缺少驱动蛋白II KIF3A亚基的小鼠突变体的原位反转和胚胎睫状体形态发生缺陷

摘要

大量工作已经建立了一个基因控制级联，在哺乳动物的发育中产生左右（L-R）不对称(1). 造成这种控制回路不对称的细胞事件仍然不清楚，尽管有持续的提示和建议表明，早期胚胎细胞上的纤毛活动或纤毛形成可能对确定L-R不对称至关重要(2–4). 特别是，小鼠睫状体形态发生缺陷的一致相关性(2,三)和人类(4)随着L-R的随机不对称性，人们认为早期胚胎纤毛可能在确定最早的胚胎L-R轴中起着重要作用。这些纤毛是否活动一直存在争议(2,5,6)以及它们在建立L-R测定途径中的可能作用。

最近在中的工作衣原体,隐杆线虫病、海胆和小鼠发现了在不同环境下纤毛形成所必需的驱动蛋白II介导的运输途径(2,7–11). 大量生化分析表明，驱动蛋白II通常是由两个不同的运动亚基和一个非运动亚基组成的异源三聚体复合物(12–16). 在莱茵衣原体，一种称为FLA-10的驱动蛋白II亚单位对鞭毛形态发生至关重要。生物化学和形态学研究令人信服地证实，FLA-10驱动蛋白是一种运动蛋白，它能推动鞭毛成分从细胞体内的合成部位运输到生长鞭毛尖端的利用部位(8,11,17–20). 在隐杆线虫病，在进化上分化的不动化学感觉纤毛中发现了一种被称为osm-3的驱动蛋白II相关物，似乎是它们正常功能和形态发生所必需的(10,21). 海胆微注射实验证实，驱动蛋白II是胚胎纤毛形成所必需的(7). 最后，在小鼠中的研究表明，驱动蛋白II是由KIF3蛋白家族的运动蛋白构建的，KIF3家族有三个已知成员，即KIF3A、KIF3B和KIF3C(15,22–24). 有大量证据表明KIF3A和KIF3B或KIF3C之间形成了异二聚体，但KIF3B-KIF3C-之间的同二聚体或异二聚物并不常见(23,24). 最近，据报道，KIF3B缺失突变体在小鼠胚胎最早纤毛（即胚胎结细胞上的纤毛）的形成中存在缺陷(2). 这种睫状体畸形缺陷先于L-R测定途径中的缺陷出现，导致胚胎中的L-R测定结果随机出现。在这里，我们描述了KIF3A突变体的类似表型，它确定了在早期小鼠胚胎的结细胞中，驱动蛋白II的两个主要运动亚单位都是纤毛形成所必需的，并强化了这些早期纤毛在胚胎L-R轴的建立中很重要的情况。

材料和方法

KIF3A缺失动物的产生。

利用第一个350nt的KIF3A编码序列，从129/SV/J基因组文库（Rossant实验室的礼物）中分离并鉴定了外显子1（5′非翻译，编码序列的前5nt）和外显子2（nt6-280）。创建了pflox-KIF3A靶向结构（图。​（图11A类)并通过标准方法导入R1胚胎干（ES）(25)【pflox载体是Jamey Marth的礼物，ES细胞是Andras Nagy的礼物，重组LIF是礼物(26)]. 靶向KIF3A等位基因通过Southern blottingHin公司dII切割ES细胞DNA，用探针探测巴姆HI（高）/生态靶向结构外部的RI基因组DNA片段（图。​（图11A类). 用标准方法去除lox P位点两侧的基因组DNA(25)（pNuKCre是Jamey Marth送的礼物）。Southern印迹法Bgl公司II-cut ES细胞DNA用Nco公司我/生态RI 160碱基对检测了几个克隆的外显子2的缺失。嵌合体动物是通过标准方法产生的(25). 通过使用通用5′引物（P1-AGGGCAGAGAGAGGAGGTGG）和野生型等位基因（P2-TCTGTGAGTGTGACCAGC）或突变等位基因的特异性引物（P3-GGTGGGAGCTGCAAGAGGG）的混合物，利用胚外DNA通过PCR对胚胎进行基因分型。

