅是微管末端聚集的结果。然而，这并不排除细胞骨架可能需要用于往返于该位置的贩运。

当错误折叠蛋白的细胞水平较高时，无论是由于错误折叠突变蛋白（如ΔF508或P205S CFTR）的过度表达，还是蛋白酶体的抑制，细胞都会通过将中心体直径扩大两倍来作出反应（图。​（图3三和​和5）。5). 假设是一个球形的三维形状，这意味着其体积将增加四倍以上。在错误折叠底物的高负荷和/或蛋白酶体活性不足的情况下，中心体、Hsp70和蛋白水解机制会相应地重新分布到可沉积部分（图。​（图8）。8). 控制细胞中存在的核周蛋白酶体浓度表明，这种扩张的最简单解释是将错误折叠的蛋白质靶向这个集中的位置，以便快速有效地降解。与此假设一致，中心体相关蛋白酶体机制是活跃的（Fabunmi，R.P.，W.C.Wigley，P.J.Thomas和G.N.DeMartino，未发表的观察结果）。当降解不充分时，错误折叠的蛋白质在该位点及其附近积聚，最终形成一个大的包涵体。鉴于这一发现以及中心体与高尔基体和溶酶体的接近性，在解释过表达蛋白质的亚细胞定位时应谨慎。

特别有趣的是，在错误折叠蛋白的最高负荷下，当蛋白酶体被抑制，突变蛋白过度表达时，细胞通过从细胞溶质池向中心体相关包涵体广泛招募额外的蛋白酶体机制来作出反应（图。​（图7）。7). 中心体在微管成核和组织中的作用(Mitchison和Kirschner，1984年)表明微管马达参与了招募过程。与这一概念相一致的是，蛋白酶体成分的核池保持不变（图。​（图7）。7). 还需要进一步的实验来确定募集是一个活跃的过程还是仅仅由于扩散，尽管后者的可能性不大，因为26S蛋白酶体大小的分子太大，无法通过胞浆扩散(Janson等人，1996年).

针对该场地的基质目标也存在类似问题。在审查这份手稿时，一项有趣的补充性研究报告了中心体CFTR聚集体的形成(Johnston等人，1998年). 聚集物的形成需要一个完整的微管系统，这意味着底物向中心体的运动易位，类似于此处提出的蛋白酶体补充的潜在机制。有趣的是，通过CFTR和蛋白酶体染色观察到的原纤维延伸（图。​（图66A和7），从中心体定域聚集体放射。这些纤维对诺卡唑治疗敏感，提示其来源于微管。然而，诺康唑处理后，在乳酸菌素处理的细胞中，聚集物和相关蛋白酶体成分的中心体定位持续存在。这些结构的组装和可能的拆卸所采用的机制值得进一步研究。无论组装方式如何，很明显，这种结构集中并招募了预期通过监测和控制细胞中新生膜蛋白折叠、降解和聚集之间的平衡来执行审查功能的蛋白质。

了解富含蛋白酶体的中心体的组成和组装将为真核细胞的质量控制机制提供新的见解。例如，目前尚不清楚PA700（游离或与20S蛋白酶体复合）是否直接参与错误折叠CFTR的识别、位置改变或包裹体的形成。然而，游离PA700可能利用其poly-Ub结合域和其他线索来识别蛋白酶体和转运到中心体的底物。随后或巧合的是，ATP依赖性与20S蛋白酶体、PA700介导的Ub异肽酶活性以及其他可能的活性（如活性去折叠）的关联将用于重新检查底物，或许作为降解的替代方法，允许在降解前再次尝试折叠。已知这种迭代步骤发生在Hsp60类伴侣中(Bukau和Horwich，1998年)和蛋白酶的Clp家族(Kessel等人，1996年).

蛋白水解抑制后中心体过度表达的突变CFTR的积累表明，它可能是错误折叠多肽途径的终点，表明它们在该位置聚集或成核。有趣的是，类似的夹杂物(罗素，1890年;瓦莱蒂等人，1991年)以前在热应力下观察到(Vidair等人，1996年)，蛋白酶抑制细胞(Wójcik等人，1996年;Johnston等人，1998年)以及越来越多与蛋白质错误折叠相关的疾病家族，如阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症和1型脊髓小脑共济失调（SCA1）(Bruijn等人，1998年;Cummings等人，1998年;西索迪亚，1998年). 这些包裹体之间的详细结构和功能关系尚不清楚，需要进一步研究。

在本研究所述的基本条件下，蛋白水解机制的中心体定位可能在参与细胞周期进展的蛋白质降解中起重要作用(King等人，1996年). 此外，该位置还将蛋白酶体和伴侣置于细胞器附近，直接参与膜蛋白的生产、成熟和运输，这是涉及突变蛋白识别和处理的机器的战略场所。有趣的是，最近对酵母的研究缺乏当前工作的分辨率，将26S蛋白酶体置于核膜内质网(Enenkel等人，1998年)或者，在裂变酵母中，处于静止状态的核外围和减数分裂期间的核相关点(威尔金森等人，1998年). 虽然根据BiP、WGA和Con A染色，ER通常被认为是质量控制细胞器，但当前的高分辨率研究表明，哺乳动物细胞中的蛋白酶体集中在ER后的一个隔室中，缺乏高尔基体的复杂糖蛋白。对中心体的生物化学功能的分析应该揭示它是否是蛋白酶体介导的错误折叠和突变膜蛋白降解的位点。我们正在积极解决这些问题。

致谢

我们感谢Thomas、DeMartino和Muallem实验室的成员提供的建议和有益的讨论；George Bloom和Elena Kaznacheyeva提供了卓越的技术建议；以及海伦·尹和布鲁斯·霍拉兹多夫斯基，感谢他们的宝贵意见。

这项工作得到了美国心脏协会（9740033N）和美国国家关节炎、糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（NIDDK；DK49835）向P.J.Thomas、NIDDK（DK46181）向G.N.DeMartino、美国国家牙科研究院（NIDR；DE12309）和NIDDK向S.Muallem提供的研究资助。P.J.Thomas是美国心脏协会的资深研究员。

本文中使用的缩写

20秒20S蛋白酶体
cAMP公司腺苷3′，5′-环磷酸
穿越火线囊性纤维化
CFTR公司囊性纤维化跨膜电导调节器
热休克蛋白70/热休克蛋白90热休克蛋白（分别为70和90 kD）
下一个工作日核苷酸结合域
PA700/PA28蛋白酶体激活物复合物（分别为700和180 kD）
PKA公司cAMP依赖性蛋白激酶
SCA1公司1型脊髓小脑共济失调
TMD公司跨膜结构域
Ub（英国）泛素
TBS-T（待定）三缓冲盐水/0.1%吐温-20

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文章来自细胞生物学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社