在单独的窗口中打开

图1

KIF3A突变小鼠的产生和分子分析。(A类)用于产生KIF3A突变体的敲除策略。(我)pflox载体和(ii（ii）)用于构建KIF3A敲除等位基因的基因组DNA区域。PCR引物的位置用箭头表示，南部探针的位置用线条表示。(三)导入ES细胞的KIF3A空突变体靶向结构；外部Southern探针证实了正确的靶向性；(iv（四）)Cre重组酶处理后去除外显子2和可选标记的KIF3A空突变等位基因。(B类)Southern印迹Hin公司dIII消化ES细胞DNA以确认KIF3A等位基因的正确靶向性；野生型等位基因≈10kb，重组等位基因约14kb。(C类)Southern印迹法Bgl公司用Cre重组酶转染Ⅱ型消化ES细胞DNA后证实存在缺失等位基因(D类)使用中描述的引物对9.5天p.c.窝产仔的胚外膜DNA进行PCRA类.

结果和讨论

为了探测脊椎动物中KIF3A的功能，通过去除外显子2在小鼠中产生了一个KIF3A无效突变等位基因（图。​（图1）。1). 当外显子1剪接到外显子3时，生成的KIF3A转录物将被翻译出正常的阅读框架，从而生成一个62氨基酸无义蛋白，该蛋白仅与野生型KIF3A-蛋白具有共同的起始蛋氨酸。将该空突变等位基因导入ES细胞（图。​（图11A类)然后通过胚泡注射ES细胞生成小鼠。Southern印迹和PCR（图。​（图11 B–D类)证实了所构建突变体的分子特性。杂合KIF3A突变体的Northern和Western印迹表明，突变基因中没有片段或异常产物（图。​（图22 A类和B类). 此外，对胚胎提取液的检查显示，突变胚胎中完全没有KIF3A蛋白，而KIF3B和α-微管蛋白水平实际上保持不变（图。​（图22C类).

在单独的窗口中打开

图2

KIF3A无效突变等位基因不产生任何KIF3A-蛋白。(A类)Northern blot表明KIF3A杂合突变动物中不产生截短的KIF3A信息。rRNA（18 s）显示为RNA负载的控制。(B类)免疫印迹显示，缺失等位基因没有产生截短的KIF3A蛋白产物。注意，成人大脑用于A类和B类. (C类)9.5天p.c.胚胎的Western免疫印迹显示KIF3A蛋白缺失，而KIF3B和α-微管蛋白水平有效保持不变。

为了确定KIF3A突变胚胎中最早的缺陷，使用扫描电镜检查7.0-7.5天p.c.胚胎的形态（图。​（图3）。三). 除了在L-R模式中起关键作用的胚胎节外，该年龄段突变胚胎和野生型胚胎的整体形态相似(1). 与以前的报告一致(2,5,6)发现野生型胚胎结节的每个细胞都有一个突出的纤毛。令人惊讶的是，KIF3A突变胚胎的所有淋巴结细胞上都缺少纤毛。突变节点的位置通常正常，但节点板通常比野生型扁平，在许多情况下观察到周围的内胚层细胞过度生长（图。​（图3三C类). 在胚胎第9天之前，纯合子突变胚胎中未观察到其他明显的形态缺陷。

在单独的窗口中打开

图3

KIF3A缺失突变胚胎在节点的细胞上缺少纤毛。(A–C)第≈7.5天胚胎的扫描电子显微镜；箭头标识节点。(D–F型)节点的高倍视图。注意野生型淋巴结中存在纤毛(D类，星号）和KIF3A突变节点完全缺失(电子和F类). （棒材=5μm）

为了测试KIF3A突变体中的L-R基因控制级联是否正常，我们检测了8.0天p.c.KIF3A-突变体胚胎中Pitx2的表达，Pitx2-通常只在左侧板中胚层表达(30–34)（图。​（图44M（M）). 我们发现所有的空胚双侧表达Pitx2（5/5）（图。​（图44 N个和O（运行）). 在下午9天之后，所有的空胚（13/13）和杂合胚子集（4/34）看起来都比它们所有的野生型（13/1三）和大多数杂合胎（30/34）的同卵小一点（图。​（图44 A–C). 所有这些突变胚胎都无法从前凸位置转变为胎儿位置（图。​（图44 我和J型和​和55A类). 突变胚胎尾部被截断（图。​（图44 E、 G、H、，和J–L)并在神经管闭合处出现缺陷（图。​（图44L（左）)，显示肢体原基减少或无肢体原基，臂弓减少；许多患者心包呈球状，伴有水肿（图。​（图44 B、 E类、和K（K）). 对心脏循环的仔细检查显示出三种类型（图。​（图55B类): (我)心脏循环正常的胚胎（图。​（图44 A类和D类); (ii（ii）)心脏循环反转的胚胎（图。​图44 C类和F–H（飞行高度）); 和(三)表现出心脏循环迟缓但正常并伴有心包水肿的胚胎（图。​（图44 B、 E类、和K（K）). 总之，这些表型和异常的Pitx2表达表明，在缺少KIF3A蛋白的情况下，介导L-R不对称的控制系统是有缺陷的。有趣的是，自发的小鼠突变体禁止转弯(35)表现出与KIF3A和KIF3B突变体几乎相同的表型异常，表明在禁止转弯突变体。

在单独的窗口中打开

图4

KIF3A突变胚胎表现出形态和不对称缺陷。蓝色染色A–H用于心室特定的MLC2v消息(29). (A类)正常杂合子9.5天p.c.胚胎显示适当的心脏循环。(B类)一种杂合突变胚胎，表现出心脏循环迟缓。(C类)显示反向心脏循环的空突变胚胎。箭头输入A–C指示心脏循环的方向。(D–F型)心脏特写A–C（LV=左心室；OT=流出道）。(G公司和H（H）)KIF3A缺失突变胚胎心脏循环逆转的左右视图。(我和J型)一个经历正常胚胎翻转的野生型胚胎和一个未经历胚胎翻转的KIF3A缺失胚胎。箭头表示胚胎后部的方向。(K（K）)KIF3A缺失突变胚胎显示心脏周围水肿。蓝色箭头在B类和K（K）指示膜。(L（左）)具有神经管闭合缺陷的KIF3A无效突变胚胎。大箭头指向打开的神经管，小箭头指向关闭的神经管。(M–O） 现场Pitx2的8.0天p.c.胚胎杂交，腹视图。(M（M）)野生型胚胎侧板中胚层Pitx2的正常左侧表达。(N个和O（运行）)Pitx2在KIF3A缺失突变胚胎中的双向表达。箭头指向强烈的侧板中胚层染色。

在单独的窗口中打开

图5

KIF3A无效突变胚胎无法转动，并表现出心脏循环的随机性。(A类)显示每个基因型的胚胎百分比和数量及其从前凸位置转变为胎儿位置的能力的图表。(B类)显示每个基因型显示每个心脏循环表型的胚胎百分比和数量的图表。

我们观察到的KIF3A突变体的表型与最近报道的KIF3B突变体相似(2)并确定在哺乳动物胚胎中构建纤毛需要驱动蛋白II的两个主要运动成分。这些数据也支持这样的观点，即这些早期纤毛在某种程度上对建立早期L-R信号通路的不对称性很重要。除L-R不对称缺陷外，驱动蛋白II小鼠突变体还表现出发育和结构异常，这一事实表明，驱动素II或胚胎结细胞上的纤毛也发挥着不限于L-R不对称决定的功能。在形式上，L-R缺陷也可能在某种程度上与正常前后发育的失败有关(36,37).

有趣的是，KIF3A杂合子缺失胚胎的一个子集表现出相同的形态学异常，但仅在KIF3A-缺失胚胎中观察到反向心脏循环。这一观察结果表明，杂合子胚胎亚群中观察到的形态和结构缺陷可能与胚胎淋巴结纤毛缺陷无关，而可能是由其他对KIF3A蛋白水平降低敏感的细胞缺陷引起的。无论如何，杂合子胚胎中存在缺陷，在存活杂合子动物中观察到轻微的L-R内脏缺陷（数据未显示）提出驱动蛋白II途径突变可能与人类存在的某些内脏缺陷（包括心脏和心血管缺陷）有关的可能性。

最近关于决定L-R不对称性的途径的研究主要集中在基因控制回路中的信号分子和转录因子上(1). 然而，启动该控制电路并建立其不对称特性的最初细胞或发育事件不太容易检查。关于这一初始事件的性质有几个线索。首先，多年来对人类静止性纤毛综合征和卡塔格纳三联征的研究一直与支气管纤毛异常、男性不育和反转位有关(4). 虽然许多病例与动力蛋白臂的丢失有关，但也很明显，该综合征是遗传异质性的，可能涉及许多不同的基因和产物。因此，有人认为早期胚胎中的睫状体活动对L-R模式的形成至关重要(38). 第二，最近对小鼠iv突变基因的分析(39)发现该基因座编码一个动力蛋白分子马达（称为lrd，表示左右动力蛋白）。这些工作人员认为，尽管lrd与轴突或睫状体动力蛋白（与细胞质动力蛋白相反）的同源性最高，但它在淋巴结细胞的细胞质事件中发挥作用，而不是在纤毛中。第三，最近的研究表明，缺乏肝细胞核因子4（一种翼螺旋转录因子）的小鼠突变体缺乏新生动物的所有纤毛，不表达lrd，并且表现出随机的L-R不对称性(三). 第四，以前的工作人员和我们的工作令人信服地证明，在发育的关键决定期，淋巴结细胞上存在纤毛(2,5,6)并确定这些纤毛的丢失与后来L-R轴的随机化相关。这些纤毛是否活动一直存在争议(2,5,6)虽然一个经济的解决方案可能是运动是短暂的，并且在其中一项研究中被忽略了。由于纤毛的运动性被认为对建立不对称的信号分子L-R梯度至关重要，因此需要进一步的工作来证实这些纤毛运动性的报道(2).

我们的数据与之前的数据相结合，指出了节点细胞中早期细胞事件的两个可能模型，这两个模型对于正确确定L-R是必要的。第一个模型提出，支气管和精子中纤毛运动或形态发生所需的动力蛋白和驱动蛋白用于节点细胞细胞质中的其他过程，以产生细胞极性或决定因子的不对称运输。尽管这一模型很有吸引力，但它并不能充分解释与人类倒置位置相关的固定纤毛综合征的异质性以及与纤毛结构缺陷的持续相关性。第二种模型提出，睫状体运动或正常睫状体形态发生是决定或维持这些细胞的极化或信号传导以及启动不对称发育途径的早期关键事件。第二个模型是最简单的，与KIF3A和KIF3B突变体中纤毛形成失败先于观察到的L-R偏侧性缺陷的观察结果一致(2). 从形式上讲，KIF3A和KIF3B突变细胞中的睫状体缺陷可能与导致L-R缺陷的不同过程无关或是次要表现。因此，L-R缺陷可能是由KIF3A和KIF3B在细胞极化中的细胞质功能引起的，这与在小鼠、海胆和衣原体然而，这种形式上的可能性似乎过于复杂。

淋巴结细胞上的纤毛是否需要运动以确定L-R的问题仍然悬而未决，需要确认(2,5,6). 尽管如此，lrd序列与轴突动力蛋白最为相似的发现仍然引人注目(39). 轴突样动力蛋白如何在淋巴结细胞上发现的9+0型纤毛中发挥作用尚不清楚。通常，这种纤毛是不动的，但也有例外报道(40)有报道称，结纤毛实际上是活动的(2,6). 一种简单且最终可测试的可能性是，淋巴结细胞上的睫状体运动是短暂的，需要设置L-R轴。

我们的数据和其他人的数据现在证实，基于驱动蛋白的运输途径需要在衣原体(8,11,17–20)，海胆胚胎上的活动纤毛(7)和感觉纤毛隐杆线虫病(10,21)对哺乳动物来说是保守的，因此可以用于所有类型的纤毛和鞭毛(2). 对这些突变体的进一步研究可能有助于确定初级纤毛在发现它们的许多细胞类型中的作用，并有助于理解毛细胞和光感受器上发现的其他类型进化分化纤毛结构所需的一些运输途径。

致谢

缩写

脚注

工具书类